Udforskning arteriernes glatte muskulatur Kv7 kaliumkanal Funktion hjælp Patch Clamp Elektrofysiologi og Pressure Myography

Published 9/14/2012
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Målinger af Kv7 (KCNQ) kalium kanal aktivitet i isolerede arterielle myocytter (ved hjælp af patch clamp elektrofysiologiske teknikker) parallelt med målinger af kvælerslange / dilator reaktioner (med tryk myography) kan afsløre vigtige oplysninger om de roller, Kv7 kanaler i vaskulære glatte muskulatur fysiologi og farmakologi.

Cite this Article

Copy Citation

Brueggemann, L. I., Mani, B. K., Haick, J., Byron, K. L. Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography. J. Vis. Exp. (67), e4263, doi:10.3791/4263 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kontraktion eller relaksation af glatte muskelceller i væggene i modstandskar bestemmer arteriediameteren og derved styrer strømmen af ​​blod gennem karret og bidrager til det systemiske blodtryk. Kontraktionen Processen reguleres primært af cytosolisk calciumkoncentration ([Ca2 +] cyt), som igen styres af en række forskellige ion-transportører og kanaler. Ionkanaler er almindelige mellemprodukter i signaltransduktionsveje aktiveres af vasoaktive hormoner for at bevirke vasokonstriktion eller vasodilatation. Og ionkanaler er ofte ramt af terapeutiske midler enten bevidst (f.eks kalciumblokkere anvendes til at fremkalde vasodilatation og lavere blodtryk) eller utilsigtet (f.eks at fremkalde uønskede kardiovaskulære bivirkninger).

Kv7 (KCNQ) spænding-aktiverede kaliumkanaler er for nylig blevet impliceret som vigtige fysiologiske og terapeutiske Targets for regulering af glatte muskelkontraktion. For at belyse de specifikke roller Kv7 kanaler i både fysiologiske signaltransduktion og i aktionerne af terapeutiske midler, er vi nødt til at undersøge, hvordan deres aktivitet moduleres på celleniveau samt vurdere deres bidrag inden for rammerne af det intakte arterie.

Rotte mesenteriske arterier et nyttigt modelsystem. Arterierne kan let dissekeres, renses for bindevæv, og anvendt til fremstilling af isolerede arterielle myocytter til patch-clamp-elektrofysiologi, eller kanyle og sættes under tryk for målinger af vasokonstriktor / vasodilator reaktioner under relativt fysiologiske betingelser. Her beskriver vi de metoder, der anvendes til begge typer af målinger og give nogle eksempler på, hvordan det eksperimentelle design kan integreres til at give en bedre forståelse af de roller, disse ionkanaler i reguleringen af ​​vaskulær tonus.

Protocol

1. Kirurgisk excision af tyndtarmens Mesenterial Vaskulær Arcade

  1. Bedøve en 300-400 g Sprague-Dawley-rotte med isofluran (4%) administreres ved inhalation.
  2. Udfør en midtlinie laparotomi at eksponere tyndtarmens mesenterium. Exteriorize den lille og store tarmen gennem abdominal incision med stor omhu for at undgå traumer på udsatte tarm og mesenterium. Forsigtigt lufte mesenteriet ud over steril gaze.
  3. Kirurgisk punktafgiftspligtige tyndtarmen og en del af tyktarmen, herunder caecum (blodkar omhyggeligt skåret langs kanten og på oprindelsen fra de primære grene af den øvre mesenteriske arterie / vene).
  4. Overfør det udskårne væv i et bægerglas indeholdende iskold dissekere opløsning (tabel 1).
  5. Efter udskæring af tarmen, bør rotten aflivet på human vis, mens under anæstesi.

