환자의 혈액 샘플에서 가능한 순환 종양 세포의 신속한 분리

Bioengineering
 

Summary

순환 종양 세포는 세포 손상을 보면서 겁에 질리게하지 않고 암 환자의 혈액으로부터 격리됩니다. 종양 세포의 분리는 상피 마커에 대한 항체 이외에 E-selectin의 bimolecular 표면을 사용하여 수행됩니다. 나노튜브 코팅은 특별히 높은 캡처 purities 결과 암 세포 접착을 촉진합니다.

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Hughes, A. D., Mattison, J., Powderly, J. D., Greene, B. T., King, M. R. Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples. J. Vis. Exp. (64), e4248, doi:10.3791/4248 (2012).

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Abstract

순환 종양 세포 (CTC)는 순환 시스템 전반에 걸쳐 주요 종양에서 배포하며 궁극적으로 멀리 떨어져있는 장소에서 이차 종양을 형성할 수있는 세포입니다. CTC 개수는 혈액과 질병 심각도 1의 CTC 농도 간의 상관 관계를 기반으로 질병의 진행을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 치료 도구로서 CTC는 맞춤 치료법을 개발하는 연구실에서 공부를 할 수 있습니다. 이를 위해 CTC 분리가 더 세포 손상, 특히 다른 세포 유형, leukocytes에 의한 오염을 일으키지 말고해야 가능한 한 많이이 같은 피해야한다. CTC 열거를위한 유일한 FDA의 승인을 장치를 포함하여 현재 기술의 대부분은, (자세한 내용은 참조. 2 참조) 격리 프로세스의 일부로 CTC를 파괴. 가능한 CTC를 캡처 microfluidic 장치는 상피 마커 3에 대한 항체 이외에 E-selectin 당단백질으로 기능화 표면으로 구성된, 설명되어 있습니다. 장치 perfor을 강화하려면nanoparticle 코팅을 mance은 핼로이사이트 나노튜브, 점토 4에서 수확 aluminosilicate nanoparticle 구성된 적용되었습니다. E-selectin 분자 대안 microfluidic 장치 이상의 장점은 더 이상 처리 시간이 표면과 상호 작용하는 데 충분한 시간과 표적 세포를 제공할 필요했었습니다 대출 장치를 통해 펌핑되어 빠르게 이동 CTC를 캡처하기위한 수단을 제공합니다. 상피 표적에 대한 항체가 아니라 격리를 조정하기 쉽게 조절 가능한 파라미터를 제공하므로, 장치에 CTC-특이성을 제공합니다. 마지막으로, 핼로이사이트 나노튜브 코팅은 크게 강화된 절연은 빠르게 움직이는 세포를 캡처하도록 돕는 단백질 흡착을위한 증가된 표면적을 제공하고, 오염 leukocytes에게 3,4를 repelling하여 다른 기술에 비해 수 있습니다. 이 장치는 재고품의 소재를 사용하여 직접적인 기술에 의해 생산되고, 성공적으로 전이성의 혈액에서 암 세포를 캡처하는 데 사용되었습니다암 환자. 캡처한 세포 분리에 따라 문화가 15 일에 유지하며, 이러한 샘플은 일반적으로 각 환자의> 50 % 가능한 일차 암 세포로 구성되어있다. 이 장치는 희석 전체 혈액과 버피 코트 시료 모두에서 실행 가능한 CTC를 캡처하는 데 사용되었습니다. 궁극적으로, 우리는 맞춤형 암 치료법을 개발하기 위해 임상 환경에서 기능과 기술을 제시한다.

Protocol

다음 프로토콜은 하나의 microtube 장치의 생산을위한 것입니다.

1. 핼로이사이트 나노튜브 솔루션의 작성

  1. Sonicate (10-13 W (RMS)) 250 μL 핼로이사이트 나노튜브 용액 (물 6.6 wt %)를 30 초. 일단 찬물를 반복 sonication과 쿨 솔루션입니다. 또 시원한 시간을 보내세요.
  2. 주사기로 sonicated 솔루션을 그려, 0.45 μm의 주사기 필터를 장착하고, 깨끗한 microfuge 튜브에 필터 솔루션입니다. 균질성 유지를 위해 때때로 소용돌이 솔루션입니다.

2. 핼로이사이트 나노튜브와 Microtube 내부 표면의 코팅

  1. 50cm에게 마이크로 Renathane microtubing 오랜 섹션 (300 μm의 내경, 35.3 μL 내부 볼륨)을 구합니다. 대각선에서 microtube의 한쪽 끝을 잘라 작은 IDEX 어댑터 부분에 삽입합니다. microtube의 다른 쪽 끝을으로 10분의 3 CC 29G 주사기 바늘을 삽입합니다.
  2. microtube를 청소하려면 microtube의 열린 끝을 (최종 배치어댑터 포함) 70 % 에탄올과 추첨으로 ~ 주사기로 50 μL 에탄올은 microtube를 채울 수 있습니다.
  3. 주사기로 증류수의 풍부한 볼륨을 그림으로써 microtube의 여지없이 에탄올을 씻어.
  4. microtube에서 주사기를 분리, 주사기를 비울 다음 microtube에 다시 첨부.
  5. 0.02 % 물에 W / V 폴리-L 라이신의 솔루션을 준비합니다. microtube에 50 μL를 그려 및 실온 (RT)에서 5 분 동안 앉을 수 있습니다.
  6. microtube에 100 μL 여과 나노튜브 솔루션을 그리기 및 RT에서 3 분 동안 품어 수 있습니다.
  7. 나노튜브 용액을 헹굴 수있는 microtube를 통해 100 μL 물을 긷다. RT에서 밤새, 물 가득, 앉으 코팅 microtube를 허용합니다.

3. 세포 분리를위한 Microtubes의 작성

  1. 1X Dulbecco의 인산 10 μg / ML 단백질 G의 솔루션을 준비는 (- 7.2 PBS, 산도 7.0) 염분 버퍼. microtube를 통해 50 μL PBS를 그려 후 50 μL를 그려단백질-G 솔루션과 RT에서 1.5 시간 동안 품어 수 있습니다.
  2. 5 μg / ML E-selectin-IgG와 PBS에서 50 μg / ML 항체 (대부분의 암 샘플, 안티 PSMA 전립선 암 샘플 안티 EpCAM)를 포함하는 솔루션을 준비합니다. microtube에 E-selectin과 항체 용액 50 μL를 그려 및 RT에서 2 시간 동안 품어 수 있습니다.
  3. 특이 현상이 세포 접착은 5 %의 우유 단백질로 차단됩니다. 5% (W / V) PBS의 우유 단백질의 솔루션을 준비합니다. microtube에 50 μL 우유 단백질 솔루션을 그리기 및 RT에서 1 시간 동안 품어 수 있습니다.
  4. 튜브에 50 μL PBS를 그려과 혈액이나 버피 코트 샘플들이 처리를위한 준비가 될 때까지 RT에 둡니다.
  5. 이전의 고립을 위해 microtube를 사용하여 최대 10 분, selectin 분자를 활성화하기 위해 칼슘 2 + ( "PBS +")로 포화되어 50 μL PBS를 그립니다.

4. 세포 분리를위한 샘플 준비

  1. 환자에서 heparinized로 10 ML 혈액을 그리기 또는 취득튜브.
  2. 50 ML 원심 튜브에 장소 10 ML Ficoll-Paque 림프구 절연 솔루션입니다. Ficoll 위에 부드럽게 층 10 ML 전체 혈액, 너무 혈액과 Ficoll를 섞어 없습니다.
  3. ° C에서 최소한의 감속 4 개의 15 분 2000x g에서 원심 분리기.
  4. 새로운 튜브 버피 코트 레이어와 장소를 제거합니다.
  5. PBS로 씻으 버피 코트 (10 분 230x g에서 원심 분리기, 뜨는을 버리고).
  6. 부드럽게 한 ML RBC의 용해 완충액으로 세포를 resuspend하고 적혈구를 lyse 위해 RT에서 10 분 동안 품어.
  7. 10 ML PBS, 부드럽게 섞어, 10 분 230x g에서 원심 분리기를 추가합니다. 뜨는을 취소하고 부드럽게 4 ML PBS +로 3 펠렛을 resuspend.

5. 세포 분리

  1. IDEX 어댑터를 사용하여 5 ML에 주사기로 작용 microtube의 한쪽 끝을 연결합니다.
  2. 주사기 펌프에 주사기를 삽입합니다.
  3. 세포 suspensio로 잠수함 작용 microtube의 열린 끝을N.
  4. 1-4 ML / H의 microtube를 통해 세포 현탁액을 처리합니다.
  5. PBS가 들어있는 튜브에 microtube의 열린 끝을 전송 +와 microtube에서 언바운드과 느슨하게 묶인 세포를 제거하는 0.016 ML / 분에서 주사기로 300 μL PBS +를 그립니다.
  6. 깨끗한 튜브에 microtube의 열린 끝을 놓으십시오. microtube에서 주사기를 분리하고 Accutase 함께 prefilled 주사기를 첨부합니다. 부드럽게 채울 microtube (~ 50 μL)로 충분한 Accutase을 perfuse 10 분 RT에서 품어 수 있습니다.
  7. 수집, microtube 개를 1 성장 미디어의 ML (79 % RPMI, 20 % FBS, 1 % 페니실린의 스트렙토 마이신)과 perfuse 함께 prefilled 주사기를 첨부하여 조직 문화에 대한 방류수는 플레이트 잘 취급.
  8. 37 문화 세포 ° C와 humidified 조건 하에서 5퍼센트 CO 2.

