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によって胚および成体神経幹細胞の拡大 * These authors contributed equally

Neuroscience
 

Summary

体性幹細胞の増殖を制御することは、彼らの研​​究と治療における使用を妨げる大きな要因となっている。ここでは、一時的にマウス脳で生成されたニューロンの数を増やすために使用することができます開発と成人期における神経幹細胞の膨張を制御するためのシステムを説明します。

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Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection. J. Vis. Exp. (68), e4093, doi:10.3791/4093 (2012).

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Abstract

体性幹細胞は、成人期1中に胚発生と組織の恒常性の間に組織形成のための基本となる追加の幹細胞(拡大)以上分化した細胞型(分化)を生成するために分割することができます。現在、多大な努力が、これは再生医療のための新規な1,2戦略を開発するための基本であると考えられているので、差別化への拡張から体性幹細胞のスイッチを制御することに向けて投資されている。しかし、体性幹細胞の研究と利用における主要な課題は、その膨張は制御が非常に困難であることが証明されていることです。

ここでは、神経幹細胞/前駆細胞(完全NSCとも呼ばれる)cdk4/cyclinD1複合体の発現を操作することにより、マウス胚性皮質、大人の海馬の拡大、G1期の主要な調節因子の制御を可能にするシステムを説明細胞周期や体性幹細胞のdifferentiation 3,4。具体的には、2つの異なるアプローチがcdk4/cyclinD1複合体は、in vivoで NSCで過剰発現していることで説明されています。最初のアプローチでは、細胞周期調節因子の過剰発現は、マウス終脳の内腔にcdk4/cyclinD1をコードするプラスミドのエピソーム発現の引き金となって、このようにして、横方向の皮質のNSCに配信するために子宮内エレクトロポレーション続いて注入することによって得られる導入遺伝子は5-8。二番目のアプローチでは、高度に濃縮HIV由来のウイルスが定位9感染細胞のゲノム内にウイルスコンストラクトの統合後の細胞周期調節因子の恒常的発現の引き金となって、このように、成体マウスの海馬の歯状回に注入される。その基本原理は既に他のビデオ·プロトコル10月14日によって記述された両方のアプローチは、ここで私に最適化された)、iiを組織損傷を減らす)は、非常に特定の脳レジオのターゲット広い部分NS、iii)は、各地域内で操作された細胞の高い数値を得ること、およびiv)は、各細胞内での導入遺伝子の高発現レベルをトリガします。二つのアプローチを用いて導入遺伝子の一過性過剰発現は、Cre発現NSCはそれぞれ9,15、loxP部位が隣接cdk4/cyclinD1を運ぶウイルスに感染における細胞分裂またはタモキシフェン投与に起因するエレクトロプラスミドの自然な希釈によって、すなわち様々な手段によって得られる。

これらのメソッドは、急性および組織特異的マウス脳内の任意の遺伝子の発現を操作するための非常に強力なプラットフォームを提供します。特に、cdk4/cyclinD1複合体の発現を操作することによって、我々のシステムは、最終的には哺乳類の脳で生成されたニューロンの数を増加させる、このように、原子力安全委員会の拡大と分化へのスイッチの時間的に制御することができます。我々のアプローチは、基礎研究のために決定的に重要であると治療のために体性幹細胞を用いてもよい哺乳類の中枢神経系Iのより良い理解を)提供している間は、体幹を使って)成人期、III期)の開発、大戦中に優れた認知機能における成体のニューロン新生の役割、そしておそらく、ⅳ)組織の恒常性を組織形成への細胞の寄与を食い止める神経変性疾患のモデル内のセル。

Protocol

予備的ノート

手術は動物福祉のために地元当局から承認を受けて、完全に訓練された調査員が行う必要があります。すべての予防措置は、深い麻酔、術後鎮痛の投与と、10分以上持続する操作のため、角膜の脱水および失明を防ぐために、目の潤滑剤の適用を含めて動物に与えた痛みやストレスを最小限にするために注意しなければなりません。麻酔したマウスを37℃常に保温されている必要があり℃で完全回復し、すべての手術器具、溶液は無菌でなければならないまで。生物学的なフードの使用は厳密には必要ではありませんが、オペレータは、白衣、マスク、手袋を着用して、動作中の動物に感染する可能性を最小限に抑えるために、あらゆる適切な手段を講じる必要があります。同様に、ウイルスの生成および使用に関するすべてのステップは、承認されなければならず、地方自治体の条例に従って、S2領域で実行する必要があります。最後に、ウイルスと接触していた可能性のあるすべてのツールや面の徹底的な除染が承認された施設の消毒の慣行(HIVのための70%のEt-OH及び/又はオートクレーブで拭いて)に従って実施されなければならない。

