一个官能二肽的固相合成使用“安全锁扣”方法论

Biology
 

Summary

高效固相多肽合成的官能双肽三聚体,利用“安全赶上”HMBA树脂裂解过程的描述。

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Pfeiffer, C. T., Schafmeister, C. E. Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology. J. Vis. Exp. (63), e4112, doi:10.3791/4112 (2012).

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Abstract

1962年,RB梅里菲尔德出版的第一个过程,作为一种新的路由使用的固相多肽合成,高效合成肽。很快就证明了这种技术的优势在其溶液相在时间和劳动的前身。关于固体支持性质的改善,保护群体的就业和耦合方法在过去的五十年只增加了梅里菲尔德的原系统的有效性。今天,使用中银为基础的保护和基地/亲核裂解树脂战略或基于FMOC-保护和酸性裂解树脂战略,率先由RC谢泼德,是最常用的用于合成多肽1。

梅里菲尔德的固体支持战略的鼓舞下,我们已经制定了一个组装官能双肽,这是本文所述的中银/叔丁基固相合成策略。使用固相合成比较牛逼O解决方案相方法不仅有利于梅里菲尔德1所述的时间和劳动,但也允许在双肽库的合成更大的方便。我们在这里展示的综合集成了最终的卵裂阶段,使用两个步骤“安全赶上”机制,从哌嗪二酮形成树脂官能双肽释放。

双肽刚性,螺梯双氨基酸,能在可预见的和可设计的单体单位和每个单体之间的连接的类型和立体控制的方式,定位功能的低聚物。每双氨基酸是1立体纯净,循环支架包含两个氨基酸(与α-氨基甲酸)3,4。我们的实验室目前正在调查横跨多种领域,包括催化,蛋白质相互作用和N的潜在功能双肽anomaterials。

Protocol

1。安装

  1. 固相合成反应的设置是聚丙烯滤芯或玻璃反应釜,真空条件下通过聚丙烯管连接到一个封闭的过滤瓶,如在图1所示。可以通过磁力搅拌棒或通过反应器鼓泡氮混合反应。
  2. 一个气歧管连接到配备干燥管和油起泡氩气瓶还建议,因为它允许下惰性气氛中的反应容器,并允许从密封容器中的试剂去除。
  3. 所有操作均在通风橱和适当的个人防护装备(安全眼镜,白大褂和丁腈手套)是必需的。

2。载入中第一双肽到树脂

  1. 重达114毫克HMBA-AM树脂(0.88毫摩尔/克负荷,100μmol)到8 mL的反应釜和加入磁力搅拌棒。封顶日顶部ê船只用橡胶隔垫和氩气吹扫管至少5分钟。
  2. 在此期间,重达117.3毫克图3(586.63克/摩尔,2EQ)和59.2毫克1化合物1 - (三甲苯2 -磺酰)-3-硝基-1,2,4 -三唑(MSNT,296.0克/摩尔,2EQ)到15毫升的一次性离心管,并溶解在2 mL无水二氯甲烷(DCM)。加入24μL1 - 甲基咪唑(NMI,80.81毫升/摩尔,3EQ)解决方案组合,直到完全溶解。
  3. 转移激活解决方案,通过注射器的反应容器中,并允许下氩隔夜(10小时),搅拌。
  4. 取出隔,并排出反应混合物。洗树脂与DCM(5倍)和二甲基甲酰胺(DMF)(5倍)。执行“甲基红试验”,在10.1节中描述的评估树脂负载程度。如果树脂甲基红试验过程中保持红色,则步骤应重复2.2和2.3。一个黄色的颜色,指示负甲基红试验,是首选;然而,因为任何剩余的羟基组将在下一步中,稍微积极的结果(浅橙色树脂的颜色)的上限是可以接受的。

3。脱的第一双肽同时封顶树脂

  1. 然后加入1毫升的DCM的反应容器中添加冰醋酸滴加1 mL 33%的溴化氢,超过30秒(冒泡),并允许搅拌15分钟。排水和洗树脂用DCM(5倍),然后重复处理一次。
  2. 洗树脂与DCM(5X),然后DMF(5倍)。抵消树脂由5%V / V解决方案的N,N - 二异丙基(DIPEA)在DMF中,然后用DCM(5倍)和二甲基甲酰胺(5倍)再次清洗两次。执行“甲基红试验”和“醌测试”的10.1和10.2节中讨论。甲基红试验和醌测试的阳性结果应该是阴性。