2. Dissection end Rengøring af Arterier

  1. Overfør det udskårne tarmen og mesenteriske arcade til en afkølet dissekere kammer (4-5 ° C) indeholdende dissekere opløsning. Kammeret består af en 100 mm glas petriskål med en Sylgard 184 elastomer base at rumme dissekere stifter, petriskålen er placeret i en afkølet base, der holdes ved 4-5 ° C ved et cirkulerende vandbad.
  2. Anvendelse af kirurgiske sakse skære en omtrent 10 til 12 cm segment af hele tarmen. Klip i hver ende af den intestinale segment holde sin kar monteret, og derefter fjerne ubrugte tarmen fra kammeret forlader et segment med dets tilknyttede vaskulatur (mesenterisk arkade) i isolation.
  3. Pin ned segment af tyndtarmen, sprede mesenteriet i den nærmeste side af kammeret, således at den primære gren af den øvre mesenteriske arterie / vene er i centrum og de ​​efterfølgende ordrer grene udstråler fra centrum (fig. 1). Pl ace stifterne udelukkende på de intestinale segmenter (ikke på blodkarrene).
  4. Skelne arterier fra vener ved deres forholdsvis klar rød farve, tykke mure og karakteristiske V-formede grene i stedet for de U-formede grene set i venerne.
  5. Visualisering gennem et belyst dissektionsmikroskop, omhyggeligt fjerne fedtvæv og bindevæv, der omgiver 2. - 4. ordens arterier tæt på tarmene (stiplede cirkel i figur 1) ved hjælp af mikro pincet og saks. Holding de tilstødende vener letter rydde fedtvæv og bindevæv. Undgå unødig strækning af arterierne.
  6. Mesenterialarterie segmenter ryddet af bindevæv kan derefter dissekeret ud og anvendes til celleisolering (til enkelt-celle patch clamp-forsøg, afsnit 3-4) eller kanyle til tryk myography (afsnit 5). Skære segmenter mellem forgreningspunkter, sædvanligvis op til 1 cm i længde.
jove_title "> 3. Cell Isolation for patch clamp-forsøg

  1. Forbered 0,5 I Isolation opløsning (tabel 1), og opdele det i to dele før indstilling af pH Den første del (sædvanligvis 100 ml) bør opvarmes til 37 ° C og pH skal justeres til 7,2 ved 37 ° C (37 ° C Isolation Solution). Den anden del af Isolation opløsning bør afkøles til 4 ° C og pH skal justeres til 7,2 ved 4 ° C (Ice Cold Isolation Solution). Efter pH-justering, må osmolariteten af begge opløsninger, der skal justeres til 298 mOsm ved tilsætning af en passende mængde D-glucose eller H 2 O.
  2. Overfør 2 ml 37 ° C Isolation opløsning til en glasbeholder og inkuber ved 37 ° C til anvendelse i trin 3.4. Der tilsættes 20 mg bovin serumalbumin (BSA) til 10 ml 37 ° C Isolation opløsning opløses, igen opvarmes til 37 ° C og justér pH til 7,2. Til 2 ml af denne opløsning tilsættes 4 mg collagenase Type VIII (Sigma, Lot 089K8612: 633 unit / mg collagenaseaktivitet, 285 enheder / mg Caseinase aktivitet, 1,6 enheder / mg Clostripain aktivitet), 0,64 mg elastase Type IV (Sigma, Lot 110M7025V 5,9 enheder / mg, tilsættes 40 pi af en 16 mg / ml stamopløsning fremstillet i 37 ° C Isolation Solution) og 2 pi af 1 M DL-dithiothreitol (DTT Sigma), pre-varme denne enzymopløsning til 37 ° C som forberedelse til trin 3.5.
