Murine Norovirus के लिए पट्टिका परख

Immunology and Infection
 

Summary

यहाँ हम एक murine (MNV) norovirus, जो केवल norovirus कि कुशलतापूर्वक सेल संस्कृति में replicates है संक्रामक कणों यों विधि का वर्णन है. पट्टिका परख murine मैक्रोफेज के लिए MNV tropism का लाभ लेता है और जैविक या पर्यावरण MNV युक्त नमूने के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

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Gonzalez-Hernandez, M. B., Bragazzi Cunha, J., Wobus, C. E. Plaque Assay for Murine Norovirus. J. Vis. Exp. (66), e4297, doi:10.3791/4297 (2012).

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Abstract

Protocol

1. बृहतभक्षककोशिका सेल 264.7 रॉ रेखा के संवर्धन

  1. DMEM 10-मीडिया में कच्चे 264.7 कोशिकाओं (ATCC, सूची # TIB 71), जो 10 (v / v)% कम endotoxin भ्रूण गोजातीय सीरम (<10 यूरोपीय संघ / एमएल) के साथ उच्च ग्लूकोज DMEM के होते हैं 10 मिमी HEPES रखें , 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 छ / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1 मिमी गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 2 मिमी एल glutamine. कोशिकाओं को आम तौर पर 175 सेमी 2 टिशू कल्चर फ्लास्क प्रति मीडिया की 35 मिलीलीटर युक्त बोतल में रखा जाता है और 37 पर incubated डिग्री सेल्सियस और 5% एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में सीओ 2. हालांकि, किसी भी आकार कुप्पी मीडिया कि फ्लास्क के आकार के लिए उपयुक्त है की एक मात्रा के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. कोशिकाओं को विभाजित: पुराने मीडिया aspirate, ताजा DMEM 10 मीडिया की कोशिकाओं को 10 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और फिर एक सेल खुरचनी का उपयोग करके फ्लास्क के नीचे से कोशिकाओं परिमार्जन. अगले, एक 10 मिलीलीटर विंदुक में कोशिकाओं ड्राइंग द्वारा एक समरूप समाधान में कोशिकाओं और resuspend जबरदस्ती विंदुक टिप जनसंपर्क के माध्यम से कोशिकाओं फैलाएंगेफ्लास्क के नीचे के खिलाफ essed. इस कार्रवाई में कम से कम 3 बार तो कोशिकाओं पेड़ों का झुरमुट नहीं रह एक साथ दोहराएँ. प्रकाश माइक्रोस्कोपी कि एक एकल कक्ष निलंबन उत्पन्न किया गया द्वारा सत्यापित करें. 2 मिलीलीटर (1:05 ​​कमजोर पड़ने या ~ 2x10 7 कोशिकाओं) सेल निलंबन का एक नया 175 सेमी 2 फ्लास्क, और मीडिया के अंतिम मात्रा लाने के लिए - तो फिर 1 (1:10 कमजोर पड़ने या ~ 1x10 7 कोशिकाओं) मिलीलीटर हस्तांतरण 35 मिलीलीटर.
  3. भाजित कोशिकाओं जब वे लगभग सहधारा (~ 1x10 8 कोशिकाओं total/175 सेमी 2 बोतल): हर तीन दिन अगर एक 1:10 कमजोर पड़ने, या हर दो दिन के साथ शुरू अगर एक 1:05 कमजोर पड़ने के साथ शुरू. प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए बंटवारे कोशिकाओं से पहले सेल आकारिकी की जांच करने के लिए. कोशिकाओं के अधिकांश दौर देखने के लिए नहीं है और सक्रिय होना चाहिए. सक्रिय कोशिकाओं granules और / या विस्तारित appendages के साथ पतली आकारिकी है. के रूप में उन कोशिकाओं को आमतौर पर सजीले टुकड़े फार्म नहीं है कोशिकाओं ऊंचा हो जाना नहीं है. पारित होने संख्या का ट्रैक रखें और अक्सर कोशिकाओं के पारित होने के एक कम अशेष भाजक विगलन द्वारा शुरू. (हम एक कट ऑफ के रूप में पारित होने के 30 का उपयोग करें).