6. 대표 결과

이 기법의 목적은 암 환자의 혈액에서 가능한 암 세포를 분리하는 것입니다. 방법은 여러 문화에 암세포를 식별하는 존재, 장치의 성공 필수 확인합니다. 우리는 그대로 세포 핵 (그림 2 및 3)을 식별하기 위해 DAPI 이외에 같은 EpCAM (상피 세포 유착 분자) 또는 PSMA (전립선 특정 막 항원)와 같은 상피 moieties에 대한 항체와 문화의 세포를 얼룩을 선택하셨습니다. 암 세포의 숫자는이 기술을 사용하면 필연적으로 시작하는 샘플에서 CTCs의 개수의 함수이며, 환자 다양성이 높은가 될 수 캡처. 단계 IV는 암 진단을 환자에서 가져온 샘플을 처리에서 우리는 정기적으로 purities에서 혈액 튜브 당 100 사이 500 암세포,> 50 %를 캡처. 즉시 격리 따라 오염 leukocytes의 큰 숫자가 나타날 수 있습니다. 그러나이 숫자는 최대 5 일 동안 배지에서 다음과 인큐베이션을 고갈됩니다.

그림 1

그림 2
그림 2. 혈액 샘플에서 CTC 절연 대표 데이터는 유방암 환자 및 폐암 환자에서 가져온. CTC는 EpCAM의 염색법을 바탕으로 적극적으로 식별 가능한 세포의 수는 CTC가 촬영한 세포의 총수에 비해 고체 바 왼쪽 종좌표 및 확인되었습니다 세포의 비율과 관련된 대변하는 열린 막대로 표시되며 오른쪽 종좌표을 측정했습니다. 결과 문화 5 일 따르고 있습니다.

그림 3
isolati에 오일 후속 문화 CTC 별도의 기증자 (A와 B)에서 그림 3. 대표 micrographs암 환자 혈액 채취부터. 세포 fluorescently 핵 (파란색)를 시각화하는 AlexaFluor 488 (녹색) 및 4 ', 6 diamidino-2-phenylindole (DAPI)로 EpCAM위한 물들어 있었다.

Discussion

그것은 종종 새로운 암 치료제의 발견의 초기 단계 기본 암세포로 의심 비슷할 암 세포 라인은 아직 실험실에서 사용하기 자신의 용이성으로 인해 사용에 남아 활용하는 경우가 있습니다. 기본 인간의 암 세포가 초기 소설 연구에 이용 하였다한다면 새로운 암 치료법의 개발에 연구가 빠른 것이다. CTC는 혈액에 존재하는 표준 혈액 추첨의 용이성으로 인해 암 세포의 가장 쉽게 접근 유형입니다. 또한, 순환 종양 세포 전이 5,6의 과정에 필요한 단계를 대표하는, 그래서 새로운 약물을 타겟팅 질환과 유틸리티들의 타당성이 분명하다. 체외에서 혈액에서 CTC의 격리들은 낮은 농도에 의해 복잡 하나 넘지 leukocytes 또는 적혈구 억 7 당 하나의 주문. 유일하게 FDA 승인 기법 전지를 포함한 혈액에 CTC를 감지를위한 현재의 방법 중 대다수 검색 (Veridex), 손상 또는 열거 이상 사용을 precluding, 검색 과정에서 세포를 파괴. 방법은 세포 생존 능력을 손상하지 않는 위에서 설명한 때문에 암에 대한 향후 임상 연구에 문을 엽니다. 그대로 세포의 회복이이 기술의 목표이기 때문에, 그것은 세포, 특히 혈액 분리 단계 동안에 신경을 써서 처리하는 것이 필수적입니다.

이러한 암 유형으로 중요한 특성에 따라 향상된 수율을 달성하기 위해 변경될 수있는이 시스템에 조율할 수있는 매개 변수의 숫자가 있습니다. 위에서 설명한 단계에서 우리는 안티 PSMA가 사용되었습니다 궁극적으로 전립선암 샘플을 처리할 때 제외한 모든 암 종류에 CTC 특정 항체로 EpCAM을 사용하도록 선택했습니다. 암 관련 항체의 추가 요구 사항은 물론 개별 환자에 대한 성능을 향상시키기 위해 사용될 수 있습니다. 또한, selectin 및 항체 농도는 캡처 8을 강화하기 위해 변경할 수 있습니다.

"> 장치의 필수적인 기능은 표면에 E-selectin 분자의 결합입니다. E-selectin은 정상적 내피 세포와 염증의 사이트로 빠르게 이동 leukocytes를 모집하기위한 함수의 luminal 표면에 표시됩니다. 흐르는 leukocytes가로 transiently 바인딩 integrins에 의한 내피로 세포의 느린 강한 구속력을 용이하게 느린, 압연 행동의 결과로 selectin 분자. 설득력 실험적 증거는 CTC는 유사한 메커니즘 9,10하여 extravasate 수있는 케이스를 만들어 그 존재합니다. selectin의 포함도 장치가 큰 유동 속도로 운항 할 수 있고, 달리 항체 11 바인딩에서 세포를 막을 요금. 그러므로 우리 장치는 생리학 biomimetically 세포 부상을 보면서 겁에 질리게하지 않고 CTC 흐르는 캡처할 venule을 모방한 것이었 지요.

향상된 장치 성능 luminal 표면 핼로이사이트 나노튜브 코팅의 추가에 의한 것이장치. 이전 연구는 향상된 기능을 허용 나노튜브 코팅의 세 가지 주요 구성 요소가있다는 것을 보여주었다. 먼저, 나노튜브 코팅 표면 4 향해 큰 단백질 증착 수있게 증가 표면적을 제공합니다. 둘째, 나노튜브 코팅에 원자 힘 현미경을 수행으로 우리는 각각의 나노튜브는 흐름으로 표면에서 밀려 나다 것으로 확인되었습니다. 이것은 세포가 튜브 1-4 캡처 및 이전 그들의 궤도에서 표면으로 채용 수 있도록 selectin 분자가 표면 위의만큼 하나 마이크론를 발표 수 있습니다. 마지막으로, 핼로이사이트 나노튜브 코팅은 백혈구 유착을 방지하고 CTC와 함께 촬영한 leukocytes의 감면 번호 있도록 표면에 퍼져 있으며 따라서 더 많은 후속 CTC의 purities 3 수 있습니다.

Disclosures

MRK는 CellTraffix 주식 회사 (로체스터, NY)의 과학 고문이다.

Acknowledgments

설명 작품은 국립 암 연구소에서 보너스 번호 U54CA143876 통해 Microenvironment 및 전이에 코넬 센터에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 암 연구소 또는 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다. 이 작품은 또한 국립 과학 재단 대학원 연구 원정대 (ADH)에 의해 부분적으로 재정 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
300 um ID tubing Braintree Scientific, Inc. MRE025
Larger tubing for connection to syringe IDEX Health Science 1507L
5mL syringe for pump BD Biosciences 309603
Connector small to large tubing IDEX Health Science P-770
Connector large tubing to syringe IDEX Health Science F-120 and P-659
Syringe for microtube (3/10cc Insulin Syringe U-100 29G 1/2') BD Biosciences 309301
Accutase MP Biomedicals LLC 1000449
Ficol-Paque Plus GE Healthcare Bio-Sciences AB 17-1440-03
RBC Lysis Buffer (Buffer EL, 1000mL) Qiagen 1014614
Protein G, 5 mg CalBiochem (calbiochem.com) 539303
Human EpCAM/TROP-1 Antibody R&D Systems MAB960
PSMA Antibody (GCP-04) Abcam ab66911
96 well plates (Microtest 96) BD Biosciences 35-3072
Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk, 300g Bio-Rad 216005508
Halloysite Nanotubes NaturalNano NN-HNT200
Calcium Carbonate, 5g Aldrich Chemistry 481807
rhE-Selectin/Fc Chimera, 100 ug R&D Systems 724-ES
RPMI Medium 1640 GIBCO, by Life Technologies 22400-089
DPBS GIBCO, by Life Technologies 14190-095
Poly-L lysine 0.1% w/v in water Sigma-Aldrich P8920-100ML
Sonic Dismembrator Fisher Scientific Model 100
Fetal Bovine Serum Atlanta Biochemicals S11056H
Penicillin Streptomycin Sigma Life Siiences P0781

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References

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