रोगी के रक्त के नमूने से व्यवहार्य परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं का तेजी से अलगाव

Bioengineering
 

Summary

घूम ट्यूमर कोशिकाओं सेलुलर क्षति inflicting के बिना कैंसर के रोगियों के रक्त से अलग कर रहे हैं. ट्यूमर कोशिकाओं के अलगाव उपकला मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी के लिए इसके अलावा में ई selectin के bimolecular सतह का उपयोग कर पूरा किया है. एक नैनोट्यूब कोटिंग विशेष रूप से कैंसर कोशिका आसंजन उच्च कब्जा purities में जिसके परिणामस्वरूप को बढ़ावा देता है.

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Hughes, A. D., Mattison, J., Powderly, J. D., Greene, B. T., King, M. R. Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples. J. Vis. Exp. (64), e4248, doi:10.3791/4248 (2012).

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Abstract

Protocol

निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक एकल microtube डिवाइस के उत्पादन के लिए है.

1. Halloysite नैनोट्यूब समाधान की तैयारी

  1. Sonicate (10-13 डब्ल्यू (RMS)) 250 μL halloysite नैनोट्यूब समाधान पानी में (6.6% wt) 30 सेकंड. ठंडा पानी और एक बार दोहराने sonication के साथ शांत समाधान. फिर से शांत.
  2. एक सिरिंज में sonicated समाधान ड्रा, एक .45 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर देते हैं, और स्वच्छ microfuge ट्यूब में फिल्टर समाधान. भंवर कभी कभी समाधान के लिए एकरूपता बनाए रखने के.

2. Microtube भीतरी सतह के नैनोट्यूब halloysite साथ कोटिंग

  1. 50 सेमी माइक्रो Renathane microtubing की लंबी धारा (300 माइक्रोन भीतरी व्यास, 35.3 μL आंतरिक मात्रा) प्राप्त करते हैं. एक विकर्ण पर microtube के एक छोर कट और एक छोटे IDEX अनुकूलक टुकड़ा में सम्मिलित करें. Microtube के अन्य अंत में एक 3/10 सीसी 29G सिरिंज की सुई डालें.
  2. Microtube साफ, microtube के खुले अंत (अंत जगहअनुकूलक के साथ) ~ 70% इथेनॉल और आकर्षित में सिरिंज में 50 μL इथेनॉल microtube भरने के लिए.
  3. सिरिंज में आसुत पानी की एक उदार मात्रा ड्राइंग द्वारा microtube के बाहर के इथेनॉल कुल्ला.
  4. Microtube से अलग करें सिरिंज, सिरिंज खाली, और तब पुनः अनुलग्न microtube के लिए.
  5. 0.02% w / वी पाली एल lysine के पानी में एक समाधान तैयार. Microtube में 50 μL ड्रा और कमरे के तापमान (आर टी) में 5 मिनट के लिए बैठने की अनुमति.
  6. Microtube में 100 μL फ़िल्टर नैनोट्यूब समाधान ड्रा और आरटी में 3 मिनट के लिए सेते हैं होने की अनुमति देते हैं.
  7. नैनोट्यूब समाधान कुल्ला microtube के माध्यम से 100 μL पानी ड्रा. बैठने के लिए, पानी से भरा है, आरटी पर रात भर लेपित microtube की अनुमति दें.

3. सेल अलगाव Microtubes की तैयार

  1. 10 / 1X Dulbecco फॉस्फेट में μg एमएल प्रोटीन जी की एक समाधान तैयार खारा बफर (Pbs, 7.0 पीएच - 7.2). Microtube के माध्यम से 50 μL पीबीएस ड्रा और फिर 50 के μL आकर्षितप्रोटीन जी समाधान और आरटी पर 1.5 घंटे के लिए सेते हैं अनुमति देते हैं.
  2. 5 μg एमएल / ई selectin के आईजीजी और 50 पीबीएस में एंटीबॉडी μg / एमएल (विरोधी - EpCAM सबसे कैंसर के नमूने के लिए, प्रोस्टेट कैंसर के नमूने के लिए विरोधी PSMA) युक्त समाधान तैयार. Microtube में ई selectin और एंटीबॉडी के समाधान के 50 μL ड्रा और आरटी में 2 घंटे के लिए सेते हैं होने की अनुमति देते हैं.
  3. Nonspecific सेलुलर आसंजन 5% का दूध प्रोटीन के साथ अवरुद्ध है. 5 (w / v)% पीबीएस में दूध प्रोटीन का एक समाधान तैयार. Microtube में 50 μL दूध के प्रोटीन समाधान ड्रा और आरटी में 1 घंटे के लिए सेते हैं होने की अनुमति देते हैं.
  4. ट्यूब में 50 μL पीबीएस ड्रा और आरटी पर छोड़ जब तक रक्त या buffy कोट नमूने प्रसंस्करण के लिए तैयार हैं.
  5. पहले अलगाव लिए microtube का उपयोग करने के लिए 10 मिनट, 50 μL पीबीएस है कि 2 (पीबीएस ") सीए के साथ संतृप्त है selectin अणुओं को सक्रिय करने के लिए आकर्षित.