2. रॉ MNV inoculum के साथ 264.7 कोशिकाओं को संक्रमित

  1. बीज रॉ 1x10 6 व्यवहार्य कोशिकाओं / DMEM 10-मीडिया में मिलीलीटर की एक घनत्व 264.7 6 अच्छी तरह प्लेटें (3.5 सेमी व्यास) में कोशिकाओं, और एक अच्छी तरह से इस निलंबन के 2 मिलीलीटर जोड़ें. यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं के कुओं में समान रूप से कम से कम 10 बार हाथ से प्लेटों कमाल द्वारा या ~ 10 मिनट के लिए एक कमाल तंत्र का उपयोग करके या तो वितरित. प्लेटें ज़ुल्फ़ के रूप में यह कोशिकाओं को अच्छी तरह से केंद्र में क्लस्टर के लिए कारण होगा मत करो. एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में प्लेस प्लेट (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2). कोशिकाओं रातोंरात या कम से कम 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस में संलग्न करने की अनुमति दें कोशिकाओं 60 होना चाहिए - 80% पट्टिका परख के लिए मिला हुआ है और अच्छी तरह से भर में समान रूप से वितरित की.
  2. अगले दिन, वायरस inoculum, जो टिशू कल्चर में MNV संक्रमित कोशिकाओं से या homogenized MNV संक्रमित चूहों के ऊतकों या fecal नमूने से किया जा सकता है तैयार. जब ऊतकों के नमूनों का उपयोग कर, अनुकरणीय मटर के आकारऊतक के eces 2 मिलीलीटर DMEM-10 के 1 मिलीलीटर में पेंच टोपी बाँझ सिलिका मोती युक्त एक ऊतक homogenizer (; रॉश जैसे MagnaLyser) का उपयोग ट्यूबों में homogenized हैं. Fecal नमूने के लिए, कोई 3 से अधिक fecal छर्रों 1 मिलीग्राम मीडिया में homogenized किया जाना चाहिए. सभी नमूनों तो (-80 डिग्री सेल्सियस) जमे हुए हैं और पट्टिका परख के प्रदर्शन से पहले एक बार thawed.
  3. पूरा DMEM 5 माध्यम है, जो DMEM / उच्च ग्लूकोज, 5% (v / v) कम endotoxin भ्रूण गोजातीय सीरम (<10 यूरोपीय संघ / एमएल), 10 मिमी HEPES, 100 के होते हैं में वायरस inoculum के 10 गुना dilutions की तैयारी यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 / ग्राम मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1 मिमी गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 2 मिमी एल glutamine.
  4. दस गुना धारावाहिक dilutions 24 अच्छी तरह प्लेटें में तैयार कर रहे हैं: एक पुनरावर्तक विंदुक कई कुओं में 1.35 मिलीग्राम मीडिया बांटना करने के लिए प्रयोग किया जाता है, 10 -1 कमजोर पड़ने 1.35 मीडिया के मिलीग्राम और वायरस युक्त नमूना 0.15 मिलीलीटर के मिश्रण से बना है, और तो 10 -1 कमजोर पड़ने के 0.15 मिलीलीटर मीडिया के 1.35 मिलीलीटर के लिए कहा है कि 10 -2 dilution और इतने पर. यह महत्वपूर्ण है युक्तियाँ हर बार जब आप एक नया कमजोर पड़ने बदल. एक multichannel विंदुक एक अच्छी तरह से एक 24-अच्छी तरह से अच्छी तरह से 0.15 प्रति मिलीलीटर की कुल मात्रा (चित्रा 3A देखें) के हस्तांतरण की थाली के रूप में एक समय में कई नमूने के dilutions दो सुझावों की फिटिंग के साथ बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  5. ऊतक homogenates और fecal सामग्री के लिए एक विशिष्ट कमजोर पड़ने रेंज 10 -1 से 10 -3 है. हालांकि, इन नमूनों से सजीले टुकड़े के लिए टिशू कल्चर के नमूने से उन लोगों की तुलना में छोटे होते हैं. इसके अलावा, कुछ मामलों में fecal नमूनों की एक 1:100 कमजोर पड़ने के लिए पर्याप्त रूप से बाहर मल कि सेल monolayer को बाधित कर सकते हैं किसी भी विषाक्त घटकों को कमजोर करने की जरूरत है, इस प्रकार सजीले टुकड़े गिनती करने की क्षमता निरोधक. टिशू कल्चर lysates के कमजोर पड़ने रेंज वायरल जीवन चक्र के दौरान ब्याज की समय बिंदु पर निर्भर करता है. Dilutions है कि 10 से -9 ऊपर जाना संक्रमण के चरम पर की जरूरत हो सकती है.
  6. धारावाहिक dilutions के बाद तैयार कर रहे हैं, अच्छी तरह से थाली 6 लेबलनमूना नाम और dilutions मढ़वाया जा रहा है के साथ रॉ 264.7 monolayers (2.1 अनुभाग से) युक्त. एक बार में एक थाली, यह बाहर flicking या यह aspirating सभी मीडिया को दूर. तुरंत बाद एक पतला नमूना के 0.5 मिलीलीटर जोड़ने के एक अच्छी तरह से है, तो अगले कमजोर पड़ने के साथ आगे बढ़ने से पहले एक नकली अच्छी तरह से दोहराएँ. एक बार सभी 3 dilutions एक थाली, प्लेट झुकाव जोड़ रहे हैं आगे और पीछे हाथ से सभी कोशिकाओं को सुनिश्चित करने के कवर किया गया है. संभाल करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को बाहर नहीं सूख जाएगा एक समय पर एक थाली.
  7. एक अच्छी तरह से करने के लिए dilutions की 0.5 मिलीलीटर जोड़ने के बाद, प्लेटें सीधा ढेर और उन्हें कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं. क्योंकि मात्रा हर अच्छी तरह से करने के लिए कहा monolayer पूरी तरह से कवर करने के लिए पर्याप्त नहीं है, प्लेट के लिए हर 10-15 मिनट के हाथ से धीरे आगे और पीछे झुका हुआ या एक कमाल तंत्र (~ प्रति मिनट 18 दोलनों) पर रखा जरूरत है. यह बाहर सुखाने से कोशिकाओं को रोकता है.