パート1:胚NSCの拡張

(1) 子宮内エレクトロポレーション

  1. クローニング後PCMS-EGFP(Clontech社製)またはpDSV-mRFPnlsベクトル16で導入遺伝子( すなわち cdk4/cyclinD1)は、3-5μg/μLの濃度に滅菌PBSに再懸濁しEndoFreeキットを使用してプラスミドを精製する。すぐに手術する前に、CAの最終比でPBS中の0.05%FastGreenとプラスミドを混ぜる。 4時04分01秒、すべての沈殿物を除去するために16000×gで2分間混合物を遠心分離する。
  2. 以前に引っ張らホウケイ酸ガラスキャピラリーにDNA混合物をロードします。 P-97ピペットプラーを使って引っ張るパラメータは次のとおりです。プル:200; VEL:140;時間:140。熱はランプ試験によって与えられるとスペックに依存します毛細血管のIFIC多く使用されている。 子宮内エレクトロポレーション·プラットフォーム( 図1A) 近いPicoPumpのノズルにキャピラリーをマウントし、実体顕微鏡下で、その先端と変曲点でのニックネームに曲げる。
  3. 乾燥したガラスビーズ滅菌器内のすべての手術ツールを殺菌し、深くイソフルラン気化器を使用して妊娠の日12月15日に妊娠マウスを麻酔。 37℃に設定した加熱·プラットフォーム上で仰臥位の動物を配置し、ノーズコーンを介して定イソフルラン管理下に保つ。
  4. 、腹部の皮膚を剃る最終的に70%エタノールで拭く間に、Betaisodona複数回に消毒し、先制鎮痛剤として0.1 mg / kgの濃度で皮下(PBSで希釈)ブプレノルフィンを注入します。腹膜腔にアクセスするために、微細なハサミを使用して皮膚の2cm縦カットをすると、その後、下にある筋肉の壁。腹腔カリフォルニア州免ずる。 2IUE液(D-PBSをペニシリン/ストレプトマイシンの100 U / mlを含む)のmlは37℃温め℃、加熱ブロックで解決策を保つ。
  5. 子宮が削除される割れ目を含む滅菌DRAPでマウスをカバーしています。タングステンリトラクタを使って切開を撤回し、子宮を識別し、隣接した胚の間に鉗子( 図1B;左)とそれを保持し、それを引き出し、最終的に無菌DRAP上に横たわっていました。全体の動作時には、臓器や体腔に潤いを与えると動物の脱水を防ぐために、IUE液で子宮をすすいでください。
  6. 子宮は慎重に親指と人差し指の間にそれを保持するハンドルとヘッドが見えると演算子を志向されるまで、1つの胚を回します。終脳半球を識別し、背側面からそれらのいずれかを注入します。心室がFastGreen(;右図1B)によって概説されるまでPicoPumpのフットスイッチを使用してDNA溶液の1〜2μlを放します。
  7. 図1C)、運営正方形状の電界を発生させるエレクトロポレーターを使用して、各パルスの間に950ミリ秒間隔で50ミリ秒間30Vの6パルスを供給フットスイッチを介して。これは出血とダメージ胚を引き起こす可能性があるため、電極が胎盤に近い配置することは避けてください。
  8. すべての胚を注入し、エレクトロポレーションされた場合、腹腔内に戻って子宮を配置し、3〜4日毎mmを縫合縫合文字列を使用して筋肉の壁を閉じます。ノットは、組織の少し腫れを許すことができないくらい硬くなった筋肉にぴったりではなく、されるべきである。最後に、金属製のクリップを使用して覆っている皮膚を閉じます。 Betaisodonaで皮膚を消毒し、イソフルランマスクからマウスを削除して、完全に目を覚まし住宅ケージに移す。運動行動が正常になるまで、マウスの回復を監視します。