  3. Overfør 2-3 segmenter af mesenterialarterie ind i en 35-mm vævsdyrkningsskål indeholdende 2 ml iskoldt Isolation Solution og sted fadet på is. Skær mesenterialarterie segmenter i 3-4 mm lange stykker.
  4. Under anvendelse af en Pasteur-pipette med flammepoleret spids (for at undgå beskadigelse af arterierne) overfører de arterielle segmenter i et hætteglas (15 x 45 mm, 1 dram) indeholdende 2 ml forvarmet 37 ° C Isolation opløsning og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C.
  5. Efter 30 minutter aspireres forsigtigt 37 ° C Isolation opløsning under anvendelse af en Pasteur-pipette, tilsættes 2 ml varmt enzymopløsning og inkuberes i 35 minved 37 ° C.
  6. Umiddelbart efter 35 min inkubering i enzymopløsningen, anbringe hætteglasset på is, aspireres enzymopløsningen og der tilsættes 2 ml iskoldt Isolation Solution (gentages aspiration og tilsætning af frisk Ice Cold Isolation Solution 4 gange). Derefter, i et volumen på 1 ml iskold Isolation Solution, tritureres forsigtigt arterielle segmenter med Pasteur-pipette 10-20 gange for at frigive de enkelte mesenteriske arterie glatte muskelceller (MASMCs).
  7. Periodisk kontrollere myocytter udseende ved at anbringe en dråbe af cellesuspensionen på en 35 mm skål og vises under et mikroskop. Sunde MASMCs skal have en glat langstrakt udseende. Ikke alle cellerne i arterievæggen vil blive frigivet. Cellesuspensionen bør holdes på is.
  8. En anden nyttig indikator for MASMC sundhed er deres tolerance over for fysiologiske Ca 2 +-koncentrationer. Fyld optagelse kammer (Bioscience Tools, # CSC-25L) med bad solution indeholdende 2 mM CaCl2 (pH 7,3 ved stuetemperatur (RT), for sammensætning se tabel 1) og agar bro (bøjet glas kapillar fyldt med 2% agar i 2 M KCI, indsat i referenceelektrode (Warner Instrument, REF -3L)) inde i kammeret. Ved hjælp af poleret Pasteurpipette, ca 100-200 ml cellesuspension overføres til et registreringskammer og tillader cellerne at adhærere i 15 min. Ubeskadigede celler bør ikke falde væsentlig i 2 mM CaCl2-opløsning (celler skulle synes at være langstrakt eller stangformet, ikke afrundet til kugler).
  9. Efter tilsætning af den første portion af cellesuspensionen til registreringskammer, 0,25 ml bad indeholdende 2 mM CaCl2, bør sættes til den resterende mængde cellesuspension. Denne resterende cellesuspension kan holdes i denne opløsning på is og anvendt til patch-clamp-optagelser i op til 6 timer.

