Microfluidic उपकरणों की सस्ती निर्माण के लिए गैर प्लाज्मा PDMS के संबंध

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हम इस वीडियो में प्रदर्शन कैसे प्लाज्मा संबंध के बिना न्यूरॉन microfluidic डिवाइस का उपयोग करने के लिए.

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Harris, J., Lee, H., Vahidi, B., Tu, C., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (9), e410, doi:10.3791/410 (2007).

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Abstract

इस वीडियो में, हम प्रदर्शन कैसे प्लाज्मा संबंध के बिना न्यूरॉन microfluidic डिवाइस का उपयोग करने के लिए. कुछ मामलों में यह Corning नंबर 1 कवर गिलास reversibly बंधन उपकरणों के लिए वांछनीय हो सकता है. इस वजह से हो सकता है, शायद एक प्लाज्मा क्लीनर उपलब्ध नहीं किया जा रहा है,. अन्य उदाहरणों में, यह वांछनीय हो सकता है कांच से माइक्रोस्कोपी या immunostaining के लिए कुछ प्रकार के लिए न्यूरॉन्स के संवर्धन के बाद डिवाइस को हटाने के लिए, हो सकता है हालांकि यह आवश्यक नहीं है immunostaining के बाद से न्यूरॉन्स डिवाइस में दाग जा सकता है के लिए डिवाइस हटाने. कुछ शोधकर्ताओं, तथापि, अभी भी डिवाइस को दूर करना पसंद करते हैं. इस मामले में, डिवाइस के पलटवाँ कवर कांच संबंध है कि संभव बनाता है. वहाँ उपकरणों है कि एक सील के रूप में नहीं तंग बनाई है की गैर प्लाज्मा संबंध में कुछ नुकसान कर रहे हैं. कुछ मामलों में axons grooves के तहत बजाय उन के माध्यम से बढ़ सकता है. इसके अलावा, क्योंकि ग्लास और PDMS hydrophobic रहे हैं, तरल पदार्थ आसानी से समय पर यह आवश्यक बनाने के लिए डिवाइस में मीडिया और अन्य अभिकर्मकों बल डिवाइस में प्रवेश नहीं करते. तरल पदार्थ डिवाइस केशिका क्रिया के माध्यम से दर्ज करें, लेकिन यह काफी लंबे समय के रूप में लेता है उपकरणों है कि प्लाज्मा बंधुआ किया गया है की तुलना में. प्लाज्मा क्लीनर कांच और डिवाइस पर अस्थायी हाइड्रोफिलिक आरोप है कि डिवाइस के माध्यम से सेकंड के भीतर संबंधों के बाद तरल पदार्थ के प्रवाह को सुविधाजनक बनाने के बनाता है. गैर प्लाज्मा बाध्य उपकरणों के लिए उपकरणों के माध्यम से तरल प्रवाह में कई मिनट लगते हैं. यह भी महत्वपूर्ण है ध्यान दें करने के लिए कि उपकरणों के गैर - प्लाज्मा के साथ इस्तेमाल किया जा करने के लिए पहली बार निष्फल हो, जबकि प्लाज्मा इलाज उपकरणों से पहले निष्फल हो उपयोग करने के लिए की जरूरत नहीं है की जरूरत है क्योंकि प्लाज्मा क्लीनर उन्हें बाँझ जाएगा संबंध है.

