עיבוד של רקמת גידול במוח העיקרית למבחנים בתאי גזע וזרימת מיון

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

זיהוי של תאי מוח סרטני ייזום (BTICs), תאים הנדירים בטווח של תכונות הטרוגניות גידול בעלי תאי גזע, מספק תובנה חדשות על היווצרות גידול במוח האנושית. יש לנו מעודנים תנאי התרבות ספציפיים להעשרה לBTICs, ואנו משתמשים באופן שגרתי cytometry זרימה להעשיר אוכלוסיות אלה עוד יותר. מבחנים עצמי חידוש וניתוח תמליל של התא הבודד RT-PCR לאחר מכן ניתן לבצע בתאים מבודדים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Venugopal, C., McFarlane, N. M., Nolte, S., Manoranjan, B., Singh, S. K. Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting. J. Vis. Exp. (67), e4111, doi:10.3791/4111 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

גידולים במוח בדרך כלל מורכבים של תאים מורפולוגית מגוונים שמבטאים מגוון של סמני שושלת עצביות. רק חלק קטן יחסית של תאים בגידול עם מאפיינים של תאי גזע, תאים המכונים מוח סרטני ייזום (BTICs), להחזיק יכולת להבחין לאורך שושלות מרובות, עצמי לחדש, ליזום וגידולים בגוף חי. אנחנו מוחלים תנאי התרבות שמשו במקור לתאים נורמלים עצביים גזע (NSCs) למגוון רחב של גידולים במוח אדם ומצאו ששיטת התרבות זו בוחרת במיוחד עבור אוכלוסיות גזע דמויים. מדיום סרום ללא (המל"ל) מאפשר לתחזוקה של מדינת תאי גזע מובחנת, והתוספת של bFGF וEGF מאפשרת ריבוי, חידוש עצמי רבת ​​עצמה, וtumorspheres להרחבה.

כדי להמשיך לאפיין אוכלוסיית BTIC של כל גידול, אנו מעריכים סמנים בתא שטח על ידי cytometry זרימה. אנו עשויים גם למיין אוכלוסיות של עניין לcharacteriz ספציפי יותרation. מבחנים עצמי חידוש מבוצעים על BTICs הבודד ממוינת ל96 גם צלחות; ° C היווצרות tumorspheres לאחר דגירה ב 37 מעידה על קיומו של גזע או תאי אב. מספרים סלולריים מרובים של אוכלוסייה מסוימת גם ניתן למיין בבארות שונות להגבלת ניתוח דילול, כדי לנתח את יכולת התחדשות עצמית. אנחנו יכולים גם ללמוד ביטוי גני ההפרש בתוך אוכלוסיית תאים מסוימות על ידי שימוש בתא בודד RT-PCR.

הפרוטוקולים הבאים מתארים את התהליכים שלנו לניתוק וculturing של דגימות אנושיות ראשוניות להעשרה לאוכלוסיות BTIC, כמו גם הניתוק של tumorspheres. כמו כן, נכללו פרוטוקולים להכתמה לניתוח תזרים cytometry או מיון, מבחני התחדשות עצמית, ותא בודד RT-PCR.

Introduction

גידולים במוח הם בין סוגי הסרטן האגרסיביים והטרוגנית ביותר הידועים בבני אדם. למרות הגילוי והאבחון המוקדם שלהם כבר בנחייתם של הטכנולוגיה המודרנית נוירו הדמיה, אנחנו עדיין חסרים טיפולים מרפאים עבור גידולים במוח רבים, במיוחד עבור אלה מפוזרים, חודרניים או אלה נמצאים עמוקים במוח.