4.Brug af helcelle Patch Clamp til måling Kv7 kaliumstrømme eller membran Spænding

  1. Efter myocytter overholde glasbasen af optagelsen kammeret (25-mm nr. 1 runde dækglas, Warner Instruments), initiere kontinuerlig perfusion af badopløsningen (tabel 1). Til optagelse af Kv7 strømninger i isolation fra forsinkede ensretter kalium strømme af KV1 og Kv2 familier, bør badopløsningen suppleres med 100 uM GdCl 3.
  2. Fabrikere en patch-pipette af borsilikatglas (Kimax-51, Kimble Chase) under anvendelse af en pipette aftrækker og microforge, dens modstand være 4-5 MQ når den fyldes med indre opløsning (tabel 1). Dække de nederste tredjedel af pipetten (~ 1-2 mm over spidsen) med Sylgard 184.
  3. Til optagelse af Kv7 strømme i MASMCs, bør det perforerede patch helcelle spænding clamp-teknikken anvendes. Anvendelse af en perforeret patch udformning medvirker til at forhindre depletion af membran phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PIP2) og derefter hurtig (5 minutter) gennemgang af de Kv7 strømme, som normalt ses ved hjælp af konventionelle opbrudte patch konfiguration. Supplere den indre opløsning (tabel 1) med 120 ug / ml Amphotericin B: Der tilsættes 3 ​​pi 2 mg / ml stamopløsning af Amphotericin B (fremstillet i DMSO og opbevares nedfrosset i små portioner og beskyttet mod lys) til 0,5 ml intern opløsning. Fyld spidsen af ​​patch-pipetten med Amphotericin B-fri indre opløsning ved at dyppe pipettespidsen i Amphotericin B-frit indre opløsning og derefter påføre sugning på den anden ende ved hjælp af en 10 ml sprøjte bundet via et stykke slange (Tygon R- 3603). Tilføj Amphotericin B-holdig pipette opløsningen fra toppen ved hjælp af en Eppendorf Microloader pipettespidsen, indtil pipetten er omkring halvt fyldt med opløsning. Fjern eventuelle luftbobler ved forsigtigt at banke på pipetten. Bruge pipetten samme.
  4. Sæt pipettentil elektrodeholderen og bruge en mikromanipulator at sænke pipetten til overfladen af en aflang myocyt (tæt på, men ikke på toppen af kernen, figur 2). Når modstand i pipetten stiger til 6-10 MQ sugning for at opnå en giga-forsegling (> 10 GQ).
  5. Sæt holde spændingen til 0 mV mens de venter på membran perforation. Påfør 100 ms spændingstrin til +10 mV og derefter til -10 mV, og bruge forstærkeren til at kompensere hurtige pipette kapacitans transienter. Samtidig med fremkomsten af ​​helcelle kapacitans transienter, små fortsat positive strømme (sædvanligvis 2-10 pA) vil indikere tilstedeværelsen af ​​funktionelle Kv7 kanaler.
  6. Vellykket perforering med Amphotericin B vil reducere adgang resistens til 35 MOhm eller mindre. Aktuelle optagelse kan derefter initieres med en 5 sek spændingstrin protokollen fra -4 mV bedrift spænding. Vi bruger den -4 mV holder spænding til at opnå nær maksimal inaktivering af andre typer af forsinket rectifier kaliumstrømme (medieres overvejende af KV1 og Kv2 kanaler), der ellers ville forurene optagelse af de relativt små ikke-inaktiverende Kv7 strømme. Den lange (5 sek) spændingstrin protokol er nødvendig for at opnå steady-state aktivering af Kv7 kanaler, som udviser langsom spændingsafhængige aktivering og deaktivering. De Kv7 strømme ikke inaktiverer under vedvarende spændingstrin.
  7. At registrere Kv7 strøm-spændings (IV) forbindelser, anvendes 5 sekunder spændingstrin til spændinger i området fra -84 mV, hvor den åbne sandsynlighed for Kv7 kanaler er minimal, til +16 mV, hvor den åbne sandsynlighed for Kv7 kanaler når en plateau, efter 5 sek ved hver prøvespænding, gå tilbage til at holde spændingen (-4 mV) i 10 sek. Det vil tage ca 3,5 min for hele serien af testimpulser (figur 3A). Udfør 2-3 kontrol IV optagelser for at sikre, at de registrerede strømme er stabile over tid. Plot gennemsnit ende puls strømme (gennemsnitstrømme konstateret for sidste 1 sek) versus spænding til at skabe en IV-kurve (figur 3D). De kontrolprocedurer IV kurverne bør cirka overlejret, hvis strømmen er stabile.
  8. Før du anvender nogen farmakologiske midler indlede et tidsforløb protokol, der skal løbende registrere strøm ved -20 mV. Sikre stabil registrering af den aktuelle i mindst 5 min før lægemiddelpåføring. Anvend de farmakologiske midler til 5-15 minutter, eller indtil en ligevægt er opnået (figur 3C), og derefter afslutte tidsforløbet protokollen og Optage to IV-kurver ved hjælp af spændings-trins protokol. Udvaskning lægemidlet og registrere tidsforløbet af lægemiddel udvaskning, efterfulgt af optagelse af to yderligere IV-kurver.
  9. Ved afslutningen af forsøget anvendes 10 uM linopirdine eller 10 uM XE991, irreversible inhibitorer af Kv7 kanaler; disse lægemidler bør fuldt inhibere strømmene registreres ved spændinger negative til -20 mV (figur 3D).