2。 SAMの処理PLE

  1. 一日以上のエレクトロポレーションした後、マウスを犠牲に胚を収集し、正しく蛍光実体顕微鏡( 図1D)を使用して、エレクトロポレーション、それらを識別します。氷冷PBSで脳を解剖すると、4%PFA(リン酸緩衝液(pH7.4)でホルムアルデヒド)で一晩固定します。結局、BrdUは細胞周期動態および細胞増殖3を調査するために異なるパラダイムによると犠牲の前に投与することができる。
  2. 脳はその後である官能標的NSC上導入遺伝子およびその子孫の影響を評価するために、基礎前駆細胞およびニューロン(PAX6、ネスチン、Tbr2、Tbr1、Tuj1など)、放射状グリアのいくつかのマーカーのための切片と免疫染色のために処理される同時エレクトロレポーター遺伝子の発現により同定した。

図1
図1。子宮内エレクトロポレーション·プラットフォームの子宮内エレクトロポレーションで。()模式図。 (B)は、手術時に妊娠したマウスの位置(右)とマウス胚(左)の終脳半球におけるDNA / FastGreen混合物(青)の注入を示す図面。 (C)はSchemeは注射部位(青色)に隣接する正極(+)と子宮の壁と接触する電極の配置を示す。矢印は陽極に向かってDNAの移動を示しています。胎生13日目のGFPプラスミドをエレクトロポレーション後のマウス胚24時間(D)の写真。破線は終脳半球境界が設定されます。 Calegari から変更、2004 17のスキーム。

パート2:アダルトNSCの拡張

1。 HIV由来ウイルス粒子の産生

  1. 1日目:10 cmのプレート5×10 6個の 293T細胞D-MEMで熱不活性化ウシ胎児血清10%及びペニシリン/ストレプトマイシン(培地)の100 U / mlを含む8mlのと皿。 37℃で一晩1ウイルス調製および培養のための15皿℃、5%CO 2を使用します。
  2. 2日目:すべての料理のために、私のエンコード3プラスミドのそれぞれのプレーンのD-MEM5μgを1 mlに希釈)VSVG(水疱性口内炎ウイルスタイプG)エンベロープタンパク質、ⅱ)ギャグ/ POL(群特異抗原/ポリメラーゼ)と、iii)ポリシストロンは以前、HIVベースのトランスファーベクター(p6NST90)9にクローニングされた機能およびレポーター遺伝子( すなわち cdk4/cyclinD1/GFP)を発現する構築。 D-MEMで1 mg / mlの原液でPBSにあらかじめ溶解し、室温で15〜30分間インキュベートされたポリエチレンイミンの45μlを含む1mlのこの溶液を混ぜて。一方、細胞から培地を除去し、熱不活性化ウシ胎児血清の15%、ペニシリン/ストレプトマイシンの100 U / mlを含む新鮮なD-MEMの皿あたり4 mlを加える。 2メートルを追加トランスフェクション混合物と文化を一晩のl。
  3. 3日目:導入遺伝子の発現を増強する皿当たりのNa-ブチレート500mMの120μlを添加し、培地5mlでトランスフェクション培地を交換した後、6〜8時間穏やかに、文化混ぜる。
  4. 4日目:上清を(約70ミリリットルの合計)を収集し、2ポリアロマーの遠心チューブ(35×89ミリメートル)で0.22μmのフィルターおよび転送を通過します。 °Cのスイングローターを用いて4℃で90分間、110,000 xgで遠心機。上清を捨て、各チューブにPBSの6ミリリットルを加え、1時間氷上でインキュベートする。ペレットを再懸濁し、1ポリアロマー遠心チューブ(14×95 mm)で、それを転送します。 °Cのスイングローターを用いて4℃で90分間、110,000 xgで遠心機。上清を捨て、PBS50μlにペレットを再懸濁し、-80℃で5μlを、店舗を作る℃にウイルス力価は10 8〜10 9 cfu / mlの範囲であろう。 ( 注:ウイルスは温度と貯蔵、AVOに非常に敏感であるIDの再凍結は、輸送中にドライアイス上に保持し、使用する前にすぐに解凍します。)