גידולים במוח מייצגים את הגורם המוביל לתמותה מהסרטן בילדים, בשל האופי האגרסיבי מאוד ולעתים בלתי ניתן לריפוי שלהם. גליובלסטומה (GBM), גידול במוח הראשוני הנפוץ ביותר אצל מבוגרים, היא אחד מסוגי הסרטן האגרסיבי ביותר, האדם חרד לסיכויי ההחלמה אחידה הקטלניים 1. גידול זה ממאיר ביותר astrocytic (WHO כיתת 4) מתרחש בדרך כלל באונות המוח של מבוגרים, ויכול להתרחש גם בילדים קטנים ותינוקות. הצמיחה שלו היא מהירה וinfiltrative, ותכונות פתולוגיים כוללות אבחון pleomorphism גרעיני, התפשטות כלי דם, ונימק 2,3. לadults עם GBM שאובחן רק לאחרונה, חציון הישרדות נדירה חורגת 12 חודשים 1, עם תגובות בדרך כלל עניות לכל השיטות הטיפוליות. אנו לציין כי קיימים דמיון רב תפקודי וגנטי משותפים לתאי גזע הסומטיים ותאי סרטן, ושהמסלולים המולקולריים המווסתים את התפתחות מוח נורמלית לעתים קרובות dysregulated בסרטן. ביישום פרדיגמות ביולוגיה של תאי גזע למחקר של גידולים במוח, היינו החוקרים הראשונים ולהבא כדי לזהות ולטהר את תת אוכלוסיות של תאים מGBMs אדם שהציג את המאפיינים של תאי הגזע של התפשטות, התחדשות עצמית, ובידול במבחנה 4 וב vivo 5. אנחנו מוחלים תנאי תרבות ומבחנים ששמשו במקור כדי לאפיין תאי גזע עצביים נורמלים (NSCs) במבחנת 6,7 לגידולי מוח בילדים ומבוגרים רבים, והעשרנו לתאי גזע דמויי תאים אלה על ידי מיון לסמן תא שטח המוליד העצבי CD133 8 ,9. CD133 + שבריר הגידול במוח הכיל תאים שהיו בתדירות גבוהה הרבה יותר מאשר גידול של חניכת CD133-השבריר ב5,10 מוח העכבר NOD-SCID. זה הוקם באופן רשמי כי רק קבוצה נדירה של תאים סרטניים במוח בעלי תכונות של תאי גזע הוא גידול ייזום-, זיכה אותם בשם "גידול במוח ייזום תאים" או "BTICs". זיהוי הרומן של BTICs מספק תובנה חדשות tumorigenesis המוח האנושי, נותן תמיכה חזקה להשערת סרטן תאי גזע 10-13 כבסיס לגידולים מוצקים רבים, וקובע יעד סלולרי חדשני לטיפול בסרטן יעיל יותר 14-20. טיפולים המתמקדים בלהרוג את חלק הארי של הגידול עלול להחמיץ את החלק היחסי הנדיר כמו גזע, המאפשר גידול להמשיך לגדול. טיפולים המתמקדים בהריגת תאי גזע הסרטן עשוי לספק טיפול ופרוגנוזה טובים יותר עבור חולים עם גידולים במוח.

כדי ללמוד אוכלוסיות BTIC, יש לנו מעודן cultuפרוטוקולים מחדש במיוחד כדי לבחור עבור אוכלוסיות תאים בתוך גידולים במוח אדם שיש להם תכונות של תאי גזע. תא סרום חופשי, גזע עצבי (המל"ל) בינונית מאפשר לשמירה על מדינת תאי גזע מובחנת, ותוספת של גורם בסיסי גדילה (bFGF), גורם גדילה באפידרמיס (EGF), וגורם המעכב לוקמיה (LIF) מאפשרים ההפצה, חידוש עצמי רבת ​​עצמה, וtumorspheres אדם להרחבה. כאן, אנו מתארים את השיטות המעורבות בעיבוד של גידולים במוח העיקריים וculturing במדיום המל"ל להעשרה לאוכלוסיות BTIC. אנחנו קראנו מערכת המודל הניסיונית שלנו "מבודדת מטופל BTIC" כדי להדגיש את העובדה שהתאים אלה בתרבית רק מינימאלי תחת גזע תנאי תא כדי לבחור עבור אוכלוסיות תאי גזע. immunolabelling העוקב של אוכלוסיות BTIC לסמני תאי גזע מפתח כגון CD133 וCD15 וניתוח cytometry זרימה הוא גם תארו. אז אנחנו דנים בניתוח הדילול המגביל,אשר מסייע בלימוד פוטנציאל התחדשות העצמית של BTICs. לבסוף, אנו לחקור את ניתוח ביטוי הגנים של תאים הנדירים אלה על ידי מיון תאים בודדים על גבי שקופיות AmpliGrid וביצוע תא בודד RT-PCR. טכניקות אלו חלות גם על גידולי מוח אחרים כגון מדולובלסטומה, ependymoma וגליומות ילדים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבות של רקמות סרטן המוח