3. कम पिघलने बिंदु (SeaPlaque) ओवरले तैयारी agarose

  1. उपरिशायी प्लेटों की कुल मात्रा के लिए आवश्यक से पहले 1 घंटे ऊष्मायन पूरा हो गया है की राशि की गणना. जरूरत मात्रा 2 मिलीग्राम / अच्छी तरह से या 12 ml/6-well प्लेट है. Agarose (3.2 अनुभाग देखें) और मीडिया (3.3 अनुभाग देखें) अलग से तैयार करो.
  2. Agarose तैयार करते हैं, एक कांच की बोतल में आसुत जल (3% w / v) की 100 मिलीलीटर की कुल मात्रा में 3 SeaPlaque agarose के जी को स्थगित कर देते हैं. 20-30 मिनट के लिए आटोक्लेव. (यदि agarose पहले से ही हाथ, फिर से पिघल माइक्रोवेव में agarose से पहले तैयार किया गया था.) यह महत्वपूर्ण है 42 ° C उपयोग करने से पहले एक पानी में स्नान क्योंकि अगर agarose भी गर्म है, यह कोशिकाओं को मारने जाएगा SeaPlaque agarose संतुलन में लाना. सुनिश्चित करें कि जल स्तर के लिए या ऊपर agarose अवांछित solidification से बचने के स्तर के बराबर है.
  3. करने के लिए मीडिया को तैयार: 2x सदस्य मीडिया, जो होते हैं की 100 मिलीलीटर2x सदस्य, 10% (v / v) कम endotoxin भ्रूण गोजातीय सीरम (<10 यूरोपीय संघ / एमएल), 10 मिमी HEPES, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 / ग्राम मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन, 4 मिमी एल glutamine. 37 डिग्री सेल्सियस एक पानी में स्नान मीडिया समभार बनाना.
  4. एक 1:1 अनुपात में दोनों SeaPlaque agarose और एक बाँझ बोतल में 2x सदस्य एक साथ मीडिया के तुरंत मिक्स संक्रमित कोशिका monolayers overlaying पहले. यदि 200 से अधिक मिलीग्राम उपरिशायी की जरूरत है, कई बोतलों में विभाजित मात्रा और 37 में रहते हैं ° C पानी स्नान का उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक.
  5. 1 घंटा ऊष्मायन (2.7 अनुभाग देखें) के अंत में, प्रत्येक अच्छी तरह से inoculum बंद aspirate. प्रत्येक अच्छी तरह से किनारे करने के लिए धीरे धीरे प्रत्येक अच्छी तरह से दीवार के खिलाफ विंदुक टिप दे उपरिशायी के 2 मिलीलीटर जोड़ने. कोशिकाओं को बाहर सुखाने के बिना 5 प्लेटों को एक साथ संभाला जा सकता है.
  6. उपरिशायी ईमानदार प्लेटें टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में रखने से पहले कमरे के तापमान पर लगभग 10 मिनट के लिए जमना करने की अनुमति दें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 में 48 घंटे के लिए प्लेटें सेते हैं.
  7. के बादऊष्मायन अवधि, सजीले टुकड़े थोड़े बल से नग्न आंखों को दिखाई दे रहे हैं, तो सजीले टुकड़े की उपस्थिति के लिए अस्थिर प्लेटों की जाँच करें. अगर कोई सजीले टुकड़े दिखाई दे रहे हैं, एक अतिरिक्त 4 घंटे के लिए सेते हैं और फिर से जाँच करें. हालांकि, अधिकतम ऊष्मायन समय 72 घंटा से अधिक नहीं होनी चाहिए.