4。耦合叔/ TBU保护官能双阿米无酸

  1. 三次洗涤,无水的DCM重新惰性气氛中的含树脂反应釜,然后附上隔和氩线。清除和清洗船只,加入1-2毫升无水的DCM和出租搅拌30秒,然后排空容器氩行起泡的,直到开始上升。这样做至少一次。
  2. 准备一个0.15 M的解决方案功能的双氨基酸(3EQ)的1 - 羟基-7-azabenzotriazole(HOAt,136.11克/摩尔,18eq)2:1的DCM在2毫升和245毫克二甲基甲酰胺在火焰干测试管在氩气气氛。新增47μL的diisopropylcarbodiimide,(DIC时,156.6毫升/摩尔,3EQ),搅拌90分钟。
  3. 加入666μL无水DMF 35微升DIPEA(174.19毫升/摩尔,2EQ)树脂,并允许搅拌5分钟。
  4. 转让前活性双氨基酸的反应容器中的溶液通过注射器,并允许搅拌过夜。
  5. 排出反应混合物,并用无水DCM的两次,而根据氩气。
  6. 促进关闭哌嗪二酮,增加0.25中号的HOAt(136.11克/摩尔,10eq)和DIC(156.6毫升/摩尔,10eq)在1:1 DCM的4毫升的解决方案:二甲基甲酰胺,并允许在氩气搅拌1个小时。
  7. 取出隔,并排出反应混合物。洗树脂与DCM(5倍)和二甲基甲酰胺(5倍)。如果需要的话,执行第10.2节中所讨论的“醌测试”。

5。中银/ TBU保护功能化的双氨基酸脱的

  1. 加入2毫升95:5 trifluororacetic乙酸(TFA)的解决方案:triisopropylsilane(TIPS)的反应容器,并允许它搅拌1小时。排水和洗用DCM(5X)树脂约30秒,然后重复过程一次。
  2. 洗树脂与DCM(5X),然后DMF(5倍)。抵消树脂由5%V / V解决方案,在DMF DIPEA然后洗DCM(5倍)和二甲基甲酰胺(5倍)再次清洗两次。如果需要的话,执行第10.2节中所讨论的“醌测试”。
乐“> 6。重复步骤4和5所需的合成有针对性的双肽。

7。官能双肽Prolidine的完

  1. 酰化日益增长的双肽prolidine年底可单独或一起通过哌嗪二酮。此外,为此可以离开保护,这将被切割后,给予该游离氨基酸。如果需要,执行“醌测试”,在10.2节讨论评估的耦合效率。

8。脱的FMOC和双肽第四纪酰化

  1. 添加2mL的解决方案的20%,在DMF哌啶和20分钟的反应不一。排水和洗树脂与二甲基甲酰胺(5倍),然后再次重复过程。
  2. 洗树脂与DCM(5X),然后DMF(5倍)。
  3. 准备在2毫升N-甲基吡咯烷酮(NMP)的一个氨基酸(3EQ)0.15 M的解决方案,与114毫克2 - (7 - 氮杂-1H-苯并三唑-1 - 基)-1,1,3,3 - 四甲基咪唑六氟磷酸盐 (哈图,380.2克/摩尔,3EQ)和104.5μLDIPEA(174.19毫升/摩尔,6eq)拌匀。加入反应釜,并允许搅拌6小时。
  4. 洗树脂与DCM(5X),然后DMF(5倍)。

9。从开往氨基酸和切割树脂树脂中银集团

  1. 反应容器中加入2毫升1:1反式脂肪酸:DCM的解决方案,并允许搅拌30分钟。排水和洗树脂用DCM(5倍),然后重复处理一次。
  2. 洗净沥干树脂与DCM(5倍),然后DMF(5X)30秒。
  3. 加入2 mL 10%的无水DMF DIPEA的解决方案中,并允许搅拌24-48小时。
  4. 预先称重的圆底烧瓶中收集到反应混合物。转移30μL此解决方案,以450μL,在LC-MS法小瓶四氢呋喃,并提交分析。与二甲基甲酰胺的额外等分洗净树脂和收集到的圆底烧瓶中,然后在真空中除去溶剂。
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10。双肽的分离纯化

  1. 原油溶解在二甲基亚砜(100-250μL)和转移到高效液相色谱小瓶插入少量双肽。地方半prepitive的高效液相色谱系统(惠普1100系列)插入到自动进样器配备的Xterra准备MS C18的5微米7.8x150 mm柱和100μL注射液循环。
  2. 执行多个样品50水的5-95%乙腈梯度程序超过30分钟,同时在274 nm处监测微升0.1%甲酸注射。在预先称重的一次性离心管收集产品峰和冻结干燥用冻干机,应注意采取与第一次运行比较分析学习内容管理系统,通常是观察一个峰的保留时间略有转变。

11。评估方法

  1. 甲基红试验7:删除〜1毫克干树脂通过一次性吸管,冲洗成4毫升的反应容器。加入500μL无水DCM的20毫克甲基红,50μL,列印,N'-diisopropylcarbodiimide双丙烯酰胺(DIC)和5 mg 4 - 二甲氨基吡啶(DMAP)的解决方案,并允许搅拌5-10分钟。排水和洗树脂与DCM的,直到滤液变成无色。积极的迹象是剩余的橙色或红色的树脂。
  2. 醌测试12:换乘1毫克干树脂通过一次性吸管小瓶。 0.8毫米在DMF溶液醌和2%的乙醛在DMF溶液中加入3滴,让坐在室温5-10分钟。积极的迹象是变成蓝色/紫色的树脂。
  3. 激活陷阱检测:活性化合物的合成过程中,可评估转移激活的解决方案,以液相色谱 - 质谱(LC-MS)的小瓶含50μL吡咯烷少量(5-10微升)。手工搅拌几秒钟(soluti应该变成黄色),然后稀释450μL四氢呋喃(THF),并提交LC-MS分析。
  4. 分析LC-MS评估的最终产品和活性中间体可以使用惠普1200系列的LC-MS系统配备沃特世的Xterra的MS C18 3.5微米4.6毫米×150毫米列和5-95%的水乙腈梯度​​系统甲酸0.1%,超过30分钟。