4. नमूनों की सेल अलगाव के लिए तैयार

  1. ड्रा या heparinized में रोगी से 10 एमएल रक्त प्राप्तट्यूब.
  2. जगह 10 एमएल Ficoll - Paque 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में लिम्फोसाइट अलगाव समाधान. धीरे परत 10 एमएल Ficoll के शीर्ष पर पूरे रक्त इतनी के रूप में मिश्रण करने के लिए नहीं रक्त और Ficoll के.
  3. के 2000x जी में 4 बजे डिग्री सेल्सियस कम से कम मंदी के साथ 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
  4. Buffy कोट और नया ट्यूब में परत जगह निकालें.
  5. धो पीबीएस के साथ buffy कोट (230x जी पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला त्यागने).
  6. धीरे 1 एमएल आरबीसी lysis बफर के साथ कोशिकाओं resuspend और आरटी पर 10 मिनट एरिथ्रोसाइट्स lyse करने के लिए सेते हैं.
  7. 10 एमएल पीबीएस धीरे मिश्रण, और 230x जी पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र जोड़ें. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और धीरे 3 में गोली 4 एमएल + पीबीएस resuspend.

5. सेल अलगाव

  1. 5 एमएल सिरिंज IDEX एडाप्टर का उपयोग करने के लिए functionalized microtube के एक छोर संलग्न.
  2. सिरिंज एक सिरिंज पंप पर डालें.
  3. खुले अंत में सेल suspensio में functionalized microtube की डूबएन.
  4. 1 से 4 एमएल / घंटे में microtube सेल के माध्यम से निलंबन की प्रक्रिया.
  5. एक PBS युक्त ट्यूब के स्थानांतरण के लिए microtube के खुले अंत + और सिरिंज में 0.016 एमएल / मिनट पर 300 μL पीबीएस + microtube से अनबाउंड और शिथिल बाध्य कोशिकाओं को दूर करने के लिए आकर्षित.
  6. एक स्वच्छ ट्यूब में microtube के खुले अंत रखें. Microtube से सिरिंज डिस्कनेक्ट और Accutase साथ प्रीफिल्ड सिरिंज देते हैं. धीरे को भरने microtube (~ 50 μL) में पर्याप्त Accutase छिड़कना और आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते हैं अनुमति देते हैं.
  7. एक साथ विकास के मीडिया के 1 एमएल (79 RPMI%, 20% 1% FBS, पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन) और microtube में छिड़कना प्रीफिल्ड सिरिंज संलग्न, टिशू कल्चर में एकत्रित प्रवाह अच्छी तरह से इलाज थाली.
  8. 37 में संस्कृति कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस और humidified शर्तों के तहत 5% सीओ 2.

6. प्रतिनिधि परिणाम

इस तकनीक के लक्ष्य के कैंसर के रोगियों के रक्त से व्यवहार्य कैंसर कोशिकाओं को अलग करना है. कई तरीकों संस्कृति में कैंसर की कोशिकाओं की पहचान मौजूद, डिवाइस सफलता की एक आवश्यक सत्यापन. हम EpCAM (उपकला सेलुलर आसंजन अणु) या PSMA (प्रोस्टेट विशेष झिल्ली प्रतिजन) के रूप में उपकला moieties के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ संस्कृति में कोशिकाओं का दाग, DAPI करने के लिए इसके अलावा में बरकरार सेल नाभिक (छवि 2 और 3) की पहचान करने के लिए चुना है. कैंसर की कोशिकाओं की संख्या पर कब्जा कर लिया इस तकनीक का उपयोग शुरू नमूना में जरूरी CTCs की संख्या का एक समारोह है, और रोगी परिवर्तनशीलता उच्च किया जा सकता है. चतुर्थ चरण के कैंसर के साथ का निदान रोगियों से ली गई नमूनों के प्रसंस्करण में, हम नियमित रूप से 100 के बीच और 500 ट्यूब प्रति रक्त कैंसर की कोशिकाओं को, purities में> 50% पर कब्जा. तुरंत अलगाव के बाद, contaminating के leukocytes का अधिक से अधिक संख्या में उपस्थित हो सकता है. हालांकि इन नंबरों को 5 दिनों के लिए मध्यम संस्कृति में निम्नलिखित ऊष्मायन समाप्त होगा.