4. प्लैक्स तटस्थ लाल धुंधला द्वारा विज़ुअलाइज़ेशन

  1. 1x पीबीएस के हर 97 मिलीलीटर (टिशू कल्चर ग्रेड, 2 मिलीग्राम + -, सजीले टुकड़े कल्पना, तटस्थ लाल धुंधला हो समाधान तटस्थ लाल के 3 मिलीलीटर (सिग्मा N2889 # सूची 0.33% w / v DPBS में) को जोड़कर तैयार किया जाता है 2 + Ca - मुक्त, Gibco, सूची 10,010). 12 मिलीलीटर तटस्थ लाल धुंधला हो समाधान प्रत्येक 6 अच्छी तरह से थाली के लिए आवश्यक हैं: तटस्थ लाल धुंधला हो के प्रयोग के लिए आवश्यक समाधान की मात्रा की गणना. फिर, एक अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर जोड़ने. हालांकि कुछ पट्टिका परख प्रोटोकॉल agarose प्लग कुओं से हटाया जा करने की आवश्यकता होती है, इस प्रोटोकॉल में तटस्थ लाल धुंधला हो समाधान सीधे उपरिशायी पर जोड़ा जाता है.
  2. बाद में एक एक घंटा37 डिग्री सेल्सियस पर cubation, जांच अगर सजीले टुकड़े तटस्थ कुओं में अभी भी लाल रंग धुंधला हो जाना समाधान के साथ दिखाई दे रहे हैं. यदि सजीले टुकड़े तत्काल स्पष्ट नहीं कर रहे हैं, धुंधला हो जाना एक और घंटे के लिए जारी करने की अनुमति. जारी incubating तक सजीले टुकड़े दिखाई दे रहे हैं. (नोट: अधिक से अधिक 3 घंटे के लिए धुंधला इष्टतम नहीं है और अगर कोई सजीले टुकड़े सकारात्मक नियंत्रण नमूने में धुंधला हो जाना के 3 घंटा के बाद दिखाई दे रहे हैं, पट्टिका परख ठीक से काम नहीं किया.) धुंधला हो जाना करने के बाद पूरा हो गया है, तटस्थ लाल धुंधला हो समाधान निकालना agarose प्लग सुनिश्चित परेशान नहीं है और फिर सजीले टुकड़े की गिनती करने के लिए आगे बढ़ना.
  3. थाली उल्टा और एक प्रकाश बॉक्स पर रखने गिना सजीले टुकड़े पर एक डॉट अंकन डुप्लिकेट मायने रखता से बचने के सजीले टुकड़े गिनो. जहां सजीले टुकड़े को स्पष्ट रूप से अलग हो रहे हैं कुओं में सजीले टुकड़े गिनती कमजोर पड़ने (सजीले टुकड़े fusing का कोई दृश्य सबूत के एक साथ) अर्थात् चुनें. यदि संभव हो तो, दो dilutions सजीले टुकड़े गिनती. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि पट्टिका आकार MNV उपभेदों, वायरस inoculum के बीच भिन्न हो सकते हैं, पर निर्भर करता हैपट्टिका परख के दौरान रॉ 264.7 कोशिकाओं की हालत.
  4. अगर कोई सजीले टुकड़े एक अच्छी तरह से दिखाई दे रहे हैं, या तो वर्तमान नमूने में कोई वायरस या वायरस की राशि पट्टिका परख का पता लगाने की सीमा के तहत किया गया था. इस मामले में, कुओं अन्य पट्टिका युक्त कुओं के रूप में एक ही रंग के साथ लाल दाग. वैकल्पिक रूप से, सजीले टुकड़े के अभाव में भी मनाया जाता है जब भी वहाँ कई वायरल एक भी कमजोर पड़ने में मौजूद कण होते हैं. यह पूरे monolayer की lysis की ओर जाता है और कुओं / नारंगी पीले रंग में दिखाई देते हैं.
  5. वायरल titers की गणना. एक ही कमजोर पड़ने पर दोनों कुओं में सजीले टुकड़े की संख्या को जोड़ें और कमजोर पड़ने कारक (यानी 1 मिलीग्राम अगर 2 कुओं 0.5 मिलीलीटर से संक्रमित होते हैं) से गुणा करें. 1 मिलीलीटर की inoculum मात्रा में यह पट्टिका गठन इकाइयों की राशि (pfu) निकलेगा. 10 -2 कमजोर पड़ने पर चित्रा 4 में, उदाहरण के लिए, एक अच्छी तरह से (चिह्नित "द्वितीय) 14 सजीले टुकड़े और अन्य अच्छी तरह से (चिह्नित" वी ") 17 सजीले टुकड़े है. इस प्रकार, वायरल titer 14 हो जाएगा2 x10 + 2 17x10 +३,१०० = (3.1x10 3) pfu / मिलीलीटर.