Protocol

न्यूरॉन सेल संस्कृति के लिए microfluidic उपकरणों की तैयारी

1) साफ़ Corning नंबर 1 24 मिमी 40 मिमी गिलास स्लाइड एक्स

  • 30 मिनट के लिए एक पानी स्नान sonicator में कांच स्लाइड Sonicate
  • 70% EtOH के साथ कांच स्लाइड्स कुल्ला
  • धो DH 2 हे के साथ तीन बार स्लाइड
  • कई घंटे के लिए एक टिशू कल्चर डाकू, अधिमानतः रातोंरात में सूखी स्लाइड्स

नोट: हम विशेष धातु ट्रे कि हम स्लाइड के साथ लोड किया है. स्लाइड्स व्यक्तिगत रूप से अलग हो रहे हैं और इस धातु रैक में स्लॉट में रखा. हम तो एक गिलास पकवान में इन धातु लोड हो रहा है ट्रे जगह कर सकते हैं हैं कि हम पानी के स्नान sonicator में पानी की जगह है, के साथ भरने, और 30 मिनट के लिए sonicate. बाद washes के इस डिश में किया जाता है.

2) PDMS उपकरणों की तैयारी

  • सिलिकॉन वफ़र से PDMS मोल्ड बाहर कट, PDSM कलाकारों और यह तिमाही में पंच छेद
  • पहले उन्हें भर अक्रिय गैस (आर्गन या नाइट्रोजन) उड़ाने द्वारा PDMS उपकरणों साफ़. फिर 3M स्कॉच ब्रांड 471 टेप का उपयोग करने के लिए बंद किसी भी शेष मलबे लिफ्ट

नोट: यह महत्वपूर्ण है रखने के लिए उपकरणों का सामना है. प्रारंभ में, जब हम PDMS सिलिकॉन वफ़र से दूर कटौती, वफ़र के साथ संपर्क में पक्ष स्वच्छ पक्ष: यह microfluidic चैनलों शामिल है. हम के रूप में के रूप में हम नुकसान के रूप में कर सकते हैं करने के लिए नहीं डिवाइस और साफ ओर चेहरे रखने जब तक हम प्लाज्मा संबंधों के लिए तैयार कर रहे हैं सावधान रहना करने की कोशिश.

  • प्लास्टिक के कंटेनर में आटोक्लेव उपकरणों
  • Autoclaving, स्वच्छ नंबर 1 Corning है गिलास स्लाइड और प्लाज्मा का इलाज Harrick ब्रांड प्लाज्मा क्लीनर, का उपयोग उपकरणों के बाद www.harrickplasma.com
  • प्लेस उपकरणों पक्ष गिलास स्लाइड पर नीचे साफ.

डिवाइस अब गिलास स्लाइड के लिए बंधुआ प्लाज्मा है.

तीन कोटिंग) एल Lysine पोलीफोनिक (पीएलएल के साथ डिवाइसेज)

  • PLL डिवाइस के प्रत्येक पक्ष पर एक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ा जाता है और अगले अच्छी तरह से में के माध्यम से प्रवाह करने की अनुमति

=> PLL के बड़े छोटे कुओं के लिए कुओं और 30 μ एल PLL के लिए 150 μl . यह के रूप में लंबे समय के रूप में कुओं को पूरा कर रहे हैं के लिए सटीक होना नहीं है.

नोट: यदि आप एक डिवाइस पर देखो तुम 4 कुओं देखेंगे: प्रत्येक के दो जुड़े हुए हैं. आप में एक PLL अच्छी तरह से इतना है कि यह डिवाइस के माध्यम से अच्छी तरह से अगले में बहेगा डाल करना चाहते हैं.

  • के बारे में 10 मिनट के लिए PLL डिवाइस के माध्यम से प्रवाह के लिए और फिर कुओं को अधिक PLL जोड़ने के लिए उन्हें भरने की अनुमति दें
  • 37 ° C पर 4 घंटे की एक न्यूनतम के लिए एक मशीन में PLL युक्त उपकरणों प्लेस (रातोंरात बेहतर है)
  • इलाज के बाद अतिरिक्त वैक्यूम PLL, लेकिन डिवाइस के सभी तरल बाहर चूसना नहीं करने के लिए सावधान रहना

नोट: आप चैनल या कक्ष के लिए हवाई बुलबुले को लागू नहीं करना चाहती. बस बाहर कुओं में अतिरिक्त PLL निर्वात.