चित्रा 1

चित्रा 2
चित्रा 2. रक्त के नमूनों के से सीटीसी अलगाव के प्रतिनिधि डेटा एक स्तन कैंसर के रोगी और फेफड़ों के कैंसर रोगी से तैयार है. व्यवहार्य सकारात्मक पहचान के रूप में सीटीसी EpCAM धुंधला के आधार पर कोशिकाओं की संख्या ठोस सलाखों और बाएँ तालमेल और कोशिकाओं है कि पहचान की गई प्रतिशत से संबंधित द्वारा प्रतिनिधित्व किया है के रूप में सीटीसी पर कब्जा कर लिया कोशिकाओं की कुल संख्या की तुलना में खुला सलाखों के द्वारा प्रतिनिधित्व किया है और सही तालमेल पर मापा जाता है. परिणाम संस्कृति में पांच दिन का अनुसरण कर रहे हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. सीटीसी अलग (ए और बी) संस्कृति में 5 दिनों के बाद दाताओं isolati से प्रतिनिधि micrographsएक कैंसर रोगी के रक्त के नमूने से. कोशिकाओं fluorescently 488 AlexaFluor (हरा) और 4 ',6-diamidino-2 phenylindole (DAPI) के साथ थे EpCAM के लिए दाग नाभिक (नीला) कल्पना.

Discussion

यह अक्सर मामला है कि नए कैंसर चिकित्सा विज्ञान की खोज में जल्दी कदम कैंसर कोशिका लाइनों, जो प्राथमिक कैंसर की कोशिकाओं को संदिग्ध सादृश्य भालू का उपयोग अभी तक प्रयोगशाला में उपयोग के अपने आसानी के कारण का उपयोग में रहते है. नए कैंसर के उपचारों के विकास में अनुसंधान अगर प्राथमिक मानव कैंसर कोशिकाओं उपन्यास शोध के शुरू में उपयोग किया गया शीघ्र किया जाएगा. सीटीसी कैंसर कोशिका की सबसे आसानी से सुलभ प्रकार, जिससे रक्त में इनकी उपस्थिति और एक मानक रक्त ड्रॉ की आसानी के कारण कर रहे हैं. इसके अलावा, ट्यूमर कोशिकाओं परिसंचारी 5,6 मेटास्टेसिस की प्रक्रिया में एक आवश्यक कदम का प्रतिनिधित्व करते हैं, तो उनके रोग और नई दवाओं को लक्षित करने के लिए उपयोगिता के लिए प्रासंगिक स्पष्ट है. सीटीसी इन विट्रो में खून से अलगाव उनके कम मात्रा द्वारा जटिल है: प्रति एक लाख leukocytes या एक अरब 7 एरिथ्रोसाइट्स प्रति के आदेश पर. रक्त में सीटीसी का पता लगाने के केवल तकनीक एफडीए को मंजूरी दी सेल सहित, के लिए मौजूदा तरीकों के बहुमत खोज (Veridex) क्षति, या पता लगाने की प्रक्रिया में कोशिकाओं को नष्ट करने के लिए, गणना से परे उपयोग precluding. विधि सेल व्यवहार्यता समझौता नहीं ऊपर वर्णित है और इस तरह कैंसर पर भविष्य नैदानिक ​​अनुसंधान के लिए दरवाजे खोलता है. बरकरार कोशिकाओं की वसूली के रूप में इस तकनीक का लक्ष्य है, यह जरूरी है कि कोशिकाओं को रक्त जुदाई चरणों के दौरान विशेष रूप से, ध्यान से संभाला जा है.

वहाँ है कि कैंसर के प्रकार के रूप में महत्वपूर्ण विशेषताओं के आधार पर सुधार उपज प्राप्त करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है इस प्रणाली में ट्यून करने योग्य मानकों के एक नंबर रहे हैं. ऊपर वर्णित चरणों में, हम जब प्रोस्टेट कैंसर के नमूने के प्रसंस्करण को छोड़कर सभी प्रकार के कैंसर के लिए एक CTC-विशिष्ट एंटीबॉडी के रूप में EpCAM उपयोग करने के लिए, जिसमें विरोधी PSMA इस्तेमाल किया गया था चुना था. कैंसर विशिष्ट एंटीबॉडी के आगे substitutions निश्चित रूप से व्यक्ति के रोगियों के लिए प्रदर्शन में सुधार किया जा सकता है. इसके अलावा, selectin और प्रतिरक्षी सांद्रता 8 कब्जा बढ़ाने के लिए बदल सकता है.