5. प्रतिनिधि परिणाम

संक्रामक MNV 1 कण एक पट्टिका परख का उपयोग कर के रूप में चित्रा 1 में उल्लिखित schematically मात्रा निर्धारित किया जा सकता है चित्रा 2A रॉ 264.7 कोशिकाओं की एक बस संक्रमण के लिए पहले monolayer के साथ एक अच्छी तरह से पता चलता है, जबकि चित्रा 2B तीन दिखाई रोमन संख्याओं द्वारा संकेत मैं, द्वितीय सजीले टुकड़े से पता चलता है और एक अच्छी तरह से तृतीय. परख की व्यक्तिगत कदम आंकड़े में चित्रित कर रहे हैं के माध्यम से एफ चित्रा 3A 3A 10 गुना वायरस युक्त एक नमूना के कमजोर पड़ने श्रृंखला की तैयारी का पता चलता है चित्रा 3B dilutions के हस्तांतरण के लिए एक 6-अच्छी तरह से थाली के कुओं नकल से पता चलता है. चित्रा 3C कमाल 1 घंटा के लिए कमरे के तापमान पर inoculum के साथ कच्चे 264.7 कोशिकाओं सेते हैं तंत्र से पता चलता है चित्रा 3 डी से पता चलता है कोशिकाओं SeaPlaque साथ मढ़ा जा रहा है. सदस्यमिश्रण. 3E चित्रा ओवरले कठियाना करने की अनुमति के लिए कमरे के तापमान पर एक थाली से पता चलता है, जबकि चित्रा 3F कोशिकाओं को 0.01% तटस्थ लाल समाधान 48 घंटा के साथ दाग जा रहा है बाद में पता चलता है. 1-3 घंटे के लिए कोशिकाओं को धुंधला हो जाना और तटस्थ लाल धुंधला हो समाधान aspirating के बाद, सजीले टुकड़े दिखाई दे रहे हैं और (4 चित्रा) गिना जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 MNV पट्टिका परख प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध.