  • डिवाइस के दोनों ओर प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए autoclaved DH 2 हे जोड़ें, और केशिका कार्रवाई द्वारा दूसरे को अच्छी तरह करने के लिए प्रवाह की अनुमति

चित्रा 1 एक microfluidic डिवाइस का एक चित्र है. सूचना कैसे ब्लू (सोमा पक्ष) जुड़ा हुआ है और लाल (axonal पक्ष) जुड़े हुए हैं. जब हम कहते हैं अच्छी तरह से एक पर डिवाइस के प्रत्येक पक्ष पर PLL, या पानी या मीडिया, डाल, हम क्या मतलब है, उदाहरण के लिए, है: वैसे तो एक ब्लू जगह autoclaved DH के 150 μl में 150 उल autoclaved DH 2 हे के प्लेस एक खैर लाल में 0 2. पानी (या PLL, या मीडिया, या कक्ष) डिवाइस के माध्यम से अन्य संगत अच्छी तरह से प्रवाह होगा.

चित्रा 1

चित्रा 1

नोट: कृपया ध्यान दें कि अब से, "जगह मीडिया, कोशिकाओं, टॉप कुओं में पानी या PLL" जब मैं कहता हूँ मैं जहां सोमा बाईं तरफ होगा ऊपर आरेख और axons बात कर रहा हूँ बढ़ेगा सही है.

  • पानी (फिर से सावधान किया जा रहा डिवाइस से सभी तरल नहीं करने के लिए पूरी तरह हटायें) Aspirate, तो एक अच्छी तरह से जुड़ा प्रत्येक के autoclaved DH 2 हे की एक और 150 μl जोड़ने और यह माध्यम से इसी प्रवाह के लिए अच्छी तरह से अनुमति देते हैं.
  • एक मशीन में 37 DH 2 हे युक्त युक्ति प्लेस ° सी 1 घंटे के लिए तो धो कदम फिर से दोहराने. उपकरणों के एक घंटे प्रत्येक, जो कुल के लिए तीन बार धो DH 2 हे के साथ.

नोट: संभावना है कि PLL से borate PDMS में अवशोषित, Jeon लैब में कुछ मैं के एक जोड़े के बाद रातोंरात उपकरणों के साथ autoclaved DH 2 हे incubating सिफारिश कर सकते हैं करने के लिए कारणnitial जल्दी rinses. इससे यह सुनिश्चित होगा कि सभी मुक्त borate PDMS के बाहर नमकीन पानी कक्षों की लोडिंग के लिए पहले होगा. अगर ऐसा नहीं किया है, वहाँ मीडिया में borate की एक समय पर, रिलीज जो cytotoxicity करने के लिए नेतृत्व सकता है हो सकता है.

  • शीर्ष कुओं के लिए आवश्यक कारकों (glutamax, B27, PenStrep) के साथ तंत्रिका बेसल मीडिया (NBM) जोड़ें

नोट: उपकरणों incubated रातोंरात और कोशिकाओं को अगले दिन के साथ चढ़ाया जा सकता है, या NMB + कारकों के साथ कोशिकाओं चढ़ाना से पहले 3 घंटे की एक न्यूनतम incubated.

लोड हो रहा है के लिए उपकरणों में न्यूरॉन्स की तैयारी

हम 18 दिन पुराने भ्रूण चूहा प्रांतस्था कि हम या तो एक मस्तिष्क बिट्स या कि यहाँ परिसर में हमारे लिए तैयार है नामक कंपनी से खरीदने का उपयोग करें. हम करने के लिए ऊतक ताजा पसंद करते हैं.