  1. הוסף Liberase 200 μl מופשר (רוש מדע יישומים) עד 15 מ"ל של CSF המלאכותי (aCSF-ראה טבלה 1) ומקום ל37 ° C אמבט מים. Liberase TM הוא תערובת של אנזימי מפרקי חלבונים המשמשים ללנתק דגימות רקמות עיקריות, כמו גם tumorspheres תרבית. שלא כמו טריפסין-EDTA, שיטת Liberase משמרת CD133 אנטיגן פני השטח. לדגימת רקמות של כ -0.5 סנטימטר 3, אנו משתמשים 200 μl של Liberase. אם הרקמה היא קטנה יותר, אנו משתמשים 100 ul.
  2. תביא פתרון אמוניום כלוריד (טכנולוגיות תאי גזע) לטמפרטורת חדר. פתרון אמוניום כלוריד עדינות lyses תאי דם אדומים עם השפעה מינימאלית על תאים אחרים. הוא אינו מכיל חומר מייצב.
  3. בארון בטיחות ביולוגי סטרילי, להוסיף 5 מ"ל של aCSF למכל דגימה, מערבולת לשטוף רקמות, ולאחר מכן את פיפטה. שלב זה עוזר להסרת תאי דם אדומים (RBC).
  4. העברת רקמת גידול במוח למ"מ עקרה פטרי די 100sh.
  5. בעזרת מספריים עדינים או אזמלים ומלקחיים, disaggregate רקמות לעקביות slurry.
  6. איסוף מדגם באמצעות פיפטה רגילה 10 מ"ל או מלקחיים ושברי העברה לתוך הצינור המכיל aCSF מראש התחמם עם Liberase.
  7. מקום בחממה, שייקר (30 סל"ד) ולהגדיר עד 37 מעלות צלזיוס, במשך 15 דקות.
  8. סנן lysate הרקמה דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור פלקון 50 מ"ל.
  9. ספין למטה XG התסנין על 280 למשך 5 דקות.
  10. הסרת supernatant זהירות ולהעריך גודל וצבע של גלולת כתוצאה תא: כדורים שהם ורודים או אדומים מציינים מספר רב של תאי דם אדומים.
  11. Resuspend גלולה במיליליטר PBS 1.
  12. הוסף כמות מתאימה של תמיסת אמוניום כלוריד (4-12 מ"ל) בהתבסס על גודל כדורי אדום וזיהום תא (פתרון אמוניום כלוריד הוא מאוד עדין וכמויות גדולות אינן מזיקות לתאים אחרים מאשר תאים אדומים).
  13. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
  14. תאי ספיןלמטה ב280 XG למשך 5 דקות.
  15. לשטוף פעם אחת עם 10 מ"ל של PBS סטרילית.
  16. Resuspend במדיום 5 מ"ל המל"ל מלא (טבלה 2) והעברה לצלחת נמוכה במיוחד מחייבת 60 מ"מ רקמת תרבות (Corning). אנו משתמשים בצלחות תרבות מחייבות נמוכות במיוחד עם משטחים הידרוג מלוכדים קוולנטית שהידרופילי וטעונים ניטראלי, כדי למזער את התמיינות תאים מצורף בתיווך.

לימים הראשונים בתרבות, לא לשנות את התקשורת: למעלה למעלה רק עם 1-2 מיליליטר תקשורת כנדרשת ולהמשיך לקיים תקשורת תרבות ושינוי כאשר הצבע של התקשורת הופך מעט צהוב.

2. Tumorsphere דיסוציאציה לזרימת cytometry

  1. להעריך tumorspheres תחת מיקרוסקופ: אם גודל הכדור הוא> 100 מיקרומטר, דיסוציאציה מומלצת כתחומים גדולים עלולים להפוך נימקים במרכז.
  2. העברת התרבות לצינור 15 מיליליטר חרוטים.
  3. הוסף 2-3 המ"ל סטרילי PBS לשטוף צלחת ביסודיות ולהוסיף לצינור חרוטים.
  4. צנטריפוגה ב XG 280 במשך 5 דקות.
  5. הסרת supernatant ו resuspend ב1-2 המ"ל סטרילי PBS.
  6. הוסף 10 Liberase μl.
  7. דגירה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. הסר מבחינה חזותית ולהעריך השעיה, אם גושים מרובים ראו, triturate עדינות באמצעות קצה פיפטה 1000 μl.
  8. אם clumping נמשך, המשך דגירה של 1-2 דקות נוספות.
  9. לשטוף את התאים על ידי הוספת 5 המ"ל סטרילי PBS וצנטריפוגה ב XG 280 במשך 5 דקות.
  10. הסרת supernatant ו resuspend ב500-1,000 μl סטרילי PBS 2 mM EDTA.
  11. הערך את מספר תא וכדאיות באמצעות trypan כחול.
  12. התאם ספירת תאים ל1 מ"ל מ'/ ב PBS 2 mM EDTA.