5. Anvendelse af intakte Artery segmenter for Pressure Myography

  1. Et tryk myograph-system købt fra dansk Myo Technology (DMT A / S, Danmark, Model 110p) anvendes til trykket myography eksperimentet. Montere arterie segmentet i rustfrit stålkammer ved indsættelse af horisontalt fikseret venstre glas kanyle i den ene ende, og den bevægelige højre glas kanyle ind i den anden ende. To tryktransducere (P1 til højre og P2 på venstre side) er indbygget i at overvåge trykket inde i arterien lumen. Fluidum fra højre glas kanyle vil blive anvendt til at justere trykket inden i arterien til den omtrentlige fysiologiske niveau. Til at begynde, før fill en åben 10 ml sprøjte (til brug som faldtilførsel lavtrykssøjlen), med lumen opløsning (tabel 1). Hæv sprøjten til at skubbe løsningtion via polyethylenrør ind i den højre glas kanylen, idet man undgå luftbobler i slangen eller kanyle. Den venstre kanyle bør udfyldt på forhånd med lumen løsning via en 1 ml sprøjte. Fyld trykket myograph kammer med 10 ml af beholderen badopløsningen (tabel 1). Løst suspendere to pre-made fine nylonsuturer på hver side støder op til glasset kanyler.
  2. Omhyggeligt overføre det dissekerede mesenterialarterie segment (sædvanligvis et 3. eller 4. For segment, omkring 200 til 350 um i diameter, fra trin 2.6) fra dissekere kammer til det tryk myograph kammeret ved at holde på den ene ende af segmentet ved hjælp af mikro pincet.
  3. Visualisering gennem et belyst dissektionsmikroskop, holde den ene ende af arterien segmentet og forsigtigt skubbe den over den venstre glas kanyle og fastgøre enden ved hjælp af nylonsuturer. Forsigtigt skylle lumen fluid gennem den monterede beholder for at fjerne blod og rester i beholderen.Ventilen til venstre sprøjte bør derefter lukket, så at denne side præsenterer en statisk søjle af fluidum mod hvilken trykket justeres fra højre side.
  4. Brug mikromanipulator at placere bevægelige højre glas kanyle tættere på arterie-segmentet og træk den højre ende af segmentet over det endelig at sikre det med de nylonsuturer. Klip det overskydende suturtråde.
  5. Montere trykket myograph enhed på scenen over trykket myograph mikroskop. Anbring dækslet over trykket myograph kammeret. Dækslet til kammeret indeholder superfusionssystem indløb og sugerøret knyttet til den. Slut superfusionssystem indløb til en manifold til at tillade superfusionsapparatet af stuetemperatur bad eller 60 mM KCl opløsning i trykket myograph kammeret ved hjælp af tyngdekraften. Teststoffer, såsom lægemidler eller hormoner, der findes i patch-clamp-målingerne at påvirke Kv7 kanalfunktion, almindelighed påføres direkte på badopløsningen, ikke via badet superfusion eller i lumen opløsningen. Superfusionsapparatet af badopløsning vil blive anvendt til at udvaske KCI-opløsning. Fastgør sugeledning til et vakuumsystem til fjernelse af overskuddet superfusate. Før temperaturføleren i badet opløsningen gennem åbningen tilvejebragt i myograph batteridækslet.
  6. Tilslut trykket myograph enhed til myo-systeminterface, den hardware, der muliggør kommunikation af myograph enhed til myoview software (DMT).
  7. Åbne myoview software i computeren. I parameter-vinduet, skal du indstille den ønskede temperatur som 35 ° C med en temperatur tolerance på 1 ° C, mål indstrømning pres som 80 mmHg og mål outflow pres som 80 mmHg. Indlæse kalibreringsfil og kalibrere fartøjet udvendige diameter, således at ændringer i arteriediameteren registreres nøjagtigt i mikron. Justér kontrasten som nødvendigt for at muliggøre et godt overblik over den monterede segment baggrund. En detaljeret beskrivelse af, hvordan du bruger softwarener tilvejebragt i brugermanualen fra DMT.
  8. Gradvist øge 10 ml injektionssprøjte (der tjener som en faldtilførsel lavtrykssøjlen) over en periode på 15 min, indtil P1 tryktransducer læser 80 mmHg. Mens hæve trykket kolonnen, så tjek for eventuelle lækager i fartøjet. Hvis der er nogen lækager, kasseres segmentet og montere en anden arterie segment (gentag trin fra 5,2). Justere afstanden mellem kanylerne efter behov. Afstanden bør justeres således, at den tryksatte arterie segment er ca ligekædet (men ikke strakt) og danner en skulder, som-mønster, hvor båndene er fremstillet (figur 4A).
  9. Slå opvarmning af trykket myograph kammeret gennem kontrolelementerne i myo-interface-system. Tillade badopløsningen at varme gradvist, indtil den når 36-37 ° C.
  10. Brug de XYZ justeringer af målsætningen i DMT mikroskop når det er nødvendigt for at holde skibet i fokus, og lette en nøjagtig sporing af lmAnges i ydre kardiameter.
  11. Tjek levedygtigheden af ​​den monterede beholder ved transient superfusionssystem (~ 30 sek) med 60 mM KCI. En levedygtig fartøj bremsende hurtigt ved tilsætning af KCI og dilaterer umiddelbart efter udvaskning af 60 mM KCI (superfuse cirka 60 ml badopløsning at udvaske KCI). Efter denne test, justere volumen af ​​badopløsningen på nøjagtigt 10 ml. Temperaturen af ​​badet reduceres under KCl test og udvaskning, fordi disse løsninger er ved stuetemperatur, men kammeret varmelegeme vil genoprette temperaturen til 36-37 ° C inden for få minutter.
  12. Tillad arterien at ækvilibrere i mindst 30 minutter (diameteren bør være stabil i mindst de sidste 10 minutter af denne periode). Tilsæt koncentreret teststoffet til badopløsningen direkte og pipetteres frem og tilbage forsigtigt i nærheden af ​​kanterne af kammeret at blande teststoffet i badopløsningen, hvilket giver den passende slutkoncentration i 10 ml kammervolumen. ChanGES i kardiameteren efter tilsætning af prøvestoffet (s) kan overvåges i live videobillede og også kortlagt i billedanalyse vinduet, mens forsøget er i gang.
  13. Efter afslutning af forsøget, kan de lagrede data (*. Myo) fil blive åbnet som et regneark fil til yderligere analyse.