चित्रा 2
चित्रा 2 संक्रमण से पहले और सजीले टुकड़े के गठन के बाद एक monolayer की एक अच्छी तरह के प्रतिनिधि छवियाँ. एक) कच्चे 264.7 कोशिकाओं रातोंरात और imaged 20x बढ़ाई प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत सुसंस्कृत थे. बी) सेल 0.01% तटस्थ लाल समाधान के साथ 48 घंटे के बाद दाग थेसंक्रमण के आर और 4x बढ़ाई प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत visualized. रोमन संख्या मैं, द्वितीय, और तृतीय तीन दिखाई सजीले टुकड़े से संकेत मिलता है.

चित्रा 3
चित्रा 3 अलग पट्टिका परख कदम के प्रतिनिधि छवियों. ए) MNV 1 inoculum 10 गुना dilutions में तैयार किया जाता है. बी) inoculum डुप्लिकेट कुओं में सेल monolayers करने के लिए जोड़ा है. सी) कोशिकाओं और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए कमाल inoculum incubated हैं. डी) कोशिकाओं SeaPlaque agarose और 2x सदस्य मीडिया के एक 1:1 मिश्रण से मढ़ा जाता है. ई) प्लेट्स 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर incubated ओवरले कठियाना करने की अनुमति है. एफ) तटस्थ लाल धुंधला हो समाधान 48 घंटे के बाद संक्रमण के साथ कोशिकाओं के धुंधला.

चित्रा 4
चित्रा 4. सेल monol में MNV-1 रूपों सजीले टुकड़ेAyers. यहाँ दिखाया एक प्रतिनिधि पट्टिका परख प्लेट 48 घंटा के बाद संक्रमण है, ऊष्मायन के 1 घंटे के बाद तटस्थ लाल धुंधला हो समाधान के साथ दाग सजीले टुकड़े दिखा. प्लेट तीन 10 गुना dilutions की नकल कुओं से पता चलता है. मैं और चतुर्थ 10-1 कमजोर पड़ने के अनुरूप रोमन संख्या के साथ लेबल वेल्स, द्वितीय और वी 10-2 कमजोर पड़ने के अनुरूप, तृतीय और छठी 10-3 कमजोर पड़ने के अनुरूप. नमूना के वायरल titer नीचे दिया गया है (गणना की जानकारी के लिए देखें धारा 4.5).

Discussion

MNV-1 के लिए पट्टिका परख विधि यहाँ प्रस्तुत बढ़ाता संक्रामक MNV कणों का एक तरीका है. परख 3 चित्र में सचित्र चरणों का अनुसरण करके, एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य वायरल titers प्राप्त कर सकते हैं. परख का पता लगाने की सीमा शुरू कमजोर पड़ने पर निर्भर करता है. जब नमूना ऊपर वर्णित के रूप में एक 1:10 कमजोर पड़ने के साथ शुरू, पट्टिका परख का पता लगाने की सीमा pfu 10 (यानी, 1 10 -1 कमजोर पड़ने पर दिखाई पट्टिका) है. चूंकि प्रत्येक पट्टिका एक वायरस का प्रतिनिधित्व करता है, पट्टिका परख भी अलग सजीले टुकड़े उठा और प्रचार के रूप में उन्हें एक पहले से वर्णित MNV की clonal आबादी को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, पट्टिका Purifications भी मिश्रित वायरस आबादी से एक व्यक्ति वायरस आबादी को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. MNV संक्रमण का पता लगाने के लिए एक पट्टिका परख का उपयोग की एक सीमा है कि सभी MNV नहीं उपभेदों सजीले टुकड़े फार्म 4. हालांकि, यह संभव हो सकता inabili दूर कर सकते हैंty कुछ MNV उपभेदों, जानवरों से अलग, serially ऊतक संस्कृति 7 में इन वायरस passaging सजीले टुकड़े के रूप में की. पट्टिका परख के लिए एक विकल्प के लिए TCID 50 3 तकनीक, 4 के माध्यम से संक्रामक कणों को मापने के लिए है. इस परख वायरस की राशि inoculated ऊतक endpoint dilutions और 1 सप्ताह लेता 4 MNV के लिए पूरा के बाद संस्कृति कोशिकाओं के 50% में CPE का निर्माण करने के लिए आवश्यक quantifies. एक पट्टिका परख की तुलना में धीमी होने के अलावा, TCID 50 परख भी संवेदनशील के रूप में नहीं है (पता लगाने की सीमा = 200 TCID 50 मिलीग्राम /) ऊतकों के नमूनों की रॉ 264.7 4 कोशिकाओं को विषाक्तता के कारण.