3. כתמים לפני שטח

  1. העברת 100 μl של השעית תא 6 / מ"ל 1x10 לבדיקה לצינורות זרימת מ"מ 12x75.
  2. הוסף כמות מתאימה של נוגדנים. פקדי אלוטיפ המתאימים יש להשתמש עבור כלנוגדן (ראה טבלה 3).
  3. דגירה במשך 30 דקות על קרח.
  4. הוסף 2 המ"ל PBS 2 mM EDTA לכל צינור זרימה.
  5. צנטריפוגה XG ב 200 במשך 4 דקות, למזוג וכתם.
  6. Resuspend גלול ב 300 PBS 2 mM EDTA μl.
  7. הוסף צבע הכדאיות 7AAD μl 10 לכל צינור ודגירה במשך לפחות 15 דקות על קרח.
  8. לנתח ידי cytometry זרימה.

4. רכישה וניתוח זרימת cytometry

הפרטים של רכישה וניתוח של נתוני זרימה הם מכשיר תלויים. דגימות שליליות ייצוג לרוץ והגדרות מכשיר שהוקמו לקדימה (גודל) ופיזור צד (גרעיניות). דפוס פיזור זה מאפשר למשתמשי הקצה לראות את כל התאים במדגם, כולל פסולת. אזור בדרך כלל נמשך סביב התאים של עניין. (איור 4 א) הגדרות ואז הם הקימו לכל גלאי הקרינה הנדרשות כדי למקם את התאים השליליים בעשור הראשון של afעלילת העוצמת luorescence. כאשר אחד או יותר של צבע או fluorochrome משמש, פקדים מוכתמים בודדים יש להפעיל כדי לקבוע ערכי פיצוי צבע (חיסור של פליטת קרינה מפריעה). בעת הפעלת תאים חיים, צבע כדאיות כגון 7-AAD (7-אמינו-D אקטינומיצין - 488/emission העירור 655) משמש ואזור שני נמשך להוצאת תאים מתים (איור 4 ב). שני אזורים אלה חלים על כל ניתוח נוסף של הדגימות.

5. Assay עצמי חידוש

Assay המפתח שסייע בהרבה צמיחת תחום משובטת הוא המבחן במבחנה של יכולת התחדשות עצמית, assay הדילול המגביל. Tumorspheres הם ניתק והופץ בדילולים עד לתא בודד לטוב, וקצב היווצרות כדור המשך מעל 7 ימים בתרבות מחושב. ביום 7, אחוז הבארות אינם מכיל תחומים עבור כל צפיפות ציפוי תא (F 0) מחושב וזמםנגד מספר התאים לכל גם (x). מספר התאים נדרשים כדי ליצור tumorsphere אחת לפחות בכל גם נקבע מהנקודה שבה חוצה את הקו 0.37 הרמה (F 0 = דואר x). בהתפלגות פואסון של תאים, F 0 = 0.37 מתאימים לדילול של תא אחד לטוב, כך שחישוב זה (37% מצטלבים) משקף את התדירות של תאי גזע clonogenic באוכלוסיית התא השלמה (איור 5).

6. תא בודד RT-PCR

תאים בודדים מאוכלוסיות שונות מסודרים על ידי Beckman Coulter MoFlo XDP באתרי תגובה על שקופית AmpliGrid (חתול קולטר קמן # AG480F). התא הבודד RT-PCR מתבצע באמצעות AmpliGrid הבודדה שלב RT-PCR המערכת (חתול קולטר קמן # OAX04515) בהתאם למפרט של היצרן. בקצרה, תא בודד הוא הופקד לכל אתר תגובה של שקופית AmpliGrid; הנוכחות של תא בודד בכל אחדאתר אשר תגובה על ידי מיקרוסקופ. שעתוק לאחור (RT) מתבצע מייד לאחר המיון כדי למנוע מדגם מלהיות בסכנה. מיקס מאסטר RT מוכן טרי, על פי הוראות קיט (לוח 4). אנחנו השתמשנו 0.03 μl של 25 פריימרים אקראיים מיקרומטר (Promega) לתגובה; μl 1 מתוך מיקס מאסטר יתווסף למרכז של כל אתר תגובה. זה מצופה מייד עם 5 μl של פתרון איטום (חתול קולטר קמן # OAX04503). באמצעות שקופית Cycler AmpliSpeed ​​(Beckman Coulter; חתול # OAX04101), שקופיות מודגרת ב 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 42 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ו 55 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. לאחר שעתוק לאחור, 3 μl מי DNase / RNase ללא מתווסף לכל אתר תגובה, ואת התערובת כולה הועברה לצינור PCR (צינור 1 / אתר). בצלחת PCR, נפח תגובה של 10 μl משמש לכמותית PCR: 8 תמהיל μl qPCR אדון (5 μl Sybr גרין (Quanta), מי μl 1, μl 1 מתוך 10 מיקרומטר קדימה ולערבב פריימר הפוך) בתוספת 2 μ מערבל את תערובת RT. לכימות בזמן אמת, דגימות מנוהלות על Cycler BioRad באמצעות התכנית הבאה: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 45 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 60 מעלות צלזיוס במשך 60 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, ואחרי לפי 10 דקות ב 72 מעלות צלזיוס וניתוח עקום התכה. ערכי Ct נקבעו באמצעות OPTICON Monitor 3 (BioRad). שלושה גנים ניתן להעריך לתא, כוללים GAPDH כגן משק. ביטוי גנים מנורמל לביטוי GAPDH, לפי 2-ΔCt. לפחות תריסר תאים בודדים של אותה האוכלוסייה מאותו המין יכולים לשמש כביולוגי משכפל כדי לפצות על חוסר טכני משכפל.