6. Repræsentative resultater

Resultaterne vist i figur 3 illustrerer typiske registreringer af Kv7 strømme fra mesenterialarterie myocytter med et spændingstrin protokol før (figur 3A, B sorte spor) og under behandling med en Kv7 kanal aktivator Zn pyrithion (ZnPyr, 100 nM, figur 3A, B røde spor). Lignende spændingstrin data fra 3 celler blev beregnet til fremstilling af strøm-spænding (IV) plots vist i figur 3D. Et repræsentativt tidsforløbet for forbedring af strømamplitude (målt ved konstant spænding clamp ved -20 mV) During behandling med 100 nM Zn pyrithion er vist i figur 3C Figur 4B illustrerer tidsforløbet af virkningen af ZnPyr på mesenterialarterie udvendige diameter målt under anvendelse af tryk myography. fartøjet var præ-indsnævret med 100 pM arginin-vasopressin (AVP) før tilsætning af 100 nM ZnPyr. Midlede dosis-respons data for ZnPyr-induceret mesenterialarterie dilatation er vist i figur 4C.

Figur 1
Figur 1. Billede af en mesenterial arkade i dissekere kammer.

Figur 2
Figur 2. Billede af en myocyt med en patch-pipette på sin overflade.

Figur 3
Figur 3. Originale spor af Kv7 strømme, tidsforløbet af narkotika anvendelse, IV kurver. A. Familie af sekventielle aktuelle spor (nederste panel) registreres som reaktion på spændingstrin (toppanel) før behandling (kontrol, sort) og efter stabilisering i nærværelse af 100 nM ZnPyr (rød) i en enkelt MASMC. B. Repræsentative aktuelle spor fra A (som angivet ved pile) til kontrol (sort) og 100 nM ZnPyr (rød). Grå søjler viser tidsinterval, hvor gennemsnitsmålinger nuværende amplituder blev målt for strøm-spænding (IV) plots. Trin spændinger er angivet til højre ved pilespidser. C. Tidsforløb af Kv7 aktuelle forstærkning ved 100 nM ZnPyr målt med konstant spænding clamp ved -20 mV (bar). D. Gennemsnit IV-kurver (n = 3) afledt af Kv7 strømtætheder optaget før (kontrol, udfyldte cirkler), ved behandling med 100 nM ZnPyr (åbne cirkler), og under behandling med 10 pM XE991 (udfyldte trekanter). Ikke-specifikke lækage strømme blev subtraheret som beskrevet af Passmore et al. En.

ent "> Figur 4
Figur 4. ZnPyr induceret relaksation af en mesenterialarterie forud indsnævret med 100 pM AVP. A. Fotografi af en mesenterialarterie monteret i trykket myograph set-up. B. Tidsforløb af ændringer i ydre diameter af beholderen som reaktion på anvendelse af 100 pM AVP (åben søjle) efterfulgt af anvendelse af 100 nM ZnPyr (udfyldt bjælke). C. Bar graf sammenfatter resultaterne fra 100 nM ZnPyr-induceret vasodilaion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De metoder og eksperimentelle metoder beskrevet her er ganske robust og kan producere klare og reproducerbare resultater, når de anvendes med omhyggelig opmærksomhed på detaljer. Gode ​​elektrofysiologiske optagelser og konstriktion / dilatation af arterielle segmenter er afhængige af sundhed celler og arterie segmenter, hhv. Cellepræparater kan variere fra dag til dag, selv efter samme protokol. Isolation Solutions kan anvendes i op til 2 uger, men hvis kvaliteten af ​​cellen præparatet er lav af to deraf følgende dag nye Isolation Solutions skulle udarbejdes. Det har vist sig, at enzymaktiviteterne variere fra batch til batch og dermed isolation betingelser (tidspunkterne for inkubering og koncentrationer af enzymer) kræver optimering med hver ny batch af enzymer. Vi har også fundet, at celleisolering protokollen beskrevet her for rotte-mesenterialarterie ikke er optimal til andre kar eller andre arter, der kan have en anden blanding eller itstet af ekstracellulære matrixkomponenter. Hver vaskulær forberedelse kræver sin egen optimering for at identificere forhold, der producerer de sundeste celler. De kriterier, som vi finder mest nyttige i at identificere sunde celler er: 1) cellemorfologi: glat, langstrakt, men lidt trange udseende efter triturering MA segmenter i Isolation opløsning indeholdende 50 pM Ca 2 +, og fastholde samme udseende når den overføres til 2 mM Ca 2 +-holdige ydre opløsning. Ikke alle celler vil bibeholde deres næsten fuldstændigt afslappet aflang form, men kun næsten fuldt afslappet myocytter bør anvendes til elektrofysiologiske optagelser, 2) Cellerne bør være optisk tæt, hvilket indikerer en intakt ubeskadiget membran, 3) membranens hvilepotentiale spændinger på raske myocytter anvendes til optage kalium strømme eller for nuværende-clamp optagelser af membran spænding bør være mere negativ end -40 mV (sædvanligvis i området fra -45 mV til -56 mV under de ioniske betingelser destilskrevet i vores protokol her).