हालांकि प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम प्रोटोकॉल भर में वर्णित किया गया है, निम्न अनुभाग एक सारांश के लिए मुसीबत शूटिंग की सुविधा प्रदान करता है. प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि रॉ 264.7 कोशिकाओं वायरस प्रतिकृति का समर्थन परख भर में व्यवहार्य रहना है. यह कर सकते हैंप्रकाश माइक्रोस्कोपी के माध्यम से परख के प्रत्येक चरण पर नजर रखी. सेल व्यवहार्यता दो मायनों में यह सुनिश्चित किया है. सबसे पहले, ध्यान नहीं जाने के लिए कोशिकाओं को बाहर सूख जबकि प्लेटों से निपटने के लिए लिया जाना चाहिए. इस प्रकार, प्लेटें एक समय में एक inoculated हैं, संक्रमण अवधि के दौरान हिलाकर रख दिया, और रहते हैं जब भी वे नहीं संभाला जा रहा है कर रहे हैं बंद कर दिया जाना चाहिए. दूसरा, समाधान कोशिकाओं पर जोड़ा ~ 37 ° सी. equilibrated होना चाहिए इसके अलावा, यह रॉ 264.7 कोशिकाओं के समग्र स्वास्थ्य के लिए उन्हें कम endotoxin सीरम (<10 यूरोपीय संघ / एमएल) है, जो कोशिकाओं की सक्रियता सीमा वाले मीडिया में बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, हम एक उच्च पट्टिका परख की असफलता की दर मनाया है जब 30 मार्ग या अधिक से कोशिकाओं का उपयोग कर रहा है. हालांकि इस संभावना प्रयोगशाला से प्रयोगशाला के लिए अलग अलग होंगे, यह महत्वपूर्ण है के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण शामिल हैं (उदाहरण के लिए, एक ज्ञात वायरल titer साथ एक नमूना) प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य titers सुनिश्चित करने के लिए, खासकर जब उच्च बीतने के रॉ 264.7 कोशिकाओं का उपयोग. उच्च बीतने के कोशिकाओं के उपयोग को सीमित करने के लिए, यह सलाह दी जाती है जल्दी Passa की शीशियों फ्रीजरॉ 264.7 कोशिकाओं की रसीद और जमे हुए शीशियों से एक नई संस्कृति अक्सर शुरू पर जीई कोशिकाओं. कम बीतने के सेल संस्कृतियों के साथ शुरू में भी सहायक हो सकता है जब कोशिकाओं प्रदर्शन का पालन करना, सेल आकारिकी में परिवर्तन (पतली दौर से जैसे और बाहर फैल) विफलता के रूप में बदल विशेषताओं, या जब mycoplasma संदूषण का पता चला गया है. एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु को ध्यान देना करने के लिए सुनिश्चित करें कि विंदुक युक्तियाँ नमूनों के बीच और dilutions दौरान बदल रहे हैं. यह सही धारावाहिक dilutions सुनिश्चित करने के लिए और नमूने के बीच पार संदूषण को रोकने जाएगा. प्रोटोकॉल जहां एक ही विंदुक टिप फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है में एक कदम है जब एक ही नमूना के धारावाहिक dilutions कुओं को जोड़ रहे हैं. उस मामले में, एक सबसे पतला inoculum से कम से कम करने के लिए शुरू करना चाहिए और सख्ती पिपेट और नीचे जब एक नई कमजोर पड़ने ड्राइंग.