7. נציג תוצאות

איור 1 מציג תהודה מגנטית סריקה (MRI) של מטופל עם נציג GBM. דגימות גידול במוח מתקבלות ממטופלי הסכמה מייד לאחר ניתוח, כפי שאושרו על ידי מדעי בריאות המילטון / מקמאסטר הבריאות Sעמוד ciences מחקר אתיקה. חלק מכל דגימה ניתן לneuropathologist לאבחון קליני שגרתי. המדגם שנותר מעובד כפי שמוצג באיור 2. תאי הגידול שצפים פעם אחת בתקשורת סלולרית המלאה העצבית גזע עם גורמי גדילה, tumorspheres טופס כפי שמוצג באיור 3.

התאים הסרטניים מסומנים עם סמנים עצביים משטח תאי גזע CD133 וCD15 ונותחו על ידי cytometry זרימה כפי שמוצגים באיור 4.

תאים בודדים מאוכלוסיות שונות לדוגמה, CD15 + / CD133 +, CD15 + /-CD133, CD15-/CD133 +, אז CD15-/CD133- מסודרים ל96 גם צלחות (איור 5 א) או לשקופיות AmpliGrid (איור 6 א).

בצלחת גם 96, תאים בודדים אשר מחזיקים יכולת התחדשות עצמית (למשל CD133 + תאים), (איור 5 ב), יכולים להיוצר tumorspheres (האיור 5c) בעקבות incubation. גרף התחדשות עצמית ניתן להתוות (איור 5d) על ידי ספירת מספר התחומים שנוצרו לטוב. תאים בודדים המסודר באתר התגובה של שקופית Ampligrid (איור 6 א). רנ"א שחולץ מן התאים בודדים ניתן עבד הפוך באמצעות Advalytix AmpliSpeed ​​(איור 6 ב). CDNA מתקבל משמש לביצוע בזמן אמת RT-PCR (איור 6 ג).

איור 1
איור 1. תמונת תהודה מגנטית (MRI) של GBM מטופל. סריקת MRI של המוח של ילדה בת 16-עם היסטוריה של חודש הימים של כאבי ראש והיסטורית שבוע אחד של הקאות, עייפות וטשטוש ראייה. רצף פלייר צירי מראה GBM גדול דו חצאים מוח ("פרפר").

איור 2
איור 2. עיבוד גידול במוח. דגימות גידולי מוח הוא obtaלעצמה מהסכמת חולים מייד לאחר ניתוח. הם מכאניים ניתקו כפי שמוצגים () ולאחר מכן הם enzymatically ניתק בaCSF עם Liberase ידי דוגר ב30 סל"ד נדנדת חממה על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות (ב).

איור 3
איור 3. אוכלוסיות BTIC יוצרות tumorspheres בתרבות. תאים סרטניים במוח ניתקו מצופים בתקשורת סלולרית המלאה העצבית גזע עם גורמי גדילה בצורת tumorspheres.

איור 4
איור 4. ניתוח cytometric זרימה של אוכלוסיות BTIC. () קדימה לעומת פיזור נכסי לוואי לספק תמונה של כל התאים, כולל פסולת (ב) תאים שכתם עם צבע הכדאיות 7-AAD אינם נכללים בניתוח. (ג) העמדה של הרביעים הסטטיסטיים נקבעת באמצעות פקדי אלוטיפ מתאימים (ד) תאי גידול מוכתם במשטח markers CD15-PE וCD133-APC. (ד) סדרן התא XDP Moflo. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 5
איור 5. הגבלת ניתוח דילול BTICs מגלה יכולת ההתחדשות העצמית שלהם. (א) תאים של דילולים שונים מסודרים ל96 בארות המכילות 200 μl של המל"ל ל( ב) תא בודד לטוב. (ג) לאחר תקופת דגירה 7 יום, tumorsphere נוצר. המורפולוגיה של tumorspheres שתיים היא זהה לזה של tumorspheres הראשוני. (ד) הערכים הממוצעים x-ליירט ניתן לחשב מהגבלת ניתוח דילול לכל תת סוג גידול כדי לחשוף את מספר התאים הנדרשים ליצירת tumorsphere לפחות אחת לטובה.

איור 6
איור 6. ניתוח ביטוי גנים של תא בודד BTICמשתמש אפשרי טכנולוגיית תא בודדה RT-PCR. (א) תאים בודדים מאוכלוסיית BTIC ניתן למיין על שקופיות AmpliGrid. (ב) סינתזת cDNA מבוצעת על תאים בודדים על שקופיות AmpliGrid באמצעות Advalytix AmpliSpeed. (ג) זמן האמת PCR כמותית מתבצע על cDNA מסונתז מתאי BTIC בודדים.

2M NaCl 62 מ"ל
1M KCl 5 מ"ל
1M MgCl 2 3.2 מ"ל
155 המ"מ 3 NaHCO 169 מ"ל
גלוקוז 1M 10 מ"ל
108 המ"מ CaCl 2 .9256 מ"ל
Purelab Ultra H 2 0 749.84 מ"ל

טבלת 1 נוזל השדרתי מלאכותי (aCSF) -. 1,000 מ"ל.

מניות תקשורת הבסיסית 500 מ"ל
01:01 DMEM: F12 480 מ"ל
תוסף N2 5 מ"ל
HEPES 1M 5 מ"ל
גלוקוז 3.0 גרמו
N-acetylcysteine ​​(60 מיקרוגרם / מ"ל) 1 מ"ל
גורם-1 עצבי הישרדות (NSF-1) 10 מ"ל

טבלה 2. תקשורת תאי גזע העצבית.

תקשורת המלאה (מל"ל עשה טרי לפני שימוש):
תקשורת מל"ל basal + 20 ng / ml EGF (גורם גדילה באפידרמיס) + 20 ng / ml bFGF (גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי) + 10 ng / ml LIF (גורם מעכב לוקמיה) + 10 * μl / מיליליטר האנטיביוטיקה antimycotic

* גורם מעכב לוקמיה (LIF): מגיב זה מMillipore מכיל ציטוקין אינטרלוקין 6 כיתה, יחסי ציבורotein המדכא התמיינות ספונטנית של תאי גזע מקדמים תחזוקה לטווח ארוך יותר מתרביות תאי גזע.

נוגדנים ספק / מק"ט μl / מבחן (ב100 μl)
CD133 / 2 APC (293C3) Miltenyi Biotec/130-090-854 5
IgG2b APC (אלוטיפ שליטה) Miltenyi Biotec/130-092-217 5
CD15PE Beckman Coulter/IM1954U 5
IgG2a PE (אלוטיפ שליטה) Beckman Coulter/A09141 5
7AAD Beckman Coulter/A07704 10

לוח 3. נוגדני זרימה.

רכיב נפח (תגובה 1) נפח (48 תגובות)
2x הצפת תגובת תא בודדה RT 0.50 μl 30.0 μl
RNase אינהיביטור (10 / μl U) 0.02 μl 1.2 μl
תא יחיד 5X RT משפר 0.15 μl 9.00 μl
מיקס תא בודד RT אנזים 0.04 μl 2.4 μl
Advablue (OAX04227) 0.1 μl 6.00 μl
מי nuclease חופשיים לעשות עד μl 1 להפוך עד 60 μl

לוח 4. רכב תמהיל RT אב לRTPCR-Single Cell (חתול # OAX04515).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השערת סרטן תאי גזע 10, המבוססת על עבודה בשנת 21 לוקמיה, סרטן השד והסרטן 11 סרטן המוח 4,5, מצביעה על כך שרק חלק קטן יחסית של תאים בגידול, תאי גזע סרטני המכונים, יש יכולת הנרחבת להתרבות ועצמי חידוש. רוב התאים הסרטניים מאבדים את היכולת להתרבות ולחדש את עצמו כפי שהם להתמיין לתאים שהופכים לחתימה הפנוטיפי של הגידול. מציאת התאים המרכזיים באוכלוסיית הגידול במוח שהם מסוגלים לשמור על הגידול תיתן תובנה לגבי המנגנון של tumorigenesis המוח ויאפשר לנו להתחקות לתא מוצא.