"> डिवाइस का एक अनिवार्य विशेषता सतह पर ई selectin अणुओं का समावेश ई selectin है. आम तौर पर endothelial कोशिकाओं और सूजन की साइटों के लिए तेजी से बढ़ leukocytes भर्ती समारोह की luminal सतह पर व्यक्त की है. की ओर बहने वाली leukocytes transiently बाँध selectin अणु, एक धीमी, रोलिंग व्यवहार है कि धीमी और मजबूत सेल की integrins द्वारा endothelium के लिए बाध्य की सुविधा में जिसके परिणामस्वरूप. कायल प्रयोगात्मक सबूत मौजूद है कि मामला है कि सीटीसी एक समान 9,10 तंत्र द्वारा बहना कर सकते हैं बनाता है selectin का समावेश भी है. युक्ति अधिक प्रवाह दरों पर संचालित करने के लिए अनुमति देता है, दर है कि अन्यथा 11 एंटीबॉडी के लिए बाध्य करने से कोशिकाओं को रोका जा सके. इस प्रकार हमारे युक्ति physiologically biomimetically सेलुलर चोट inflicting के बिना सीटीसी बह कब्जा venule mimics है.

बढ़ी युक्ति प्रदर्शन halloysite नैनोट्यूब कोटिंग की luminal सतह के लिए इसके अलावा करने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता हैडिवाइस के. पिछले अध्ययनों से पता चला है कि वहाँ नैनोट्यूब कोटिंग है कि बेहतर कार्यक्षमता के लिए अनुमति देता है के तीन प्रमुख घटक हैं. सबसे पहले, नैनोट्यूब कोटिंग बढ़ सतह क्षेत्र प्रदान करता है, सतह 4 पर अधिक से अधिक प्रोटीन बयान के लिए अनुमति देता है. दूसरा, हम नैनोट्यूब कोटिंग पर परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन में निर्धारित किया है कि व्यक्तिगत नैनोट्यूब प्रवाह में सतह से बहर. यह selectin अणुओं को सतह से ऊपर के रूप में ज्यादा के रूप में एक माइक्रोन प्रस्तुत किया ताकि कोशिकाओं और कब्जा कर लिया जा सकता है की सतह के लिए 4 ट्यूब के माध्यम से पहले उनके प्रक्षेपवक्र में भर्ती की अनुमति देता है. अंत में, halloysite नैनोट्यूब कोटिंग करने के लिए ल्युकोसैट आसंजन को रोकने के लिए और सतह पर फैल, सीटीसी के साथ कब्जा कर लिया leukocytes के एक कम संख्या के लिए अनुमति देता है और इस प्रकार अधिक से अधिक बाद सीटीसी 3 purities करने में सक्षम है.

Disclosures

MRK CellTraffix इंक, (Rochester, NY) के एक वैज्ञानिक सलाहकार है.

Acknowledgments

वर्णित काम Microenvironment और राष्ट्रीय कैंसर संस्थान से पुरस्कार U54CA143876 संख्या के माध्यम से मेटास्टेसिस पर कॉर्नेल केंद्र द्वारा समर्थित किया गया. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और राष्ट्रीय कैंसर संस्थान या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचार जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व करते हैं. इस काम के अतिरिक्त एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप (ADH) द्वारा भाग में वित्त पोषित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
300 um ID tubing Braintree Scientific, Inc. MRE025
Larger tubing for connection to syringe IDEX Health Science 1507L
5mL syringe for pump BD Biosciences 309603
Connector small to large tubing IDEX Health Science P-770
Connector large tubing to syringe IDEX Health Science F-120 and P-659
Syringe for microtube (3/10cc Insulin Syringe U-100 29G 1/2') BD Biosciences 309301
Accutase MP Biomedicals LLC 1000449
Ficol-Paque Plus GE Healthcare Bio-Sciences AB 17-1440-03
RBC Lysis Buffer (Buffer EL, 1000mL) Qiagen 1014614
Protein G, 5 mg CalBiochem (calbiochem.com) 539303
Human EpCAM/TROP-1 Antibody R&D Systems MAB960
PSMA Antibody (GCP-04) Abcam ab66911
96 well plates (Microtest 96) BD Biosciences 35-3072
Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk, 300g Bio-Rad 216005508
Halloysite Nanotubes NaturalNano NN-HNT200
Calcium Carbonate, 5g Aldrich Chemistry 481807
rhE-Selectin/Fc Chimera, 100 ug R&D Systems 724-ES
RPMI Medium 1640 GIBCO, by Life Technologies 22400-089
DPBS GIBCO, by Life Technologies 14190-095
Poly-L lysine 0.1% w/v in water Sigma-Aldrich P8920-100ML
Sonic Dismembrator Fisher Scientific Model 100
Fetal Bovine Serum Atlanta Biochemicals S11056H
Penicillin Streptomycin Sigma Life Siiences P0781

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References

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