For at sikre en vellykket elektrofysiologiske optagelser, badopløsningen og pipetten opløsning (for sammensætning se tabel 1) skal udarbejdes på dagen for eksperimentet. Det er afgørende at justere osmolalitet af både interne og bad løsninger at være identiske (298-299 mOsm).

Isobar arterielle funktion målinger i små arterier (<500 um) ved hjælp af tryk myography tilnærmer sig fysiologiske betingelser end at gøre isometriske kraft målinger, der foretages ved hjælp af en wire myograph. Skibene i en presset myograph er typisk mere følsomme over for vasokonstriktor agonister 2-4, nærmere tilnærmelse af følsomheder målt in vivo 5, 6. Den øgede sensitivitet for lave koncentrationer af agonister har muliggjort identifikation af signaltransduktionsmekanismer induceret af fysiologisk relevante picomolære koncentrationer af AVP7, 8.

Tryk myography bevarer geometrien af ​​beholderen og opretholder integriteten af ​​endotelet. Endotel-medierede virkninger af lægemidler kan skelnes fra glatte muskel-medierede virkninger ved at gennemføre parallelle målinger i intakte og endothelium-blottet skibe 9. Tilsigtet forstyrrelse af endothelium kan udføres ved fysisk beskadigelse af endotelet (fx ved at lede en menneskehår frem og tilbage gennem hulrummet) eller ved perfusion af luft gennem arteriens lumen. Tabet af endotelfunktion (men ikke vaskulær glat muskel-funktion) skal bekræftes ved at måle en nedsat endotel-medieret vasodilator respons på acetylcholin i fartøjer, for-indsnævrede med en agonist 9.

Parallelle målinger af ionstrømme / membran-spænding i mesenterialarterie myocytter med patch-clamp-teknikker og arteriel indsnævringen / dilatation af mesenterisk arteries ved hjælp af tryk myography kan aktivere belysning af de roller af specifikke ionkanaler i både fysiologiske signaltransduktion kaskader og i aktionerne af terapeutiske midler. Behandlinger rettet mod specifikke klasser af ionkanaler eller specifikke signaltransduktion mellemprodukter kan anvendes additivt eller i rækkefølge for at give mekanistisk information om rollerne for disse kanaler i reguleringen af ​​myocyt funktion på celleniveau og i konstriktion / dilatation af intakte arterier. Konvergerende resultater af behandling der forbedrer eller hæmmer bestemte typer af ionstrømme med tilsvarende virkninger på arteriediameteren tilvejebringe mere pålidelige fortolkninger, end der kan opnås ved anvendelse af enten metode i sig selv. Ideelt set bør koncentrationen afhængighed af midlerne, der undersøges bestemmes i begge systemer. At vurdere fysiologisk eller terapeutisk relevans, bør de testede koncentrationer være relateret til koncentrationer målt i det fysiologiske miljø or opnås ved kliniske behandlinger. Eksempler på disse typer af eksperimentelle tilgange kan findes i vores tidligere publikationer 8-10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgements

Dette arbejde blev finansieret af en bevilling fra National Heart, Lung, og Blood Institute (NIH R01-HL089564) til KLB og PhD-stipendier fra American Heart Association (09PRE2260209) og Arthur J. Schmitt Foundation til BKM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride Sigma S5886 Dissecting Solution: 145
Bath solution for Electrophysiology*: 140
Internal solution for electrophysiology: 10
Isolation solution for myocytes*: 140
Bath solution for pressure myography: 145
Lumen solution for pressure myography: 145
Potassium chloride Sigma P5405 Dissecting Solution: 4.7
Bath solution for Electrophysiology*: 5.36
Internal solution for electrophysiology: 135
Isolation solution for myocytes*: 5.36
Bath solution for pressure myography: 4.7
Lumen solution for pressure myography: 4.7
Potassium EGTA Sigma E4378 Internal solution for electrophysiology: 0.05
HEPES Sigma H9136 Bath solution for Electrophysiology*: 10
Internal solution for electrophysiology: 10
Isolation solution for myocytes*: 10
Disodium hydrogen phosphate Sigma S5136 Isolation solution for myocytes*: 0.34
Potassium hydrogen phosphate Sigma P5655 Isolation solution for myocytes*: 0.44
Magnesium Chloride Sigma M2393 Bath solution for Electrophysiology*: 1.2
Internal solution for electrophysiology: 1
Isolation solution for myocytes*: 1.2
Calcium Chloride Sigma C7902 Bath solution for Electrophysiology*: 2
Isolation solution for myocytes*: 0.05
Sodium phosphate Fisher Scientific BP331-1 Dissecting Solution: 1.2
Bath solution for pressure myography: 1.2
Lumen solution for pressure myography: 1.2
Magnesium Sulfate Sigma M2643 Dissecting Solution: 1.17
Bath solution for pressure myography: 1.17
Lumen solution for pressure myography: 1.17
MOPS Fisher Scientific BP308 Dissecting Solution: 3
Bath solution for pressure myography: 3
Lumen solution for pressure myography: 3
Pyruvic acid Sigma P4562 Dissecting Solution: 2
Bath solution for pressure myography: 2
Lumen solution for pressure myography: 2
EDTA dihydrate Research Organics 9572E Dissecting Solution: 0.02
Bath solution for pressure myography: 0.02
Lumen solution for pressure myography: 0.02
D-Glucose Sigma G7021 Dissecting Solution: 5
Bath solution for Electrophysiology*: 10
Internal solution for electrophysiology: 20
Isolation solution for myocytes*: 10
Bath solution for pressure myography: 5
Lumen solution for pressure myography: 5
Bovine serum albumin Sigma A3912 Dissecting Solution: 1%
Lumen solution for pressure myography: 1%
pH Dissecting Solution: 7.4
Bath solution for Electrophysiology*: 7.3
Internal solution for electrophysiology: 7.2
Isolation solution for myocytes*: 7.2
Bath solution for pressure myography: 7.4
Lumen solution for pressure myography: 7.4
Osmolarity Dissecting Solution: 300
Bath solution for Electrophysiology*: 298
Internal solution for electrophysiology: 298
Isolation solution for myocytes*: 298
Bath solution for pressure myography: 300
Lumen solution for pressure myography: 300

*11

Table 1. Components of solutions used in the experiment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Passmore, G. M. KCNQ/M Currents in Sensory Neurons: Significance for Pain Therapy. J. Neurosci. 23, 7227-7236 (2003).
  2. Falloon, B. J. Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 268, H670-H678 (1995).
  3. Dunn, W. R. Enhanced resistance artery sensitivity to agonists under isobaric compared with isometric conditions. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 266, H147-H155 (1994).
  4. Buus, N. H. Differences in sensitivity of rat mesenteric small arteries to agonists when studied as ring preparations or as cannulated preparations. Br. J. Pharmacol. 112, 579-587 (1994).
  5. Abdelhalim, M. A. Effects of big endothelin-1 in comparison with endothelin-1 on the microvascular blood flow velocity and diameter of rat mesentery in vivo. Microvasc. Res. 72, 108-112 (2006).
  6. Altura, B. M. Dose-response relationships for arginine vasopressin and synthetic analogs on three types of rat blood vessels: possible evidence for regional differences in vasopressin receptor sites within a mammal. J. Pharmacol. Exp. Ther. 193, 413-423 (1975).
  7. Henderson, K. K. Vasopressin-induced vasoconstriction: two concentration-dependent signaling pathways. J. Appl. Physiol. 102, 1402-1409 (2007).
  8. Mackie, A. R. Vascular KCNQ potassium channels as novel targets for the control of mesenteric artery constriction by vasopressin, based on studies in single cells, pressurized arteries, and in vivo measurements of mesenteric vascular resistance. J. Pharmacol. Exp. Ther. 325, 475-483 (2008).
  9. Brueggemann, L. I. Differential effects of selective cyclooxygenase-2 inhibitors on vascular smooth muscle ion channels may account for differences in cardiovascular risk profiles. Mol. Pharmacol. 76, 1053-1061 (2009).
  10. Patch Clamp Technique. Kaneez, F. S. Intech. (2012).
  11. Berra-Romani, R. TTX-sensitive voltage-gated Na+ channels are expressed in mesenteric artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, H137-H145 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats