Exploring arteriellen glatten Muskelzellen KV7 Kalium Kanal Funktion mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Druck Myographie

Published 9/14/2012
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Biology

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Summary

Messungen der KV7 (KCNQ) Kaliumkanal-Aktivität in isolierten arteriellen Myozyten (mit Patch-Clamp-elektrophysiologischen Techniken) parallel mit Messungen constrictor / Dilatator Antworten (mit Druck Myographie) können wichtige Informationen über die Rolle von KV7 Kanäle in vaskulären glatten Muskelzellen Physiologie offenbaren und Pharmakologie.

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Brueggemann, L. I., Mani, B. K., Haick, J., Byron, K. L. Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography. J. Vis. Exp. (67), e4263, doi:10.3791/4263 (2012).

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Abstract

Kontraktion oder Entspannung der glatten Muskelzellen in den Wänden von Arterien Widerstand bestimmt die Gefäßdurchmesser und steuert dadurch Blutfluss durch das Gefäß und trägt zur systemischen Blutdrucks. Die Kontraktion Verfahren wird vor allem durch cytosolische Calcium-Konzentration ([Ca2 +] cyt), die ihrerseits durch eine Vielzahl von Ionen-Transporter und Kanäle gesteuert ist geregelt. Ionenkanäle sind gemeinsame Zwischenstufen in Signaltransduktionswegen durch vasoaktive Hormone aktiviert, um Vasokonstriktion oder Vasodilatation bewirken. Und Ionenkanäle werden oft von Therapeutika entweder absichtlich (z. B. Calcium-Kanal-Blocker zur Gefäßerweiterung und Blutdrucksenkung induzieren) oder unabsichtlich (zB zu unerwünschten kardiovaskulären Nebenwirkungen induzieren) ausgerichtet.

KV7 (KCNQ) spannungsgesteuerten Kaliumkanäle sind kürzlich als wichtige physiologische und therapeutische targ verwickeltets für die Regulierung der Kontraktion der glatten Muskulatur. Um die spezifischen Rollen von KV7 Kanäle sowohl physiologische Signaltransduktion und in den Aktionen von therapeutischen Wirkstoffen aufzuklären, müssen wir untersuchen, wie ihre Tätigkeit moduliert wird auf zellulärer Ebene sowie die Auswertung ihren Beitrag im Rahmen des intakten Arterie.

Die Ratte Mesenterialarterien ein nützliches Modellsystem. Die Arterien können leicht zerlegt werden, von Bindegewebe gereinigt und verwendet, um isolierten arteriellen Myozyten für Patch-Clamp-Elektrophysiologie vorzubereiten oder kanüliert und unter Druck zur Messung von Vasokonstriktor / Vasodilatator Reaktionen unter relativ physiologischen Bedingungen. Hier beschreiben wir die Methoden für beide Arten von Messungen verwendet und bieten einige Beispiele, wie das experimentelle Design integriert, um ein klareres Verständnis der Rollen dieser Ionenkanäle in der Regulation des Gefäßtonus bereitzustellen.

Protocol

Ein. Chirurgische Exzision des Dünndarms Mesenteriale Vascular Arcade

  1. Anesthetize eine 300-400 g Sprague-Dawley Ratten mit Isofluran (4%) durch Inhalation verabreicht.
  2. Führen Sie eine Mittellinie Laparotomie den Dünndarm Mesenterium aussetzen. Exteriorisieren den Dünn-und Dickdarm durch den Bauchschnitt mit großer Sorgfalt zu Trauma für den Darm und exponierten Mesenteriums vermeiden. Gently fächern das Mesenterium sich über steriler Gaze.
  3. Chirurgisch Verbrauchsteuern der Dünndarm und ein Teil des Dickdarms, einschließlich der Blinddarm (Blutgefäße vorsichtig entlang den Rändern und an den Ursprüngen von den primären Zweige der A. mesenterica superior / Richtung gesägt).
  4. Übertragen Sie das herausgeschnittene Gewebe in ein Becherglas mit eiskaltem Sezieren Lösung (Tabelle 1).
  5. Nach Entfernung des Darms, sollte die Ratte human eingeschläfert werden, während unter Anästhesie.

2. Dissection eind Reinigung der Arterien

  1. Übertragen Sie die ausgeschnittenen Darm und mesenterialen arcade zu einer gekühlten Sezieren Kammer (4-5 ° C) mit Sezieren Lösung. Die Kammer besteht aus einem 100-mm-Glas Petrischale mit einer SYLGARD 184 Elastomergrundlage zu Sezieren Stifte unterzubringen; die Petrischale wird in einem gekühlten Basis, die bei 4-5 ° C durch ein zirkulierendes Wasserbad gehalten wurde.
  2. Mit chirurgische Schere ein etwa 10-12 cm Segment aus dem ganzen Darm. Schneiden Sie an jedem Ende des Dünndarmsegment Beibehaltung seiner Gefäßsystem angeschlossen, und entfernen Sie dann die ungenutzten Darm aus der Kammer Verlassen der ein Segment mit seinen angeschlossenen Gefäßsystem (mesenterialen arcade) in Isolation.
  3. Festzunageln das Segment des Dünndarms, die Verbreitung des Mesenterium über dem nahen Seite der Kammer, so dass die primäre Zweig der A. mesenterica superior / Vene in der Mitte und die Nachbestellung von Niederlassungen strahlt vom Zentrum (Abbildung 1). Pl ace die Stifte nur auf den Darmabschnitte (nicht auf die Blutgefäße).
  4. Unterscheiden Arterien von Venen durch ihre relativ leuchtend rote Farbe, dicken Wänden und charakteristische V-förmige Verzweigungen anstelle der U-förmige Verzweigungen in Adern gesehen.
  5. Visualisierung durch eine beleuchtete Seziermikroskop, sorgfältig deaktivieren Sie das Fettgewebe und das Bindegewebe um die 2 nd - 4. Ordnung Arterien in der Nähe der Darm (gestrichelte Kreis in Abbildung 1) mit Mikro Pinzette und Schere. Halten Sie die benachbarten Venen erleichtert das Löschen des Fettgewebes und des Bindegewebes. Vermeiden Sie unnötige Dehnung der Arterien.
  6. Mesenterica Segmenten des Bindegewebes gelöscht kann dann zerlegt werden und für Zellisolation (für Single-Cell-Patch-Clamp-Untersuchungen, § § 3-4) oder eine Kanüle für Druck Myographie (Abschnitt 5). Cut Segmente zwischen Verzweigungspunkte, in der Regel bis zu 1 cm in der Länge.
jove_title "> 3. Zellisolation für Patch Clamp Untersuchungen

  1. Bereiten Sie 0,5 l Isolation Solution (Tabelle 1) und teilen sie in 2 Portionen vor der Einstellung des pH-Wertes. Der erste Abschnitt (üblicherweise 100 ml) sollen bis zu 37 ° C erwärmt werden sollte und pH auf 7,2 bei 37 ° C eingestellt werden (37 ° C Isolation Solution). Der zweite Abschnitt der Isolierung Lösung sollte auf 4 ° C abgekühlt werden und der pH auf 7,2 bei 4 ° C (Eiskalte Isolation Solution) eingestellt werden. Nach pH-Einstellung müssen die Osmolarität der beiden Lösungen so angepasst werden mOsm durch Zugabe einer entsprechenden Menge an D-Glucose oder H 2 O 298 werden