पट्टिका परख प्रोटोकॉल में कई संशोधनों को संशोधनीय है. एक संशोधन है कि टी जब बनाया जा सकता हैयहाँ दो प्रतियों में कुओं inoculating के लिए पर्याप्त कोशिकाओं नहीं कर रहे हैं प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए केवल एक ही अच्छी तरह से टीका लगाना है. हालांकि, बाद से inoculum मात्रा 0.5 मिलीग्राम है, सजीले टुकड़े की संख्या तो pfu / मिलीलीटर के लिए मानक के अनुसार 2 की एक कारक से गुणा किया की जरूरत है. पट्टिका परख भी किसी अन्य पक्षपाती सेल लाइन है कि MNV की प्रतिकृति का समर्थन करने में सक्षम है के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और इस murine microglial BV-2 कोशिका 8 लाइन के लिए वर्णित किया गया है. अन्य संशोधनों के लागू किया जा सकता है कि रूपांतरों कि पट्टिका परख अन्य वायरस के लिए विकसित प्रोटोकॉल के लिए वर्णित किया गया है. MNV के मामले में निम्न संशोधन पहले से ही सफलतापूर्वक लागू किया गया है, मिथाइल सेलूलोज सागर फलक की बजाय 9 agarose, और कोशिकाओं के क्रिस्टल बैंगनी या तटस्थ लाल 10, 11 के बजाय नीले methylene साथ धुंधला हो जाना का उपयोग करें.

कुल मिलाकर, यह आसानी से प्रोटोकॉल के रूप में अन्य पट्टिका गठन वायरस यों की जरूरत है या अन्य संगठनों के लिए इस्तेमाल किया अनुकूलित किया जा सकता हैएर वायरस है कि रॉ 264.7 कोशिकाओं में lytic संक्रमण के कारण, यह सामान्य में संक्रामक वायरल कणों यों के लिए एक उपयोगी उपकरण बना रही है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम महत्वपूर्ण टिप्पणियों और सुझावों के लिए वोबुस प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद. CEW की प्रयोगशाला में काम शुरू हुआ धन के द्वारा मिशिगन विश्वविद्यालय, NIH / NIAID जैव रक्षा के लिए उत्कृष्टता के क्षेत्रीय केंद्र और उभरते संक्रामक रोग (RCE) रिसर्च प्रोग्राम, क्षेत्र वी महान 'से एक कैरियर विकास अनुदान से वित्त पोषित किया गया था Lakes (एनआईएच 1-U54 - ऐ - ०५७१५३ पुरस्कार) RCE और NIH R01 AI080611. MBG - एच. प्रायोगिक (T32 A1007413-16 एनआईएच) इम्यूनोलॉजी और माइक्रोबियल रोगजनन में आणविक तंत्र (T32 A1007528 एनआईएच) प्रशिक्षण अनुदान मिशिगन विश्वविद्यालय के लिए वित्त पोषित है. JBC Coordenação डे Aperfeiçoamento डे Pessoal डे Nível (capes) सुपीरियर, ब्रासीलिया, ब्राजील द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/ High glucose Hyclone SH30243.02
2x MEM Gibco 11935
100x Penicillin and streptomycin Hyclone SV30010
10 mM Non-essential amino acids Hyclone SH30238.01
1M HEPES Hyclone SH30237.01
200 mM (100x) L-glutamine Hyclone SH30034.01
Fetal Bovine Serum Gibco, Hyclone 10437, SH30070.02
Sea Plaque Agarose Lonza 50100
Neutral Red 0.33% Sigma N2889
1x PBS Gibco 10010
1.0 mm Zirconia/Silica beads BioSpec Products 11079110z
Model 35 Speed Rocker Labnet S2035
Magna Lyser Instrument Roche 03358968001
Raw 264.7 cell line ATCC TIB-71
Tissue culture incubator Sanyo MCO-18AIC

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References

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Comments

2 Comments

  1. I am very happy to read your paper   here I have a question about Low Melting Point Agarose (SeaPlaque) Overlay Preparation   DMEM medium was used in RAW²64.7 cell culture and ²*MEM was used in overlay   why   Thank you!

    Reply
    Posted by: Shengnan T.
    April 22, 2013 - 10:52 PM
  2. Hi,
    I'm having a bit of trouble titering my virus. The virus is lysing the cells during the infection process but when I go to do plaque assay I have no plaques. Any suggestions?

    Reply
    Posted by: Thomas Y.
    August 27, 2013 - 12:06 PM

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