  1. 1 भ्रूण के मस्तिष्क प्रांतस्था (ऊतक के 2 टुकड़े) सीतनिद्रा में होना ई में संग्रहित प्राप्त
  2. 3 लंबे गिलास pipettes ले लो और उन्हें क्रमिक छोटे आकार में प्रत्येक आग एक शराब दीपक का उपयोग
  3. एक गिलास और एक बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब में 2 NMB + कारक की मिलीलीटर में पिपेट जगह के साथ सीतनिद्रा में होना ई से ऊतकों को हटा दें.
  4. Trituration: एक बल्ब और कांच पिपेट का उपयोग प्रांतस्था पारित हो जाता है और नीचे के बारे में 5 से 10 गुना है. फिर, अगले छोटे विंदुक विंदुक ऊपर और नीचे ऊतक करने के लिए प्रयोग किया जाता है. अंत में, छोटी विंदुक विंदुक ऊपर और नीचे ऊतक करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हमें यकीन है कि वहाँ नहीं दिखाई हिस्सा हैं करने के लिए पसंद है.

    नोट: हाल ही में, Jeon लैब ऊतक कोशिकाओं से सीतनिद्रा में होना ई में कोशिकाओं है कि शुरू में 50% में 0.125% trypsin साथ इलाज ऊतक से तैयार किए गए संग्रहीत की तुलना शुरू Ca + + मुक्त और मिलीग्राम + मुक्त विच्छेदन बफर +. आम सहमति है कि ऊतक trypsin उपज सीतनिद्रा में होना ई. में शुरू में रखा यदि आप ऊतक अभी प्रयोग नहीं जा रहे हैं ऊतक से अधिक व्यवहार्य कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए तैयार है, तो आप सीतनिद्रा में होना ई. में ऊतकों की दुकान करने की आवश्यकता है

    यदि आप करने के लिए ऊतक सही दूर का उपयोग करें जा रहे हैं और वृद्धि हुई व्यवहार्यता की तरह होगा, तो trypsin साथ ऊतक यांत्रिक trituration से पहले इलाज के रूप में निम्नलिखित: 1) Ca + + मुक्त मिलीग्राम + + मुक्त 1 मिलीलीटर के साथ एक मिलीलीटर 0.25% trypsin (Gibco, Invitrogen) पतला विच्छेदन बफर (अंतिम = 0.125% trypsin), एक 15 मिलीलीटर ट्यूब (बर्फ का ठंडा रखने) में 2) जगह बफर में ऊतक और 37 पर तुरंत सेल्सियस सेते 8 मिनट के लिए, 3) 10 मिलीलीटर DMEM/10% FBS जोड़ने के लिए बंद trypsin प्रतिक्रिया और प्रोटोकॉल नीचे जारी रखने के.

  5. 1 मिनट के लिए 1100 rpm पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं
  6. सेल गोली बंद ध्यान से aspirated मीडिया
  7. गोली और फिर से इसे निलंबित pipetting द्वारा NMB + कारकों में से 1 मिलीग्राम और जोड़ें नीचे
  8. गुरुत्वाकर्षण प्रवाह से किसी भी clumps को हटाने के फिल्टर (बी.डी. फाल्कन सेल झरनी 40 उम नायलॉन) के माध्यम से फिर से निलंबित कर दिया कोशिकाओं दर्रा
  9. गणना और थाली की कोशिकाओं:
    • एक microfuge ट्यूब में 60 μl NMB जोड़ + कारकों, सेल निलंबन के 20 μl, और trypan नीले रंग के 20 μl तो मिश्रण
    • इस समाधान के 10 μl के बारे में एक hemocytometer जोड़ें और जीवित कोशिकाओं (नीला) नहीं गिनती
    • 2.5 एकाग्रता समायोजित - 4.5 x10 6 कोशिकाओं / एमएल

      नोट: हम आमतौर पर के बारे में 2.5 की एकाग्रता प्राप्त - 4.5 x 106 कोशिकाओं / एमएल . मात्रा पर निर्भर करता है कोशिकाओं (सामान्य 1 मिलीलीटर NBM + B27/Glutamax/PenStrep percortex) resuspended हैं. यदि ऊतक trypsin के साथ तैयार किया गया था, उपज की संभावना बढ़ जाएगा.

डिवाइसेज चढ़ाना

  1. एक अच्छी तरह से में डिवाइस की कोशिकाओं (प्राथमिक न्यूरॉन्स) लोड
  2. प्लेट छोटे डिवाइस 5 प्रति μl और बड़ी प्रति युक्ति 20 μl

    नोट: आप डिवाइस के शीर्ष और डिवाइस के नीचे आधा (कुल मात्रा) पर 10 μl पर कोशिकाओं के 10 μl लोड कर सकते हैं, या सीधे शीर्ष somal अच्छी तरह से में सभी कक्षों की 20 μl (शीर्ष अच्छी तरह से somal में 5 μl छोटे उपकरणों के लिए).

  3. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 10 मिनट के लिए सेते हैं तो कोशिकाओं को देते हैं शुरू कर सकते हैं
  4. प्रत्येक डिवाइस के आकार पर निर्भर करता है NMB + कारकों में से लगभग 150/30 μl जोड़ें

    नोट: खंड PDMS की मोटाई के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. सब मायने रखता है कि कुओं को पूरा कर रहे हैं.

प्लाज्मा संबंध के बिना उपकरणों का प्रयोग करने में पूरक

प्लाज्मा के इलाज के बिना, क्रिस्टीना तू, एक तकनीशियन, जो इसे सफलतापूर्वक हर हफ्ते प्लाज्मा के बिना कोशिकाओं के लिए सिर्फ सही दूर लोड कहते हैं.

सोम तरफ दोनों कुओं (अक्षतंतु ओर अगर आप में मीडिया छोड़ बात नहीं होगी) से मीडिया को दूर करने के लिए याद रखें. यह द्रव का प्रवाह है कि कोशिकाओं मुख्य चैनल में प्रवेश करने की अनुमति देता है है. यदि आप कुओं में मीडिया है, तो आप द्रव का प्रवाह नहीं मिलेगा.

Discussion

यहाँ हम का प्रदर्शन कैसे एक प्लाज्मा क्लीनर की जरूरत के बिना न्यूरॉन microfluidic डिवाइस का उपयोग करने के लिए. हम इस गैर - प्लाज्मा के रूप में संबंधों को देखें.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PDMS Reagent Dow Corning Sylgard 184 with curing agent Please consult Dow Corning to find a vendor near you
Cornig No. 1 Cover Glass Cover Glass Corning Corning No. X2935 244 Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D
B27 Reagent Invitrogen 17504-044 B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax Reagent Invitrogen 35050-061 Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.
60 mm Petri Dish Tool Fisher Scientific 08-757-13A 60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass.
Poly-L-Lysine Reagent Sigma-Aldrich P-1274
BD Falcon 50 ml Tube Tool BD Biosciences Falcon No. 352098 Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A
BD Falcon 15 ml tube Tool BD Biosciences Falcon No. 352097 Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C

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References

  1. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, (4), 2128-2136 (2006).
  2. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, (8), 599-605 (2005).

Comments

14 Comments

  1. can't view videos?? firefox latest plugins???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 4, 2007 - 10:33 PM
  2. Hi Ron. I am sorry you are having trouble. To view videos, please make sure that you have the latest version of Flash installed. If you still have problems, please send us an email to support@jove.com with operating system and browser information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 5, 2007 - 12:48 AM
  3. What protocol do you use when making the PLL solution? 5mg of PLL to 50ml water?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 7, 2008 - 2:47 PM
  4. Hi Lee T
    We dissolve the PLL in borate buffer
    1.²4 g of boric acid and 1.9 g of sodium tetraborate is added to 300 ml of nanopure water (final volume will be 400 ml) and stirred to disolve for about 30 minutes.  Next the pH is adjusted to pH 8.5.  ²00 mg of PLL is added and stirred until disolved.  The final volume is adjusted to 400 ml.  The PLL solution is then sterile filtered and aliquoted into sterile 50 ml tubes in a tissure cutlure hood.  Aliquots are stored at -²0C until use.
    Joseph Harris

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 7, 2008 - 5:57 PM
  5. Just wanted to let everyone know a company is forming to make, sell, and distribute the devices. Email xonamicrofluidics@gmail.com for more information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 4, 2008 - 1:01 PM
  6. Hi there, it it possible to get a protocol for fixation and staining of neurons in microfluidic chambers? Which method is better for this purpose (fixation and staining), plasma- or non-plasma bonding? Is it possible to remove the microfluidic device without damaging the neurons or dŒs it have to stay on during the procedure? By the way: A really impressive method, fantastic! Looking forward to your answer. Best, Harry

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 6, 2008 - 2:32 PM
  7. Hello Harry Probably the best thing would be for you to check out our company website at http://xonamicrofluidics.com/ We have a protocol there available for download.  It gŒs over staining in the device. Also, if you would like to discuss staining in more detail or have any other questions feel free to email us xonamicrofluidics@gmail.com

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 4:46 AM
  8. Hi Harry just to follow up.. The device dŒs not have to be removed for staining. However, if you are interested in visualizing in the mid-region of the grooves then it might not stain very well with the device on.  If you only want to visualize neurons in the main channels or axons just entering or leaving the grooves then staining with the device on is just fine. If you want to get a good stain of the middle of the microgroove region then it is best to remove the device before staining.  This means non-plasma bonding will have to be done as plasma bonding is irreversible. Yes, removing the device can and dŒs damage the neurons.  However, done with care and after some practice it is possible to remove the device and keep most of the sample intact. Some researchers like to fix the cells in the device, place the device on ice for 5 minutes then carefully remove it.  Others just remove the device as carefully as possible prior to staining. Please visit our website http://xonamicrofluidics.com/ for our detailed protocol. Also feel free to email us xonamicrofluidics@gmail.com

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 4:55 AM
  9. Hello JŒ, thank you very much for your reply and support. The protocol on http://xonamicrofluidics.com/ which you are refering to is indeed very detailed and helpful. I am now curious to see how my experiments work out. :-) All the best and thanks again, Harry

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 11, 2008 - 5:59 PM
  10. This probably dŒsn't work for non-plasma PDMS-PDMS bonding... or, is there a way to treat one of the PDMS layers as glass?

    Reply
    Posted by: Bryn G.
    September 23, 2009 - 8:05 PM
  11. Hello,

    This was a very good video indeed. Could you please let me know how did you make the wells on the PDMS. They are not micronsized wells that we used to make by replicating form a potolithographed Silicon wafer. Did you use some kind of belt puncher? What is the exact product number and brand of the puncher? I use one to make mm sized well on the PDMS slam, however the edges are not good. Or did you use other technique to make such nicely sheped wells? If I want to make recangular or square shaped wells (² mm length/width and .5-1.0 mm height) on PDMS what could I do? I will appreciate your kind advices.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 31, 2012 - 6:39 PM
  12. Hello Taifur

    The wells are 8 mm in diameter. We have special punches machined to punch the wells. However, you can use 8 mm biopsy punches made by Sklar. VWR or Fisher Sci should have them.

    Reply
    Posted by: Joseph H.
    April 6, 2012 - 12:48 PM
  13. For the cells you receive in Hibernate E from Brain Bits, do you digest them with trypsin or even digest them at all prior to trituration. Why or why not?

    Thanks.

    Reply
    Posted by: Angela D.
    July 4, 2012 - 10:08 PM
  14. For the cells you receive in Hibernate E from Brain Bits, do you digest them with trypsin or even digest them at all prior to trituration. Why or why not?

    Thanks.

    Reply
    Posted by: Angela D.
    July 4, 2012 - 10:10 PM

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