  2. Übertragen 2 ml von 37 ° C Isolation Lösung zu einem Glasfläschchen und bei 37 ° C für den Einsatz in Schritt 3.4. Hinzufügen 20 mg Rinderserumalbumin (BSA) und 10 ml 37 ° C Isolation Solution, aufzulösen, wieder auf 37 ° C und justieren Sie den pH-Wert auf 7,2. Zu 2 ml dieser Lösung hinzufügen 4 mg Collagenase Typ VIII (Sigma, Lot 089K8612: 633 uNissen / mg Collagenase Aktivität, 285 Einheiten / mg Caseinase Aktivität, 1,6 Einheiten / mg Clostripain-Aktivität), 0,64 mg Elastase Typ IV (Sigma, Lot 110M7025V 5,9 Einheiten / mg; fügen 40 ul einer 16 mg / ml Stammlösung in 37 ° C Isolation Solution) und 2 ul 1 M DL-Dithiothreitol (DTT Sigma); Vorwärmen dieser Enzymlösung bis 37 ° C in der Vorbereitung für Schritt 3,5.
  3. Übertragen 2-3 Segmente der A. mesenterica in eine 35-mm-Gewebe-Kulturschale mit 2 ml Ice Cold Isolation Lösung und die Schale auf Eis. Cut A. mesenterica Segmente in 3-4 mm lange Stücke.
  4. Mit einer Pasteurpipette mit Feuer polierte Spitze (um eine Beschädigung der Arterien) übertragen die arterielle Segmente in einem Glasfläschchen (15 x 45 mm, 1 dram) mit 2 ml vorgewärmten 37 ° C Isolation Lösung und Inkubation für 30 min bei 37 ° C.
  5. Nach 30 min, sorgfältig absaugen 37 ° C Isolation Lösung mit einer Pasteurpipette, 2 ml warme Enzymlösung inkubieren 35 minbei 37 ° C.
  6. Unmittelbar nach der 35 min Inkubation in der Enzymlösung, die Küvette auf Eis absaugen Enzymlösung und 2 ml Ice Cold Isolation Solution (repeat Aspiration und Zugabe von frischem Ice Cold Isolation Solution 4 mal). Dann, in einem Volumen von 1 ml eiskaltem Isolation Lösung, sanft verreiben arterielle Segmente mit den polierten Pasteurpipette 10-20 mal auf einzelne mesenterica glatten Muskelzellen (MASMCs) freizugeben.
  7. Regelmäßig zu überprüfen Myozyten Erscheinungsbild, indem ein Tropfen der Zellsuspension bei einer 35-mm-Schale und Betrachten unter dem Mikroskop. Gesunde MASMCs sollte eine glatte gestreckter erscheinen. Nicht alle der Zellen in der Arterienwand freigeschaltet. Die Zellsuspension auf Eis gehalten werden.
  8. Ein weiterer nützlicher Indikator für MASMC Gesundheit ist ihre Toleranz physiologischer Ca 2 +-Konzentrationen. Füllen Aufnahme Kammer (Bioscience Tools, # CSC-25L) mit Bad slösung mit 2 mM CaCl 2 (pH 7,3 bei Raumtemperatur (RT), Zusammensetzung siehe Tabelle 1) und Standpunkt Agar Brücke (gebogenes Glas mit 2% Agar in 2 M KCl gefüllte Kapillare, eingefügt in die Bezugselektrode (Warner Instrument, REF -3L)) im Inneren der Kammer. Mit der polierten Pasteur Pipette ca. 100-200 ul Zellsuspension auf eine Aufnahme Kammer und damit die Zellen für 15 min halten. Unbeschädigten Zellen sollten nicht wesentlich zusammenzuziehen in 2 mM CaCl 2-haltigen Lösung (Zellen sollten erscheinen längliche oder stabförmige, nicht bis zu Kugeln gerundet).
  9. Nach Zugabe des ersten Aliquot der Zellsuspension zur Aufnahme Kammer, 0,25 ml Badlösung mit 2 mM CaCl 2 sollte zur verbleibenden Menge an Zellsuspension zugegeben werden. Diese verbleibenden Zellsuspension kann bei dieser Lösung auf Eis gehalten werden und für Patch-Clamp-Aufnahme für bis zu 6 Stunden.

4.Verwendung von Whole Cell Patch Clamp um KV7 Kalium Ströme oder Membrane Spannung messen

  1. Nach Myozyten auf das Glas Basis der Aufnahme Kammer (25-mm Nr. 1 Runde Deckglas, Warner Instruments) haften, zu initiieren kontinuierliche Perfusion der Badlösung (Tabelle 1). Für die Aufnahme von KV7 Ströme in Isolation vom verzögerten Gleichrichter Kalium-Ströme Kv1 und Kv2 Familien sollten die Badlösung mit 100 uM GdCl 3 ergänzt werden.
  2. Fabrizieren Patchpipette aus Borosilikatglas (Kimax-51, Kimble Chase) mit einer Pipette Abzieher und microforge; seinen Widerstand sollte 4-5 MOhm, wenn sie mit internen Lösung (Tabelle 1) gefüllt. Beschichtung der unteren 1/3 der Pipette (~ 1-2 mm über die Spitze) mit SYLGARD 184.
  3. Zum Aufzeichnen von KV7 Ströme in MASMCs sollte die perforierte Ganzzell Patch Voltage-Clamp Technik verwendet werden. Verwendung einer perforierten Patch-Konfiguration hilft depletio verhindernn der Membran Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PIP 2) und die anschließende schnelle (innerhalb von 5 min) heruntergekommenen der KV7 Strömungen, die häufig beobachtet wird mit den herkömmlichen geplatzten Patch-Konfiguration. Ergänzen Sie die interne Lösung (Tabelle 1) mit 120 ug / ml Amphotericin B: add 3 ul 2 mg / ml Brühe von Amphotericin B (hergestellt in DMSO und hielt in kleinen Portionen tiefgefroren und vor Licht geschützt) auf 0,5 ml der internen Lösung. Die Spitze gefüllt der Patch-Pipette mit Amphotericin B-frei interne Lösung durch Eintauchen der Pipettenspitze in der Amphotericin B-freie interne Lösung und dann Anlegen einer Saugwirkung an dem anderen Ende mit einem 10-ml-Spritze über ein Rohrstück (Tygon-R gebunden 3603). Fügen Amphotericin B-haltigen Pipettenlösung von oben mit einer Eppendorf Microloader Pipette Tip, bis die Pipette ist etwa die Hälfte mit Lösung gefüllt. Entfernen Sie alle Luftblasen durch leichtes Antippen der Pipette. Verwenden Sie die Pipette sofort.
  4. Legen Sie die Pipette inzum Elektrodenhalter und Benutzung eines Mikromanipulators auf die Pipette auf die Oberfläche eines länglichen Myozyten (Nähe, aber nicht auf der Oberseite des Kerns, Abbildung 2) zu senken. Wenn der Widerstand in der Pipette 6-10 MOhm erhöht, abgesaugt, um eine Giga-Dichtung (> 10 G &OHgr;) zu erreichen.
  5. Set Haltespannung auf 0 mV während der Wartezeit für Membran Perforation. Übernehmen 100 ms Spannung Schritte bis +10 mV und dann auf -10 mV, verwenden und den Verstärker schnell Pipette Kapazität Transienten zu kompensieren. Gleichzeitig mit dem Erscheinen von ganzen Zellkapazität Transienten, kleine anhaltenden positiven Ströme (üblicherweise 2-10 pA) zeigt die Anwesenheit von funktionellen KV7 Kanäle.
  6. Erfolgreiche Perforation mit Amphotericin B wird der Zugriff Widerstand bis 35 MOhm oder weniger reduzieren. Aktuelle Aufnahme kann dann eingeleitet mit einem 5 sec Spannung Schritt-Protokoll von -4 mV Haltespannung werden. Wir verwenden den -4 mV Haltespannung an nahezu maximalen Inaktivierung von anderen Arten von verzögerten rec erreichenGleichrichter Kaliumströme (überwiegend durch Kv1 und Kv2 Kanäle vermittelt), die ansonsten verschmutzen würden die Aufzeichnung der relativ kleinen, nicht-inaktivierenden KV7 Ströme. Die lang (5 sec.) Spannung Schritt-Protokoll ist erforderlich, um steady-state Aktivierung KV7 Kanäle, die langsam spannungsabhängige Aktivierung und Deaktivierung aufweisen erreichen. Die KV7 Ströme nicht während der Dauerspannung Schritte zu inaktivieren.
  7. Um die KV7 Strom-Spannungs (IV)-Beziehung aufnehmen, gelten 5 sec Spannungsstufen auf Spannungen im Bereich von -84 mV, bei dem die offene Wahrscheinlichkeit KV7 Kanäle minimal ist, um 16 mV bei dem die offene Wahrscheinlichkeit KV7 Kanälen erreicht ein Plateau; nach 5 sec bei jeder Prüfspannung, zurück auf die Haltespannung (-4 mV) für 10 sec. Schritt. Es dauert ca. 3,5 min für die vollständige Reihe von Test-Pulsen (Abbildung 3A). Führen 2-3 Steuerung IV Aufnahmen um sicherzustellen, dass die aufgezeichneten Ströme zeitlich stabiler. Plot durchschnittliche Ende Pulsströme (durchschnittlichStröme für die letzten 1 sec aufgenommen) gegen die Spannung zum Erstellen einer IV-Kurve (Abb. 3D). Die Steuersignale IV-Kurven sollten etwa überlagert werden, wenn die Ströme stabil sind.
  8. Bevor irgendwelche pharmakologische Wirkstoffe zu initiieren einen zeitlichen Verlauf Protokoll entwickelt, um kontinuierlich aufzeichnen bei -20 mV Strom. Sorgen für stabile Aufnahme der Strom für mindestens 5 Minuten vor dem Zulassungsantrag. Übernehmen Sie die pharmakologische Wirkstoffe für 5-15 min oder bis ein steady-state erreicht ist (3C), dann beenden, den zeitlichen Verlauf Protokoll und Datensatz zwei IV-Kurven über die Spannungs-Schritt-Protokoll. Washout der Droge und erfassen den Zeitverlauf der Droge Auswaschen, durch Aufzeichnen von zwei zusätzlichen IV-Kurven folgen.
  9. Am Ende des Experiments 10 uM gelten linopirdine oder 10 uM XE991, irreversible Inhibitoren von KV7 Kanäle; diese Medikamente sollte vollständig hemmen die Ströme bei Spannungen bis -20 mV negativer (3D) aufgezeichnet.

5. Verwendung von Intact Artery Segmente für Druck Myographie

  1. Ein Druck myograph des dänischen Myo Technology (DMT A / S, Dänemark, Modell 110P) erworben wird für den Druck Myographie Experiment verwendet. Montieren der Arterie Segment im Edelstahlkammer durch Einführen des linken Glases horizontal befestigten Kanüle in einem Ende und dem beweglichen rechte Glas Kanüle in das andere Ende. Zwei Druckwandler (P1 auf der rechten und P2 auf der linken Seite) sind integriert, um den Druck innerhalb der Arterie Lumen überwachen. Fluid aus dem rechten Glas Kanüle wird verwendet, um den Druck im Inneren der Arterie zu seiner ungefähren physiologischen Ebene einzustellen. Um zu beginnen, vor Füllen eines offenen 10 ml Spritze (dient als Schwerkraftzuführung Drucksäule) mit Lumen Lösung (Tabelle 1). Heben Sie die Spritze an Lösungen drängendung über Polyethylenschlauch in das rechte Glas Kanüle, wobei darauf zu Luftblasen im Schlauch oder Kanüle zu vermeiden. Die linke Kanüle sollte mit Lumen Lösung über eine 1 ml Spritze vorgefüllt werden. Füllen Sie den Druck myograph Kammer mit 10 ml des Schiffes Badlösung (Tabelle 1). Lose auszusetzen zwei vorgefertigten feinen Nylonnaht auf jeder Seite benachbart zu dem Glas Kanülen.
  2. Sorgfältig präpariert übertragen die A. mesenterica Segment (meist ein 3. oder 4. Ordnung Segment etwa 200 bis 350 um Durchmesser; aus Schritt 2.6) von der Kammer zu dem Sezieren Druck myograph Kammer durch Festhalten an einem Ende des Segments mit Mikro Pinzette.
  3. Visualisierung durch eine beleuchtete Präpariermikroskop Halten eines Endes der Arterie Segment und schieben sie über dem linken Glas Kanüle und sichern das Ende mit Hilfe der Nylonnaht. Vorsichtig spülen Lumenfluid durch die montierte Behälter mit Blut und Schmutz innerhalb des Gefäßes zu entfernen.Das Ventil nach links Spritze ist dann geschlossen, so daß diese Seite eine Spalte des statischen Fluid gegen welche der Druck von der rechten Seite eingestellt wird präsentiert werden.
  4. Verwendung des Mikromanipulators Position der bewegliche rechten Glaskanüle näher an der Arterie Segment und ziehen den rechten Ende des Segments über sie schließlich Befestigung mit den Nylonnaht. Clip die überschüssigen Nähfäden.
  5. Montieren Sie den Druck myograph Einheit auf der Bühne über dem Druck myograph Mikroskop. Legen Sie die Abdeckung über dem Druck myograph Kammer. Die Abdeckung für die Kammer enthält die Superfusion Einlass und die Saugleitung an ihm. Schließen Sie das Superfusion Einlass zu einem Verteiler zu Superfusion der Raumtemperatur Bad oder 60 mM KCl-Lösung in den Druck myograph Kammer durch die Schwerkraft zu ermöglichen. Testsubstanzen wie Medikamente oder Hormone, die in den Patch-Clamp-Messungen fanden an KV7 Kanal Funktion betreffen, werden in der Regel direkt an das Badlösung angewendet, nicht über dem Bad superfusion oder im Lumen Lösung. Die Superfusion Badlösung wird zum Auswaschen der KCl-Lösung werden. Befestigen der Saugleitung mit einem Vakuumsystem, das überschüssige Superfusat entfernen. Legen des Temperatursensors in die Badlösung durch die Öffnung in der Kammer myograph Abdeckung versehen ist.
  6. Verbinden Sie den Druck myograph Gerät mit dem myo-Interface-System, die Hardware, die Kommunikation der myograph Einheit ermöglicht dem Myoview Software (DMT).
  7. Öffnen Sie die Myoview Software auf dem Computer. Im Parameter-Fenster, das Ziel gesetzt, Temperatur 35 ° C mit einer Temperatur Toleranz von 1 ° C, Ziel Zulaufdruck als 80 mmHg und Ziel Vorlaufdruckregelung als 80 mmHg. Laden die Kalibrierdatei und Kalibrieren des Gefäßes Außendurchmesser so dass die Änderungen in der Arterie Durchmesser in Mikron genau aufgezeichnet werden. Stellen Sie den Kontrast wie nötig, um eine gute Sicht auf das gelagerte vor dem Hintergrund zu ermöglichen. Eine detaillierte Beschreibung, wie Sie die Software verwendenwird in der Bedienungsanleitung von DMT vorgesehen.
  8. Schrittweise Erhöhung der 10-ml-Spritze (dient als Schwerkraftzuführung Drucksäule) über einen Zeitraum von 15 min bis das P1 Druckwandlers liest 80 mmHg. Während Erhöhung des Drucks Spalte auf Lecks im Behälter überprüfen. Wenn es irgendwelche Lecks sind, verwerfen das Segment und montieren anderen Arteriensegment (wiederholen Sie die Schritte von 5,2). Den Abstand zwischen den Kanülen, wenn notwendig. Der Abstand sollte so dass das unter Druck Arteriensegment annähernd gerade (aber nicht gestreckt) ist und eine Schulter bildet like-Muster, bei dem die Bindungen hergestellt (Fig. 4A) eingestellt sind.
  9. Einschalten der Beheizung des Drucks myograph Kammer durch die Steuerelemente in der myo-Schnittstellensystem. Lassen Sie die Badlösung allmählich erwärmen, bis sie 36-37 ° C erreicht
  10. Verwenden Sie die XYZ Anpassungen des Ziels in der DMT-Mikroskop, wenn nötig, um das Schiff im Fokus zu halten und erleichtern eine genaue Überwachung der changes im äußeren Gefäßdurchmesser.
  11. Überprüfen Sie die Tragfähigkeit der montierten Behälter durch transiente Superfusion (~ 30 sec) mit 60 mM KCl. Ein lebensfähiger Gefäß verengt schnell auf Zusatz von KCl und erweitert sofort nach Auswaschen der 60 mM KCl (superfuse ca. 60 ml Badlösung zum Auswaschen des KCl). Nach diesem Test nachstellen Volumen der Badlösung auf genau 10 ml. Die Temperatur des Bades während der Test-und KCl Auswaschung reduziert, da diese Lösungen sind bei Raumtemperatur, sondern die Kammer Heizvorrichtung wird die Temperatur auf 36-37 ° C Wiederherstellung innerhalb weniger Minuten.
  12. Erlauben die Arterie für mindestens 30 min (die Durchmesser sollte für mindestens die letzten 10 min dieses Zeitraums stabil) äquilibrieren. Hinzufügen des konzentrierten Testsubstanz auf die Badlösung unmittelbar und pipettieren sanft hin und her in der Nähe der Ränder der Kammer, um die Prüfsubstanz in der Badlösung zu mischen, wodurch man die entsprechende Endkonzentration im 10 ml Kammervolumen. Changes in der Gefäßdurchmesser nach Zugabe der Testsubstanz (en) in der Live-Videobild überwacht werden und auch bei der Bildanalyse Fenster kartiert, während der Versuch durchgeführt wird.
  13. Nach Beendigung des Versuchs, können die gespeicherten Daten (*. Myo)-Datei als eine Tabellenkalkulation Datei zur weiteren Analyse geöffnet werden.

6. Repräsentative Ergebnisse

Die Ergebnisse in 3 gezeigt veranschaulichen typische Aufnahmen KV7 Ströme von Mesenterialarterie Myocyten mit einer Spannungsstufe Protokoll vor (Abbildung 3A, Spuren B schwarz) und während der Behandlung mit einem KV7 Kanalaktivator Zn Pyrithion (ZnPyr, 100 nM; 3A, B roten Spuren). Ähnliche Spannung Schritt Daten von 3-Zellen wurden gemittelt, um die Strom-Spannungs (IV) Grundstücke in 3D gezeigt vorbereiten. Eine repräsentative zeitliche Verlauf der Erhöhung der Stromamplitude (gemessen durch kontinuierliche Spannungsklemme bei -20 mV) during Behandlung mit 100 nM Zn Pyrithion ist in 3C gezeigt 4B veranschaulicht den zeitlichen Verlauf der Wirkung auf ZnPyr Mesenterialarterie Außendurchmesser gemessen mit Druck Myographie;. das Gefäß war vorher eingeengten mit 100 pM Arginin-Vasopressin (AVP) vor Zugabe von 100 nM ZnPyr. Dosis-Wirkungs-gemittelten Daten für ZnPyr induzierten Mesenterialarterie Dilatation werden in 4C gezeigt.

Abbildung 1
Abbildung 1. Bild eines mesenterialen Passage im Sezieren Kammer.

Abbildung 2
Abbildung 2. Bild eines Myozyten mit einer Patch-Pipette auf seiner Oberfläche.

Abbildung 3
Abbildung 3. Original Spuren KV7 Ströme, zeitlichen Verlauf von Drogen Anwendung IV Kurven. A. Familie von sequentiellen Stromspuren (unteres Feld) als Reaktion auf Spannungsstufen (oberes Feld) vor der Behandlung (Kontrolle, schwarz) und folgende Stabilisierung in Gegenwart von 100 nM ZnPyr (rot) in einem einzigen MASMC aufgezeichnet. B. Repräsentative aktuellen Spuren von A (wie durch Pfeilspitzen gezeigt) für die Steuerung (schwarz) und 100 nM für ZnPyr (rot). Graue Balken zeigen Zeitintervall, wo gemittelten Stromamplituden für Strom-Spannungs (IV) Parzellen gemessen wurden. Schritt Spannungen werden auf der rechten Seite durch Pfeilspitzen angezeigt. C. Zeitlicher Verlauf der KV7 aktuellen Verstärkung durch 100 nM ZnPyr mit kontinuierlicher Spannungsklemme bei -20 mV (bar) gemessen. D. Durchschnitt IV-Kurven (n = 3) von KV7 Stromdichten abgeleitet vor der aufgezeichneten (Kontrolle, Kreise), während der Behandlung mit 100 nM ZnPyr (offene Kreise), und während der Behandlung mit 10 pM XE991 (gefüllte Dreiecke). Unspezifische Leckströme wurden abgezogen, wie durch Passmore et al. Ein.

ent "> Abbildung 4
Abbildung 4. ZnPyr induzierte Relaxation eines mesenterica pre-verengt mit 100 pM AVP. A. Foto von einem mesenterica montiert im Druck myograph Set-up. B. Zeitverlauf von Änderungen im Außendurchmesser des Gefäßes in Reaktion auf die Anwendung von 100 pM AVP (offene Balken) durch Anlegen des 100 nM ZnPyr (gefüllte Balken) gefolgt. C. Balkendiagramm Zusammenfassung der Ergebnisse von 100 nM ZnPyr-induzierte vasodilaion.

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Discussion

Die Methoden und experimentelle Ansätze beschrieben, hier sind ziemlich robust und kann klare und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, wenn sie mit viel Liebe zum Detail angelegt. Geeignet elektrophysiologischen Ableitungen und Konstriktion / Dilatation einer arteriellen Segmente abhängig von der Gesundheit der Zellen und Arterien-Segmente sind. Zellpräparationen kann von Tag zu Tag variieren, auch mit dem gleichen Protokoll. Isolation Solutions kann bis zu 2 Wochen verwendet werden, aber wenn die Qualität der Zelle Vorbereitung ist auf zwei konsequente Tag niedrigen neue Isolation Solutions vorbereitet werden. Wir haben gefunden, dass Enzymaktivitäten von Charge zu Charge und daher Isolierungsbedingungen (die Zeiten der Inkubation und Konzentrationen von Enzymen) variieren erfordern Optimierung mit jeder neuen Charge von Enzymen. Wir haben auch festgestellt, dass die Zelle isoliert Protokoll hier für Ratten mesenterica beschrieben nicht für andere Gefäßbetten oder anderen Spezies, die eine andere Mischung oder dens haben können optimalkeit von extrazellulären Matrixkomponenten. Jedes Gefäß Vorbereitung erfordert seine eigene Optimierung, die Bedingungen, die die gesündesten Zellen produzieren zu identifizieren. Die Kriterien, die wir finden sehr hilfreich bei der Identifizierung gesunde Zellen sind: 1) Zellmorphologie: glatt, länglichen, aber leicht verengt Aussehen nach Verreiben MA Segmente in der Isolation Lösung enthaltend 50 uM Ca 2 +, und unter Beibehaltung der gleichen Aussehen, wenn sie 2 übertragen mM Ca 2 +-enthaltenden externe Lösung. Nicht alle Zellen behalten ihre fast vollständig entspannt längliche Form, aber nur fast völlig entspannt Myozyten sollte für elektrophysiologische Aufzeichnung verwendet werden, 2) Zellen sollten optisch dichten, was auf eine intakte unbeschädigte Membran; 3) Membranruhepotentials Spannungen von gesunden Myozyten verwendet Datensatz Kaliumströme oder für Strom-Clamp Messungen von Membran Spannung sollte negativer als -40 mV (üblicherweise im Bereich von -45 mV bis -56 mV unter den Bedingungen des ionischencribed in unserem Protokoll hier).

Um erfolgreiche elektrophysiologischen Ableitungen, die Badlösung und die Pipette Lösung (Zusammensetzung siehe Tabelle 1) ist am Tag des Experiments hergestellt werden sicherzustellen. Es ist entscheidend, Osmolalität der internen und Badlösungen identisch sein (298-299 mOsM) einstellen.

Isobare arterielle Funktion Messungen in kleinen Arterien (<500 um) unter Druck Myographie enger Annäherung an physiologische Bedingungen als nicht isometrische Kraftmessungen hergestellt mit einem Draht myograph. Die Schiffe in einem Druck myograph sind in der Regel empfindlicher auf Vasokonstriktor Agonisten 2-4, enger Angleichung der Empfindlichkeiten in vivo 5, 6 gemessen. Die erhöhte Empfindlichkeit gegenüber niedrigen Konzentrationen von Agonisten hat die Identifizierung der Signaltransduktion Mechanismen physiologisch relevanten picomolar Konzentrationen von AVP induzierten aktiviert7, 8.

Druck Myographie bewahrt die Geometrie des Gefäßes aufrechterhält und die Integrität des Endothels. Endothel-vermittelte Effekte von Medikamenten aus der glatten Muskulatur-vermittelte Effekte durch die parallele Messungen in intakten und Endothel-entblößt Schiffe 9 unterschieden werden. Das absichtliche Störungen des Endothels kann durch physikalisches Beschädigung des Endothels (zB indem ein menschliches Haar hin und her durch das Lumen) oder durch Perfusion Luft durch das Lumen der Arterie erreicht werden. Der Verlust der endothelialen Funktion (aber nicht vaskuläre glatte Muskelzellen Funktion) sollte durch die Messung einer reduzierten Endothel-vermittelte gefäßerweiternde Reaktion auf Acetylcholin in den Gefäßen vor verengt mit einem Agonisten 9 bestätigt werden.

Parallel Messungen der Ionenströme / Membran Spannung in mesenterica Myozyten mit Patch-Clamp-Technik und arterielle Konstriktion / Dilatation der mesenterialen Arteriolenes unter Druck Myographie aktivieren können Aufklärung der Rolle der spezifische Ionenkanäle in beiden physiologischen Signaltransduktionskaskaden und in den Handlungen von Therapeutika. Behandlungen für bestimmte Klassen von Ionenkanälen oder spezifische Signaltransduktion Zwischenprodukte können additiv oder nacheinander aufgebracht werden, um mechanistische Informationen über die Rollen dieser Kanäle an der Regulation der Myozyten-Funktion auf zellulärer Ebene und im Einschnürung / Dilatation intakter Arterien bereitzustellen. Convergent Ergebnisse von Behandlungen verstärken oder hemmen bestimmte Arten von Ionenströme mit entsprechenden Auswirkungen auf Arteriendurchmesser zuverlässigere Interpretationen als unter Verwendung der beiden Methoden kann allein sein. Idealerweise sollte die Konzentrationsabhängigkeit der Agenten in Untersuchung in beiden Systemen bestimmt werden. Auf physiologische oder therapeutische Relevanz, sollten die Konzentrationen getestet, um Konzentrationen in der physiologischen Umgebung o gemessen bezogen werdenr erreicht mit klinischen Therapien. Beispiele für diese Art von experimentellen Ansätzen finden Sie in unserem früheren Publikationen 8-10 gefunden werden.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von der National Heart, Lung, and Blood Institute (NIH R01-HL089564) an KLB und Pre-Stipendien von der American Heart Association (09PRE2260209) und Arthur J. Schmitt Stiftung BKM finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride Sigma S5886 Dissecting Solution: 145
Bath solution for Electrophysiology*: 140
Internal solution for electrophysiology: 10
Isolation solution for myocytes*: 140
Bath solution for pressure myography: 145
Lumen solution for pressure myography: 145
Potassium chloride Sigma P5405 Dissecting Solution: 4.7
Bath solution for Electrophysiology*: 5.36
Internal solution for electrophysiology: 135
Isolation solution for myocytes*: 5.36
Bath solution for pressure myography: 4.7
Lumen solution for pressure myography: 4.7
Potassium EGTA Sigma E4378 Internal solution for electrophysiology: 0.05
HEPES Sigma H9136 Bath solution for Electrophysiology*: 10
Internal solution for electrophysiology: 10
Isolation solution for myocytes*: 10
Disodium hydrogen phosphate Sigma S5136 Isolation solution for myocytes*: 0.34
Potassium hydrogen phosphate Sigma P5655 Isolation solution for myocytes*: 0.44
Magnesium Chloride Sigma M2393 Bath solution for Electrophysiology*: 1.2
Internal solution for electrophysiology: 1
Isolation solution for myocytes*: 1.2
Calcium Chloride Sigma C7902 Bath solution for Electrophysiology*: 2
Isolation solution for myocytes*: 0.05
Sodium phosphate Fisher Scientific BP331-1 Dissecting Solution: 1.2
Bath solution for pressure myography: 1.2
Lumen solution for pressure myography: 1.2
Magnesium Sulfate Sigma M2643 Dissecting Solution: 1.17
Bath solution for pressure myography: 1.17
Lumen solution for pressure myography: 1.17
MOPS Fisher Scientific BP308 Dissecting Solution: 3
Bath solution for pressure myography: 3
Lumen solution for pressure myography: 3
Pyruvic acid Sigma P4562 Dissecting Solution: 2
Bath solution for pressure myography: 2
Lumen solution for pressure myography: 2
EDTA dihydrate Research Organics 9572E Dissecting Solution: 0.02
Bath solution for pressure myography: 0.02
Lumen solution for pressure myography: 0.02
D-Glucose Sigma G7021 Dissecting Solution: 5
Bath solution for Electrophysiology*: 10
Internal solution for electrophysiology: 20
Isolation solution for myocytes*: 10
Bath solution for pressure myography: 5
Lumen solution for pressure myography: 5
Bovine serum albumin Sigma A3912 Dissecting Solution: 1%
Lumen solution for pressure myography: 1%
pH Dissecting Solution: 7.4
Bath solution for Electrophysiology*: 7.3
Internal solution for electrophysiology: 7.2
Isolation solution for myocytes*: 7.2
Bath solution for pressure myography: 7.4
Lumen solution for pressure myography: 7.4
Osmolarity Dissecting Solution: 300
Bath solution for Electrophysiology*: 298
Internal solution for electrophysiology: 298
Isolation solution for myocytes*: 298
Bath solution for pressure myography: 300
Lumen solution for pressure myography: 300

*11

Table 1. Components of solutions used in the experiment.

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References

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