2。定位注入

  1. イソフルランで6-10週齢のマウスを麻酔し、適切に頭部を固定する耳バーや口蓋のサポートを使用して定位フレーム( 図2A)に腹臥位に動物を配置します。動物は37℃と一定イソフルラン政権下で設定した加熱パッドの上に保温されています。
  2. 、皮下に先制鎮痛剤としてブプレノルフィンワーキング溶液100μlを注入し、マウスの頭の上に皮膚のストライプを剃る、1.4で説明したようにdesinfect。メスを使用して、CAを作る。矢状縫合のレベルで頭蓋骨を露出頭皮に1.5 cmの長い縦切開。皮膚を撤回し、優しく滅菌綿棒で骨表面を清掃してください。
  3. パラフィン油でガラスキャピラリー(1.2仕様)ハーフ記入して挿入噴射ポンプにマウントセカンドリング( 図2B)まで毛細血管。キャピラリーの先端はブレグマ、矢状縫合と横方向( 図2C)間の連動ポイント(実体顕微鏡の助けを借りて決定される)に配置されるまでのx、y、z軸でキャピラリーホルダーを移動し、再集合x、y、zの値を0に設定します。
  4. 前後軸(y)に±メディオ - 横軸の1.6ミリメートル(x)および-1.9 mmのキャピラリーを移動して、外科的マーカーペンを用いて骨をマーク。 CAの穴をあけます。脳に損傷を与えないように注意を払って電動穴あけ機を使用して頭蓋骨に直径0.5mm。
  5. 耳バー上に配置パラフィルムの一部にウイルス懸濁液5μlの液滴(1アリコート)を入れて、液滴中の毛細血管の先端を飛び込む。 caを吸う。ナノリットル注入器を用いてウイルス懸濁液3.5μlを55 NL /秒で設定します。液滴が蒸発するにつれて急速にこのステップを実行します。
  6. キャピラリはサイトoに移動F注射と先端が軟膜表面に触れるまでそれを下に移動。 0に背腹軸の値(Z)をリセットします。この時点で、-1.9ミリメートルのためのキャピラリーを用いて組織を貫通し、4 NL /秒の速度でウイルス懸濁液の1.5μlを離します。ウイルス懸濁液トラフキャピラリートラックの逆流を最小限に抑えるし、毛細血管を後退させるために2〜3分待ってください。二回目の注射はcontrolateral半球で行うことができます。
  7. 、皮膚を縫合消毒、および子宮内エレクトロポレーション(1.8)のために、前述したように、動物が麻酔から回復することができます。

図2
図2。定位ウイルス注射。(AB)の回路図定位注射()を実行するために必要なコンポーネントの表現とCAの挿入を示す分解しキャピラリーホルダーセカンドリング(B)までpillary。 (C)は、皮膚と耳のバーや口蓋のサポートにより固定化マウスヘッドの写真は頭蓋骨(左)を公開するためにカットします。点線(右)の倍率は、横方向と矢状縫合を示しブレグマ、及び注射部位(丸)。

3。サンプルの処理

  1. ワン·トゥ·3週間、感染後、CAを使用してマウスを灌流する。 4%の100ミリリットルPFAは、脳を解剖し、4%PFAで一晩後固定してください。結局、BrdUと/またはタモキシフェンは、それぞれ9、細胞周期動態を調査し、loxP部位が隣接ウイルス導入遺伝子の発現を停止するために異なるパラダイムによると犠牲の前に投与することができる。
  2. 脳は、その後、幹細胞や前駆細胞と神経細胞( 例えば、レトロウイルスベクター、GFAP、ネスチン、Tbr2、doublecortinなど)のいくつかのマーカーを用いた免疫染色のために処理することができます。

Representative Results

  1. 全体的には、 子宮内エレクトロポレーション横皮質( 図3A)の広域におけるレポーター遺伝子の強力な発現を示すエレクトロ胚の60〜80%が得られます。蛍光タンパク質は簡単に1週間以上持続する信号とできるだけ早く手術後3-6時間全体としてマウント胚で検出することができる。対象地域内では、細胞の約30〜50%は、通常の細胞の割合は、通常90%以上である2つ(またはそれ以上)の同時エレクトロ導入遺伝子( 図3B、)6,8を共発現と遺伝子(複数可)を表現する、15。アポトーシス(約2.0から2.5パーセント)の最小レベルはエレクトロから約2時間後に観察することもできますが、この値は(FC、未発表データ)、約6時間後に生理的レベル(約0.5から1.0パーセント)に戻ります。手術のために死ぬか、妊娠中のマウス胚の割合は、(<5%)は、典型的には、ごくわずかです。 4続いて、これらの条件下でcdk4/cyclinD1とのコ·エレクトロ開発の8時間は、30%(右図3B、およびC)15による神経前駆細胞の拡大の増加をトリガーします。

図3
図3。 cdk4/cyclinD1過剰発現による神経前駆細胞の拡大。胎生13日目のGFPとRFPプラスミドを用いた24時間後にエレクトロポレーションしたマウス胚の左右大脳皮質を通る断面の()蛍光画像。 (B)は基底前駆細胞マーカーTbr2用cdk4/GFPとcyclinD1/RFPプラスミドおよび免疫標識との共エレクトロポレーション後の48時間のように、蛍光写真。 DAPI counterstainig(左)とTbr2(右)と蛍光レポーターが示されている。と脳室下帯の境界(SVZ、黄色の破線);行は脳室帯(白線VZ)の頂端面を示している。増加THIに注意してください。増加した世代とcdk4/cyclinD1の過剰発現後の基底前駆細胞の膨張に伴う皮質のエレクトロポレーションした部分(白い矢印)でSVZのckness。 (C)効果の定量化は、B.バーに示さ= SD、P <0.05、n = 3とする。 C言語でのバーグラフがランゲ 、2009年15から取得されます。

  1. ウイルス定位注入後、約。操作したマウスの80%が全体の歯状回を通しての導入遺伝子の強い発現を示す。 GFPの構成的発現を簡単に4日手術後できるだけ40μmの切片上で検出することができます。歯状回の吻側ツー尾軸に沿って、細胞の約10-30%は(CAの合計に相当する。10,000-30,000細胞)通常導入遺伝子(群)( 4A)9 発現している 。手術による瀕死マウスの割合はごくわずかである(<5%)。これらの条件下でcdk4/cyclinD1の3週間の過剰発現は、2オーバーでNSCの増加をトリガ70%( 4C)9によって神経新生を減少させながら襞( 図4B)。

図4
図4。ウイルス感染の影響。海馬の吻側から尾軸に沿って厚さ40μmのシリアル冠状切片(1毎に6を収集)から採取した7蛍光写真(A)の3次元再構成。 GFP +感染細胞(緑)と歯状回のDAPI核染色(青色)(上部)が示されている。 (中央)に示されたものに対応する冠状断面の明視野画像と緑の擬似カラーで強調海馬(アレン脳アトラスから変更;と全体の大脳半球の3D表現(下) www.brain-map.org ) 。白い矢印は、注射部位を指す。横(L)は、吻側(R)、およびDORSAL(D)の軸(x、y、およびz定位座標)(右)が表示されます。ネスチン+ NSC(B)とDCX + GFPの集団内新生ニューロン(C)+ 3週間GFP(白)またはcdk4/cyclinD1/GFP(黒)ウイルスの定位注入後の感染細胞(BC)の割合。バー= SD、P <0.005; n = 3とする。 BとCのグラフはArtegiani 、2011年から撮影。

Discussion

電界の配信中にその方向性のある移動は、その電荷に依存するので、子宮内エレクトロポレーションの重要なステップは、DNAの品質と純度です。そのようなエンドトキシンなどの追加荷電分子の除去が含まれていないDNA精製のためのプロトコルは、貧しい人々の配達につながる天然DNAの負電荷のマスキングにつながる可能性があります。明らかに、エレクトロポレーション効率を向上させる対象とすることにできるだけ近い領域に電極を持つ子宮の壁に触れる。同様に重要なのは、これが最適な電界の送達のための基本であるので使用される電極の品質です。眼および/またはこのような血清などの痕跡、脂質、などの有機残基であっても目に見えないミクロの傷は、必然的にその特性を失う電極につながる時間をかけて蓄積されます。オールドおよび/または汚れelectropesエレクトロポレーション効率の急激な低下の原因として最も可能性が高いであり、したがって、Rでなければなりません早くこれが注目されているとしてeplaced。 子宮内エレクトロポレーションは、比較的簡単ですが、典型的には良好に再現性のある結果を達成するために2〜3週間の訓練を必要とします。それは、発生中の胚のあらゆる臓器や組織に、事実上、適用することができますので、この手法は非常に汎用性があります。確かに、脳のような空洞を含有する臓器が標的としたDNAの比較的大きな体積を注入のしやすさのためにトランスフェクションした細胞の割合が高い可能にするために、特に簡単です。

定位ウイルス注入を設定する際に発生する一般的な問題は、いくつかの感染細胞を持っているおよび/または望ましくない領域を標的とすることである。最初の問題は、主に低力価のウイルスの注入と相関している。文化の通路番号の小さい293T細胞が速く成長し、より高いウイルス価につながる。 CAより古い細胞を用いた。 20継代することはお勧めできませんし、トランスフェクションの手段は80%未満で効率が良いことは保証されませんウイルス産生。ウイルスペレットの再懸濁も重要であり、ウイルス懸濁液は、毛細血管が回避されなければならない閉塞性が均質とウイルス塊を表示しています。ウイルスは温度が下がると長期記憶に非常に敏感です。この理由から、アリコートは永久に-80℃で保存することにし、再凍結することはできませんする必要があります。でも、これらの条件下では、感染性の低下は、ストレージの6-12ヶ月後に観察することができた。学習段階では、各ウイルス製剤のウイルス力価をテストし、長期保管後に再びそれを行うことをお勧めします。脳の望ましくない地​​域で感染した細胞の存在は、いくつかの練習を必要と定位フレーム、上に、マウスの頭の次善のポジショニングに依存することができます。それ以外の場合は、軟膜表面上で正しく0にリセットすることはできませんので、また、不正確な注射で、その結果、頭蓋骨に穴を開いている間に脳の表面を傷つけないように非常に重要です。座標我々は、このプロトコルで指定したC57/BL6 6から10週齢の雌と呼ばれ、我々はさまざまなひずみ/年齢/性別のためにそれらを最適化することをお勧めします。この技術の買収は、ウイルスを準備したサンプルを分析するために必要な長い段階に起因する子宮内エレクトロポレーション比べてより多くの時間を必要とするかもしれません。私たちは強く信頼性と再現性となっているウイルスはマウスだけの手術と定位注射後に使用されることをお勧めします。これを達成するための最初のステップは、安楽死させたマウスではそのようなヘキスト33342などの細胞透過性DNA色素を、注入し、直ちに脳を分析することです。

子宮内エレクトロポレーションおよび定位ウイルス注射急性には、2つの強力なシステムであり、組織特異的に哺乳類の発生と成人期CNS内の遺伝子発現を操作します。細胞の亜集団だけを標的にその制限にもかかわらず、これらのシステムは、前例のない速度を提供し、より多くの従来の方法に比べて、使いやすさは、iトランスジェニックマウスのn特定の手間と時間がかかる世代。しかし、この類似性にもかかわらず、いくつかの相違点は、言及しておくべき二つの手法の間に存在する。最初に、異なる種類の細胞のターゲティングに関しては、 子宮内エレクトロポレーションこれら DNAが注入され、心室の境界を定める唯一の細胞であるため、最初に適切な幹細胞(また、放射状グリア細胞と呼ばれる)のトランスフェクションにつながる。細胞分裂の結果として、プラスミドはその後、それらの前駆細胞および/または時間の関数としての皮質を通してトランスフェクトされた細胞の再分配につながる神経細胞の娘細胞にターゲットを絞った、母幹細胞から継承されます。これとは対照的に、成体脳におけるHIVレンチの使用は幹細胞、前駆細胞、神経細胞、ならびに成熟グリア細胞を含む任意の細胞型の同時感染につながる。注目すべきは、より一般的に使用されるレトロウイルスとは対照的に、HIVのレンチを使用することに関しては事実であるそのレンチ統合は、このように大人、静止幹細胞の標的ともできるように、独立して細胞の分裂状態から生じるであろう。

第二に、エレクトロポレーション、ウイルス感染の間にもう一つの重要な違いは、後者によって達成感染細胞のゲノム中のDNAの不可逆的な統合とは対照的に、一過性、エピソーム式は前者によって達成されることである。連続した細胞分裂、エレクトロプラスミドの希釈、および異所性サイクリンD1タンパク質の分解の結果として、各細胞周期に続くだろう。この効果は数ヶ月(未発表データ)持続することが判明した成体脳におけるつつ、胚の発生過程で、NSCの拡張は約2日15のための唯一の最後に示された。

ⅰ)cdk4/cyclinD1開発中に)コミット神経前駆細胞をより長いG1およびIIを持つ細胞に強力な効果を持っているので、第三に、より長い細胞周期を持っている反対は成人期に当てはまる一方、幹細胞よりも、我々の2つの操作は、成人期の発達と幹細胞の間に神経前駆細胞の膨張を、主に、作動させることが判明した。いずれの場合においても神経細胞の増加は、両方の方法によって達成された。

第四に、ウイルス注射だけで簡単に定位座標を変更することによって、成人の脳の多くの異なった地域で、高い信頼性と再現性、実行することができます。これとは対照的に、 子宮内エレクトロポレーションによるそのような中で 、脳幹、海馬、または脊髄などの中枢神経系の特定の領域、の正確なターゲティングは、再現性を達成するのは難しくなります。定位注入は、あらゆる年齢のマウスで行うことができますがさらに、 子宮内エレクトロポレーションの最適なパフォーマンスはE11からE16に約に制限されています。 E11の前の段階のいずれかの超音波後方散乱顕微鏡18,19または全胚カルトの使用を必要とするでしょうUREシステム17,20。

彼らの研究と操作は、新規な細胞ベースの再生治療の開発に向け基本であると考えられているので、最近では、体性幹細胞の基本的な細胞生物学への関心の高まりが進められている。 cdk4/cyclinD1の過剰発現のための具体的には、我々のプロトコルは一時凌ぎに成体脳で生成されたニューロンの数を増加させるために、 生体内での NSCの拡張( 図3B、Cと4BとC)を増加させるための手段を提供します。我々は、これらの操作は、より良い脳の発達、進化とホメオスタシスならびに認知機能や神経変性または損傷からの回復へ​​の貢献にNSCの役割を理解するために、異なるコンテキストの数に重要であるかもしれないと信じています。

Disclosures

BAとFCはcdk4/cyclinD1ウイルス(EP 10160288.6)による成体体性幹細胞の条件展開を記述する特許出願を提出した。

Acknowledgments

この作品は、再生治療、ドレスデン工科医科学部とDFG共同研究センターSFB655(サブプロジェクトA20)のセンターによってサポートされていました。 BAはDIGS-BBのプログラム、ドレ​​スデンの交わりによってサポートされていました。我々は博士に感謝します。紀子大隅匡野村、ディーターChichungリー、および子宮内エレクトロポレーションおよび定位ウイルス注射の設定はアップ時の貴重なアドバイスのためにラヴィJagasia。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endofree maxi plasmid kit Qiagen 12362
FastGreen Sigma F7258
P-97 Flaming/Brown pipette puller Sutter Instruments
Borosilicate capillaries with filament Sutter Instruments BF120-69-10
Table top laboratory animal anesthesia system VetEquip 901806
Isofluran Baxter HDG9623
Germinator 500 glass bead sterilizer SouthPointe Surgical GRM5-1460
Iris forceps WPI 15917
Betaisodona solution Mundipharma 1931491
Pico Pump WPI PV820
ECM 830 square wave electroporator Harvard Apparatus 450052
Round tweezer electrodes NEPAGENE CUY650P1
Suture material Ethicon V493H
Reflex clip applier for wound closure WPI 500345
Temgesic injection solution Essex Pharma AG
DMEM w/Glutamax-I Invitrogen 31966021
Fetal Bovin Serum Invitrogen 1027016
Penicillin/Streptomicin Gibco 15140
Tissue culture dish Falcon 353003
Polyethylenimine 250 ml Sigma-Aldrich 40872-7
n-Butyric acid, sodium salt Sigma B 5887
Tube, thinwall, polyallomer Beckman 326823 / 331374
Model 900 small animal stereotaxic instrument Kopf Instruments
OPMI pico microscope Zeiss
SYS-Micro4 controller and Nanoliter2000 injector WPI B203MC4
Glass replacement 3.5 nanoliter WPI 4878
SR drill general application Foredam K2272
Antibody Supplier Catalog # Dilution
Doublecortin Santacruz SC8066 1:100
GFAP Chemicon MAB3404 1:500
Nestin BD Biosciences 556309 1:1000
S100β Abcam Ab868 1:1000
Sox2 Millipore AB-5603 1:500
Tbr2 Abcam Ab23345 1:400
Table of antibodies

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References

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