תאי גזע הם תאים שהוגדרו כפונקציונלי עצמי מתחדשים כי תערוכת בידול רב שושלת 22-24. רקמת גידול במוח העיקרית היא גדל בתנאי התרבות שמעדיפים צמיחה של תאי גזע, שהוקמה בעבר לבידוד של תאי גזע עצביים כtumorspheres 6,26. ללא תלות בתת סוג הפתולוגי, בתוך 24 עד 48 שעות של התרבות הראשונית, גידולים במוח רוב להניב חלק מיעוט של תאים המדגימים צמיחה לאשכולות נגזרים clonally neurosphere דמויים, או tumorspheres. כך אנו יכולים להעשיר לאוכלוסיות BTIC מרקמות גידול במוח מטופל.

הופעתו של תא מרובה פרמטר הניאון הופעל מיון 27 וטכנולוגית נוגדן חד שבטית 28 אפשרה לטיהור של תאי גזע סרטני המבוססת על סמנים בתא שטח. באמצעות סמני תאי גזע כגון CD133 וCD15, הצלחנו ולהבא כדי למיין עבור אוכלוסיות ספציפיות תא גזע דמוי וללמוד יכולת ההתחדשות העצמית שלהם על ידי ביצוע מבחני דילול מגביל. הקוויאהt של מבחני התחדשות עצמית הוצג על ידי מחקר שנערך לאחרונה מראה כי במבחנת התחדשות עצמית לא תמיד תואמת את היווצרות גידול במודלי עכבר 29. עם זאת העבודה האחרונה שלנו הראתה כי במבחני חוץ גופיית התחדשות עצמית אין לתאם עם הישרדות חולה, טיוח מבחנים חשובים למחקר המתמשך של ביולוגית BTIC 30 אלה.

עבודה עם רקמה אנושית ראשונית מציבה אתגרים טכניים רבים. עיבוד רקמות צריך להתבצע בעדינות רבה כדי לשמור על החיוניות של תאים בודדים. כמות Liberase שימוש, וזמן הדגירה היא קריטית. מיון זרימה של תאים יכול להיות מותאם להגברת כדאיות לאחר המיון באמצעות חרירים ולחצים שונים. אנו מוצאים כי התאים שלנו מעדיפים להיות מסודר דרך נחיר 100μm ב 30 psi של לחץ נדן. מיון על אתרים תגובתי שקופיות Ampligrid אולי מעט קשה: חשוב לאשר את קיומו של התא שהופקד על ידי מיקרוסקופ.

31. גידולים במוח בדרך כלל מורכבים של תאים מורפולוגית מגוונים שמבטאים מגוון של סמני שושלת עצביות. חקר גידולים במוח על ידי היסטופתולוגיה מסורתית הניב כמות מוגבלת של ידע של ההתנהגות הקלינית של גידול בלבד. למרות התקדמות גדולה שנעשתה בהבנה של השינויים הגנטיים המולקולריים של גידולי מוח מסוימים 3,32-34, גליומות במיוחד מדולובלסטומות וממאירים, וחלק משינויים אלו שזוהו עכשיו מתחילים להדריך את הטיפול, זה לא ברור אם כל גידול תאים שווים ביכולתן לשמור על צמיחת גידול. ניתוח של הגנים המרכזיים מעורבים במסלולי איתות באוכלוסיות גידול במוח הוא קריטי כדי לקדם את ההבנה של מנגנוני חריגים שמובילים להיווצרות גידול במוח שלנו. אפילו בלכאורה homogeרקמת nous, תאים להוכיח להיות ייחודיים ביכולות הפוטנציאליות שלהם. ניתוח של רמות ביטוי תעתיק וחלבון בתאים בודדים עולה כי קיימות שונות תאי תאים גדולים הוא במצב המנוחה וכאשר הם נחשפים לגירויי 35-39. לכן, ניתוח כל האוכלוסייה של תאים לא יחשוף את ההתנהגות של תא בודד. qRT-PCR נחשב את תקן הזהב לכימות mRNA 40-41. במחקר זה, אנו מדגימים מיון פוטנציאלי של תאים בודדים מאוכלוסיות שונות בשקופיות AmpliGrid. שימוש בתא בודד RT-PCR, אנו מסוגלים לבצע ניתוח ביטוי גנים בתא בודד מאוכלוסייה הטרוגנית, ובכך להעריך את המשמעות הביולוגית של תא נבחר בתוך אוכלוסייה מעורבת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי אונטריו המכון לחקר הסרטן (OICR), הטריה פוקס הקרן והאגודה האמריקנית לניתוחים נוירולוגיים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1:1 DMEM:F12 Invitrogen 11320-082
N2 supplement Invitrogen 17502-048
1M HEPES Wisent Inc. 330-050-EL
Glucose Invitrogen 15023-021
N-acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-25g
Neural survival factor -1 (NSF-1) Lonza Clonetics CC-4323
Epidermal growth factor (EGF) Sigma-Aldrich E9644
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Invitrogen PHG0261
Leukemia inhibitory factor (LIF) EMD Millipore LIF1010
Antibiotic/mycotic Wisent Inc. 450-115-EL
Liberase TM Roche Group 05 401 119 001
Ammonium chloride solution Stem Cell Technologies 07850