12。代表结果

同时原油的例子( 图4)和纯化( 图5)提供学习内容管理系统的痕迹。纯化产量的约10%,预计使用上述方法。

图1
图1。固相合成实验装置图。

图2
图2。双氨基酸/双肽的有关术语。

图3
图3。整体的综合计划。 点击这里查看大图

图4a
图4a。高效液相色谱法在274 nm的原油产品的跟踪。

图4b
图4b。MS粗品峰值的频谱。

图5a
图5a。高效液相色谱纯化,产品在274纳米微量元素。

图5b
纯化生产的质谱图5b。T峰。

Discussion

这里提供了一个双氨基酸建筑块,采用常见的固相多肽合成技术的功能之二肽合成方法合成方法。单体合成的“反-4-羟脯氨酸3这些”PRO4的积木是高度可扩展的,并已成功完成海因阶段在600毫摩尔(234克)规模(未出版)。一旦手单体,采用固相技术提供了比我们目前的解决方案相方法,通过消除反应的工作和中间纯化需要更快速的双肽合成方法。

在固相合成的主要挑战是合成的进展情况和解决问题的,因为没有中间隔离的诊断。这导致许多比色法测试的发展,包括识别,如果自由胺(凯泽测试10)或免费hydroxYLS(甲基红试验7)暴露树脂。不幸的是,常用的凯撒测试10是在我们的固相合成由于二级胺或附加到一个季碳胺几乎独占使用一般不适用。为在HMBA树脂评估的其他选项包括测试分裂使用,如肼11,定量Fmoc保护裂解紫外/可见1,11监测亲核,捕获和分析传入激活化合物。

在固相合成的另一个被忽视的问题是重复操作所需要的合成步骤的性质。这是头脑,强烈建议使用电子表格或清单时执行任何手动固相多肽合成。

使用比较常见的α-氨基酸的固相合成二肽的困难,包括由于立体欣潜力更加困难接头需要上树脂哌嗪二酮封drance,同时deprotections(BOC /的TBU; CBZ / TBU)。另一个困难在于实现从树脂相比更常规的手段时,使用这个“安全陷阱”的方法,定量释放。考虑到这些因素,这是非常可能的,这种方法的进一步优化,可以达到目前的努力是我们小组正在改善这里介绍的方法。

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

作者扎卡里Z.的布朗博士和珍妮弗Alleva想感谢本固相合成技术和有益的讨论马修佛罗里达州帕克的初步发展。这项工作是支持国防威胁降低局(国防部DTRA)(HDTRA1-09-1-0009)和由Cephalon公司的支持霍斯特·威策尔奖学金奖

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HMBA-Am Resin Novabiochem, EMD Millipore 855018
MSNT Novabiochem, EMD Millipore 851011
NMI Sigma-Aldrich 336092 Toxic, Corrosive
DCM Sigma-Aldrich D65100 Carcinogenic
Anhydrous DCM Acros Organics 34846 Carcinogenic
33% Hydrogen Bromide in Acetic Acid Sigma-Aldrich 248630 Toxic, Corrosive, Fumes when open
DIPEA Sigma-Aldrich 387649 Flammable, Toxic, Corrosive
DMF Fisher Scientific AC27960 Flammable, Toxic
Anhydrous DMF Acros Organics 34843 Flammable, Toxic
HOAt GenScript C01568
DIC Acros Organics BP590 Flammable, Toxic, Corrosive
TFA Sigma-Aldrich T6508 Toxic, Corrosive
TIPS Acros Organics 21492 Flammable, Toxic
Piperidine Sigma-Aldrich 104094 Flammable, Toxic, Corrosive
HATU GenScript C01566 Toxic
NMP Acros Organics 36438 Toxic
DMAP Novabiochem, EMD Millipore 851055 Toxic
Methyl Red Sigma-Aldrich 250198
THF Sigma-Aldrich 401757 Flammable, Toxic, Peroxide Forming
Pyrrolidine Sigma-Aldrich P73803 Flammable, Toxic, Corrosive
Dimethyl Sulfoxide Fisher Scientific D1281
SPPS Reaction Vessels Grace 211108
LCMS Agilent Technologies 1200 Series
Semi-Prep LC Hewlett-Packard 1100 Series
Lyophilizer Labconco Corp. 7934027
Rotovapor Buchi R-210 Series
Argon Airgas AR PP300CT

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References

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