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ohgaki, H., Kleihues, P. Epidemiology and etiology of gliomas. Acta Neuropathol. 109, 93 (2005).
  2. Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma. 10, 319 (2010).
  3. Wechsler-Reya, R., Scott, M. P. The developmental biology of brain tumors. Annu. Rev. Neurosci. 24, 385 (2001).
  4. Singh, S. K. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res. 63, 5821 (2003).
  5. Singh, S. K. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396 (2004).
  6. Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1 (1996).
  7. Tropepe, V. Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev. Biol. 208, 166 (1999).
  8. Yin, A. H. AC133, a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 90, 5002 (1997).
  9. Yu, Y., Flint, A., Dvorin, E. L., Bischoff, J. AC133-2, a novel isoform of human AC133 stem cell antigen. J. Biol. Chem. 277, 20711 (2002).
  10. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, 105 (2001).
  11. Al-Hajj, M. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 3983 (2003).
  12. Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med. 3, 730 (1997).
  13. Matsui, W. Characterization of clonogenic multiple myeloma cells. Blood. 103, 2332 (2004).
  14. Bao, S. Targeting cancer stem cells through L1CAM suppresses glioma growth. Cancer Res. 68, 6043 (2008).
  15. Bao, S. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444, 756 (2006).
  16. Bao, S. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Res. 66, 7843 (2006).
  17. Beier, D. Temozolomide preferentially depletes cancer stem cells in glioblastoma. Cancer Res. 68, 5706 (2008).
  18. Piccirillo, S. G. Distinct pools of cancer stem-like cells coexist within human glioblastomas and display different tumorigenicity and independent genomic evolution. Oncogene. 28, 1807 (2009).
  19. Piccirillo, S. G. morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444, 761 (2006).
  20. Rich, J. N., Bao, S. Chemotherapy and cancer stem cells. Cell Stem Cell. 1, 353 (2007).
  21. Lapidot, T. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367, 645 (1994).
  22. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, 105 (2001).
  23. Fuchs, E., Segre, J. A. Stem cells: a new lease on life. Cell. 100, 143 (2000).
  24. Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157 (2000).
  25. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707 (1992).
  26. Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12, 4565 (1992).
  27. Hulett, H. R., Bonner, W. A., Barrett, J., Herzenberg, L. A. Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence. Science. 166, 747 (1969).
  28. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495 (1975).
  29. Barrett, L. E. Self-renewal does not predict tumor growth potential in mouse models of high-grade glioma. Cancer Cell. 21, 11 (2012).
  30. Venugopal, C. Bmi1 marks intermediate precursors during differentiation of human brain tumor initiating cells. Stem Cell Res. 8, 141 (2012).
  31. Gerlinger, M. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883 (2012).
  32. Gilbertson, R. J. Medulloblastoma: signalling a change in treatment. Lancet. Oncol. 5, 209 (2004).
  33. Zhu, Y., Parada, L. F. The molecular and genetic basis of neurological tumours. Nat. Rev. Cancer. 2, 616 (2002).
  34. Maher, E. A. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15, 1311 (2001).
  35. Blake, W. J., KAErn, M., Cantor, C. R., Collins, J. J. Noise in eukaryotic gene expression. Nature. 422, 633 (2003).
  36. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297, 1183 (2002).
  37. Maheshri, N., O'Shea, E. K. Living with noisy genes: how cells function reliably with inherent variability in gene expression. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 413 (2007).
  38. Raj, A. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4, e309 (2006).
  39. Ross, I. L., Browne, C. M., Hume, D. A. Transcription of individual genes in eukaryotic cells occurs randomly and infrequently. Immunol. Cell Biol. 72, 177 (1994).
  40. Kubista, M. The real-time polymerase chain reaction. Mol. Aspects Med. 27, 95 (2006).
  41. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1, 1559 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics