Ikke-invasiv optisk avbildning av Lymfatisk blodkar av en mus

Published 3/08/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Nylig utviklet imaging teknikker som bruker nær-infrarødt fluorescens (NIRF) kan bidra til å klargjøre hvilken rolle lymfesystemet spiller i kreft metastasering, immunrespons, sår reparasjon og andre lymphatic-assosierte sykdommer.

Cite this Article

Copy Citation

Robinson, H. A., Kwon, S., Hall, M. A., Rasmussen, J. C., Aldrich, M. B., Sevick-Muraca, E. M. Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse. J. Vis. Exp. (73), e4326, doi:10.3791/4326 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Lymphatic karsystemet er en viktig del av sirkulasjonssystemet som opprettholder væske homeostase, gir immun overvåking, og formidler fettopptaket i tarmen. Men til tross for sin kritiske funksjon, er det forholdsvis liten forståelse av hvordan lymfesystemet tilpasser seg betjene disse funksjonene i helse og sykdom 1. Nylig har vi vist evne til å dynamisk bilde lymphatic arkitektur og lymfe "pumpe" handling i normale mennesker, så vel som hos personer som lider lymphatic dysfunksjon bruker Trace administrasjon av en nær-infrarødt lysrør (NIRF) fargestoff og en tilpasset, Gen III- intensivert imaging system 2-4. NIRF bildebehandling viste dramatiske endringer i lymfatisk arkitektur og funksjon med sykdom hos mennesker. Det er fortsatt uklart hvordan disse endringene skjer og nye dyremodeller blir utviklet for å belyse deres genetiske og molekylære basis. I denne protokollen, presenterer vi NIRF lymphatic, small dyr bildebehandling 5,6 med indocyanine grønn (ICG), et fargestoff som har vært brukt i 50 år hos mennesker 7, og en NIRF dye-merket syklisk albuminbinding domene (cABD-IRDye800) peptid som fortrinnsvis binder mus og menneskelig albumin 8 . Ca 5,5 ganger sterkere enn ICG har cABD-IRDye800 en lignende lymfatisk klaring profil og kan injiseres i mindre doser enn ICG å oppnå tilstrekkelige NIRF signaler for imaging 8. Fordi begge cABD-IRDye800 og ICG binder seg til albumin i interstitialrommet 8, kan de begge skildre aktivt protein transport inn i og innenfor lymfekar. Intradermal (ID) injeksjoner (5-50 pl) av ICG (645 uM) eller cABD-IRDye800 (200 uM) i saltløsning blir administrert til dorsal aspekt av hver bakpote og / eller til venstre og høyre side av bunnen av halen på et isofluran-bedøvet mus. Den resulterende fargestoff-konsentrasjonen i dyret er 83-1,250 ug / kg for ICG eller 113-1,700 ug / kg forcABD-IRDye800. Umiddelbart etter injeksjoner, er funksjonell lymphatic bildebehandling utført for opptil 1 time ved hjelp av en tilpasset, små dyr NIRF imaging system. Hel dyr romlig oppløsning kan skildre fluorescerende lymfekar på 100 mikron eller mindre, og bilder av strukturer inntil 3 cm i dybden kan erverves 9. Bildene er kjøpt ved hjelp av V + + programvare og analysert ved hjelp av ImageJ eller MATLAB programvare. Under analysen, er påfølgende regioner av interesse (ROIs) omfatter hele kardiameteren trukket langs en gitt lymfe fartøy. Dimensjonene for hver ROI holdes konstant for en gitt fartøy og NIRF intensitet måles for hver ROI til kvantitativt vurdere "pakker" av lymfe beveger gjennom fartøy.

Protocol

Alle dyrestudier ble utført i samsvar med standarder for University of Texas Health Science Center (Houston, TX), Institutt for sammenliknende Medicine og Senter for Molecular Imaging etter vurdering og godkjenning av protokollen av deres respektive Institutional Animal Care og bruk komité (IACUC) eller Animal Welfare Committee (AWC).

1. Utarbeidelse av Dyr 24 Hr Før Imaging

Trinnene nedenfor må gjøres (som nødvendig) dagen før lymfatiske avbildning finner sted.

  1. Sted dyr i en induksjon boksen og sedate med isofluran.
  2. Når dyret er i en tilstand av dyp anestesi (overvåket med tå-pinch manøver), place bedøvet dyr på en bleie / fluff pad og posisjon nesen i en nese kjegle tilkoblet isofluran gass.
  3. Klipp alle hår / pels (hvis noen) rundt området som skal avbildes.
  4. Påfør riktige agent (NAIR) til klippet området og la det on huden for opptil 3 min.
  5. Tørk forsiktig av alle riktige middel med varm, fuktig gasbind eller papirhåndkle.
  6. Forsiktig skylle huden med varmt vann og forsiktig tørke området med gasbind eller papirhåndkle.
  7. Tillater dyr å gjenopprette på en oppvarming puten eller under en varmelampe, og gå tilbake til buret sitt.

2. Day of Imaging

  1. Tilbered billeddannende middel med sterilt vann, og deretter fortynne med steril, normal (0,85%) saltvann for å oppnå 645 uM (5 μg/10 ul) i ICG eller 200 uM (6,8 μg/10 ul) i cABD-IRDye800. Hold løsninger i mørket forhold og bruk innen 6 timer etter tilberedning.
  2. Sted dyr i en induksjon boksen og sedate med isofluran.
  3. Når dyret er i en tilstand av dyp anestesi (overvåket med tå-pinch manøver), sted bedøvet dyret på sin side på en bleie / lo pad og posisjon nesen i en nese kjegle koblet til gass isofluran.
  4. Slå av lysene (slik at rommet ermørkt). Hvis nødvendig, kan et lite bord halogenlys brukes til en liten mengde lys å se injeksjoner.
  5. Bruke en insulinsprøyte med en 31-gauge nål, injiserer ID 5 pl til 50 pl ICG eller cABD-IRDye800 i dorsal aspekt av hver bakpote og / eller på den venstre og høyre side av haleroten, avhengig området av interesse (se diskusjon). Hver injisert dose kan variere 0.083 til 1.25 mg / kg (ICG) eller 0.113 til 1.7 mg / kg (cABD-IRDye800). Injeksjonsvolumer vil variere med dyr belastning og injeksjonsstedet. For atymiske mus, kan volumet av injeksjon være 5 pl (bakpote) eller 10 pl (halefestet). Hvis dyret ikke er under avbildningssystem for injeksjonen (e), plasserer dyret under bildesystem umiddelbart etter injeksjon (s).
  6. Hvis ingen fargestoff opptak er sett i lymfekar, vil trinn 2,5 må gjentas etter behov per dyr protokollen.
  7. Når lymfekjertlene er sett, dekke injeksjonsstedet med svart elektrisk tape eller sort paper.
  8. Erverve lymphatic bilder i opptil 1 time ved hjelp av V + + programvare og et lite dyr, NIRF imaging system. (Dyr er bedøvet med isofluran og respirations overvåkes mens bilder er å anskaffe.) Selv små dyr, NIRF kameraene er kommersielt tilgjengelig, benytter vi et tilpasset, små dyr NIRF imaging system bestående av en 785-nm laser diode (1005-9mm-78503 , Intense, North Brunswick, NJ) utstyrt med en asfærisk linse (C24TME-B, Thorlabs, Newton, NJ), diffusor (ED1-C20, Thorlabs) og filter (LD01-785/10-25, Semrock, Rochester, NY ) for å skape en enhetlig eksitasjon felt som lyser dyret på en hendelse fluence rate på mindre enn 1,4 mW per kvadratcentimeter 10. Et elektron multiplisere ladet-coupled device (EMCCD, PhotonMax512, Princeton Instruments, Trenton, NJ) kamera system med to 830-nm filtre (AND11333, Andover Corp, Salem, NH) og en 28-mm Nikkor-objektiv (1992, Nikon, Melville, NY) brukes til å fange lymfatiske bilder med integrering times på 200 msek for dynamisk bildebehandling og 800 msek for statisk avbildning 5. Se figur 1 for systemkonfigurasjon, Table for ytterligere detaljer om hver komponent, og diskusjon for en kort diskusjon av sentrale Imager egenskaper.
  9. Tillater dyr å gjenopprette på en oppvarming puten eller under en varmelampe og gå tilbake til buret sitt, eller avlive.
  10. Analysere bilder ved hjelp ImageJ eller MATLAB programvare. Se Figur 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eksempel på NIRF Lymfatisk Imaging i Mus

Når ICG eller cABD-IRDye800 injiseres ID på haleroten av en normal mus, bør det lymfatiske vaskulaturen mellom injeksjonsstedet ved haleroten og inguinal lymfeknute (LN) være umiddelbart visualisert. Kort etter injeksjon (noen få sekunder til minutter), bør det lymfatiske fartøyet mellom inguinal LN og aksillær LN bli visualisert som vist på fig 2. Siden lymfekar i mus varierer fra dyr til dyr som de gjør i mennesker, kan variasjon i arkitektur mellom dyr sees som vist i figur 3.. Når ICG eller NIRF-cABD injiseres ID på dorsal aspektet av bakpote av en normal mus, kan to lymfekar bli visualisert drenering til popliteal LN som vist i Figur 4. I noen tilfeller er det vanskelig å skille begge fartøyer på grunn av deres nærhet til hverandre.

Til tider er visualisering av lymfekar forsinket, vanligvis på grunn av injeksjonen blir administrert subkutant (SC) i stedet for ID. Når SC injeksjoner gis, kan lymfatisk transport ikke umiddelbart visualisert som sett i figur 5 (a) på grunn av den ekstra tid som kreves for å nå fargestoff og tas opp av det lymfatiske kapillærene i huden. Dette er grunnen til at det er viktig å injisere ID istedenfor SC. Noen ganger blir unormale lymfekar observert, som sett i figur 5 (b), i området av et sår som en bit eller kutt fra hår / pels clippers. Dyrets kroppstemperatur bør opprettholdes innenfor normalområdet, som endrer kroppstemperatur kan føre inkonsekvent lymfatisk funksjon. Begrensninger av teknikken er formørkelse av fluorescerende lymfekar av pigment i huden, manglende evne til å image de dype thorax lymphatic kanaler grunnå lysspredning i vevet, og det ukjente effekten av anestesi på lymfatisk funksjon.

Vanligvis tar det ID depot av ICG eller cABD-IRDye800 opp til 2 dager for å fjerne leveren og blære, og opp til 3 dager for å fjerne injeksjonsstedet. Når gjenværende fluorescenssignalet er klarert, kan det bildedannende protokollen gjentas, slik langsgående lymphatic imaging å evaluere endringer i arkitektur eller lymfe funksjon etter noen inngrep.

Analyse av Lymfatisk Funksjon

De oppkjøpte bilder kan lastes inn i ImageJ eller MATLAB for dataanalyse. Konstant-område, er sirkulære ROIs valgt eller "trekkes" langs hele lengden av det fluorescerende lymfatiske fartøyet som på humant 10 og dyr 5 lymfatiske avbildning som vist i fig 6 (a) og figur 6 (d). Den ROIs velges slik at deres diameter er omtrent diameteren av bildet av fluorescent fartøy. Den midlere fluorescensintensitet innenfor hvert ROI plottes som en funksjon av tid til bildebehandling vurdere propulsive hastigheten og frekvensen av "pakker" fargestoff-laden lymfe propelled langs lymfekar som vist i figurene 6 (b) og figur 6 (e ). Å vurdere lymfatiske forplantningshastighet og frekvens av lymfatisk fremdrift, blir to ROI-tallet, med klart definerte maksimum eller minima fluorescerende intensitetsvariasjoner representerer forplantningen av pakker av lymfe, er valgt og deres fluorescerende belastningsprofiler plottes inn som vist på fig 6 (c) og 6 (f). Overføringssystemet hastighet beregnes ved å ta forholdet av avstanden mellom de to ROI tallet og overføringstiden for en pakke av lymfe å forplante mellom dem. Ved å vurdere antall fluorescerende pulser eller "pakker" som ankommer på et enkelt roi per tid, er kontraktile frekvensen beregnet. Mens denne teknikken er den eneste metoden for å Assess fremdrift frekvens og hastigheten av et drivgass lymfatisk "pakke", andre har indirekte evaluert lymfatisk transport ved å måle depot clearance av en billeddannende middel og dermed beregne fjerning hastighetskonstanter 11. I kreft metastaser 10 og tidlig infeksjon, finner vi tap av lymfatisk fremdrift i dyr. Andre rapportere endringer i kontraktilitet i respons til leddgikt 12. Hos mennesker, rapporterer vi økt fremdrift etter lymfødem behandlinger inkludert pneumatisk kompresjon drenering 13 og manuell lymfedrenasje (massasje) 14.

Figur 1
Figur 1. Den NIRF imaging system er spesialbygd for små dyr lymphatic imaging. Enheten består av en 785-nm laser diode utstyrt med en asfærisk linse, diffuseh og filtre for å skape en enhetlig excitation felt som lyser opp dyret og en EMCCD kamera, med fokus linse og optiske filtre for å ta bilder av fluorescerende lymfe 10.

Figur 2
Figur 2. Når 10 pl ICG eller cABD-IRDye800 injiseres ID på haleroten av en normal mus ved hjelp av en 31-gauge nål, det lymfatiske vaskulaturen mellom injeksjonsstedet ved haleroten og inguinal lymfe LN skal være umiddelbart visualisert. Dynamiske fluorescens bilder er ervervet umiddelbart etter injeksjon og i opptil 20 min etter injeksjon. Kort tid etter injeksjon (noen sekunder til minutter), lymfekar mellom injeksjonsstedet og inguinal LN og senere til aksillær LN-regionen er visualisert på den laterale visningen. Bildet vist i figur 2 ble tatt 5 min. etter injeksjon with 10 pl ICG ID ved haleroten. Den lyse flekken mellom inguinal og axillaris regioner er leveren.

Figur 3
Figur 3. Siden lymfekar i mus varierer fra dyr til dyr som de gjør hos mennesker, kan variasjon i arkitektur mellom dyr bli sett og er stabil over tid. Mus # 124 ble injisert med ICG ved haleroten og avbildes umiddelbart på dag 1. Topplaten inneholder bildet oppnådd på dag 1 samt et bilde oppnådd 2 dager senere (dag 3) ved hjelp av den samme mus og injeksjon / bildebehandling protokollen. Den nederste panelet inneholder bilder hentet fra en annen mus (# 127) injisert med ICG og umiddelbart avbildet dag 1 og deretter fotografert på dag 3. Mens det lymfatiske arkitektur (mønsteret av lymfekar) varierer mellom mobruke # 124 og # 127, bildene innhentet ved hjelp av NIRF er konsistente for hver mus på dag 1 og 3.

Figur 4
Figur 4. Når 5-10 ul ICG eller NIRF-cABD injiseres ID på dorsal aspekt av bakpote av en vanlig mus, bør to lymfekar bli visualisert drenering til popliteal LN. Dynamiske fluorescens bilder er ervervet umiddelbart etter injeksjon og i opptil 20 min etter injeksjon. I noen tilfeller er det vanskelig å skille begge fartøyene grunn av deres nærhet som illustrert i det forstørrede bildet representert ved den stiplede boksen. For den representative musen vist her, ble 10 pl av ICG injisert i dorsal aspektet av venstre, bakpote (første injeksjonsstedet) og i den venstre side av halen base (andre injeksjonsstedet). Dette bildet var captured ca 2 - 3 min etter første injeksjon og ca 30 sek - 1 min etter den andre injeksjonen.

Figur 5
Figur 5. (A) og til visualisering av lymfekar blir forsinket eller svekket, vanligvis på grunn av injeksjonen blir administrert subkutant istedenfor ID. Når 10 ul ICG eller cABD-IRDye800 injiseres SC ved haleroten av en normal mus ved hjelp av en 31-gauge nål, vil lymfatisk transport ikke være umiddelbart visualisert grunn av den ekstra tid som kreves for å nå og fargestoff tas opp av lymfatiske kapillærene i huden. Også, på grunn av den relativt dype SC injeksjon, kan det ikke være noen lymfatisk opptak og derfor ingen visualisering av fartøyene og lymfeknuter. I figur 5 (a), Ble en mus injisert med 10 pl ICG ved haleroten SC og bilder ble ervervet 5 min etter injeksjon. Fargestoff på injeksjonsstedet kan bli visualisert og ingen lymfekar eller lymfeknuter kan visualiseres. Dette er grunnen til ID-injeksjoner er viktig. (B) Visualisering fra dyrets ventral side av avvikende lymfekar som følge av et sår oppstått en dag tidligere under pels fjerning med clippers (vevsskade nettstedet bemerket på dyrets høyre side). Bildet ble tatt ca 5 min etter 10 ul ICG ble administrert ID på haleroten på hver høyre og venstre side. På den ikke-skadde (dyrets venstre) side, kan inguinal LN bli visualisert samt relativt rett efferente lymfe fartøy drenering opp mot axillaris LNS. På musens høyre side, men ble normal lymph vaskulatur avbrutt på grunn av såret og synes avvikende grunn vev reparasjon (scabbing).


Figur 6. Kvantitativ analyse av lymfatisk kontraktile funksjon består av å velge ROIs langs lymfekar drenering fra (a) inguinal LN til aksillær LN og (d) injeksjonsstedet på dorsal aspektet av poten til popliteal LN. Et forstørret bilde (innfelt i (a)) av den røde stiplede rektangelet illustrerer valget av ROIs langs fluorescerende fartøyet. En sammenstilling av gjennomsnittlig fluorescens intensitet som en funksjon av tid for alle ROIs fra (a) og (d) er representert ved den pseudo-farge tomten vist i (b) og (e), respektivt. Forstyrrelsene i fluorescensintensitet tvers piksler representere et lymfatisk "puls" forplanter seg gjennom den ROIs og are parallelt med pilene. Gjennomsnittlig fluorescensintensitet for enkelt Rois 22 og 45 fra (b) er vist i (c) og den gjennomsnittlige fluorescensintensitet for enkelt Rois 18 og 34 fra (E) er vist i (f). Fluorescensintensitet profiler som en funksjon av tid (som vist i (c) og (f)) lette identifisering av pakker av forplanter lymfe og uttrekkingen av transittiden og avstand mellom to ROIs. De to ROIs velges delvis basert på deres plassering langs lymfesystemet fartøyet og klarhet som maksimum og minima representerer lymfe forplantning vises. Velocity beregnes som forholdet mellom avstanden mellom to ROIs og gangtiden som er tatt mellom utslaget fluorescensintensitet. Klikk her for å vise større figur


Figur 7. Å visualisere lymfekar drenering fra inguinal regionen til aksillær regionen, injiserer venstre eller høyre side av haleroten. Generelt, for å visualisere den venstre side, injiserer i 5 sted, 6, 9 eller 10, og for å visualisere den høyre side, injiserer i plasseringen 7, 8, 11, eller 12. Steder 1 til 4 kan være for dårlig på halen for optimal opptak å visualisere lymfedrenasje fra inguinal regionen til aksillær regionen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi bruker en tilpasset, små dyr NIRF imaging system for å ta bilder av merket lymfeårer i mus. Å konstruere filmer av lymph bevegelse, 300 eller flere bilder samles. For funksjonell analyse av lymfekar fra filmer, er to eller flere ROIs manuelt trukket langs en lymph fartøy. Dimensjonene på ROIs holdes konstant for hvert fartøy, og er omtrent diameteren av fartøyet. Mens hele dyret romlig oppløsning kan skildre fluorescerende lymfekar på 100 mikron eller mindre, kan en macrolens for finere oppløsning benyttes 10. Hvitt lys bilder for anatomisk referanse kan også skaffes ved hjelp av en lav-effekt lampe. Det bør bemerkes at hvis bildebehandling agenter består av andre fluorescerende fargestoffer med forskjellig eksitasjon / fluorescensemisjonen spektra, deretter filtrene beskrevet ovenfor må endres for å opprettholde bildeytelse, og agent dosering være nødvendig å justere også. Også, hvis eksitasjonsbølgelengde er less enn 750 nm, så autofluorescens kan føre, bakgrunn signal vil øke, og bildebehandling sensitivitet vil avta. I tillegg kan ustabilitet av agenter i løsning utelukker bruk av noen NIRF fargestoffer, for eksempel Cyanine 7 (Cy7).

Valg av riktig injeksjonsstedet vil avhenge av hvilke lymfekar blir studert. Å visualisere lymfekar drenering fra inguinal regionen til aksillær regionen, må du injisere venstre eller høyre side av haleroten, som vist i Figur 7. Å visualisere lymfekar drenering fra palatial regionen, må du injisere dorsal aspektet av bakpote. Det er viktig å holde dyrets kroppstemperatur innenfor normalområdet, som å endre kroppstemperatur kan føre til inkonsekvent lymphatic funksjon. I tillegg, på grunn av den begrensede dynamiske område for de fleste ccds bør injeksjonsstedene dekkes med sort papir å blokkere lysstoffrør thereby slik visualisering av dimmer drenering lymfekar. Imaging bør utføres i et mørkt rom for å redusere uønskede bakgrunnssignaler grunn utslipp av lys i fluorescens band fra rommet lysene. Dyret må også ligge på en svart bakgrunn, mens avbildning blir utført for å redusere lys tilbakespredning.

NIRF lymphatic bildebehandling kan muliggjøre en bedre forståelse av lymfatisk sykdommer og hvordan lymfatisk arkitektur og funksjon endringer med hensyn til sykdom eller skade. For eksempel har forskerne brukt NIRF bildebehandling i små dyr for å gi lymfatisk fenotyping av dyr 6,15 og å oppdage endringer i lymfatisk funksjon og arkitektur med kreft metastaser 10. Hos mennesker, har teknikken blitt brukt til å oppdage tidlige tegn på lymfødem 2, vurdere respons på lymfødem 13,14,16 terapi, og fenotype familiemedlemmer med arvelige lymfatiske lidelser. Imidlertid, ikke-invasiv visualization av dype lymfekar (> 3 cm) i mennesker er begrenset av scatter av lys i vev. Bilder av lymphatic strukturer opp til 3 cm i dybden er kjøpt i svin 9 og menneskelig bildebehandling. Hos mennesker har MR og dynamisk lymphoscintigraphy blitt brukt til å kvantifisere overføringstiden av kontrastmiddel fra injeksjonsstedet til lymfeknutene i sykdom. Men de mangler tilstrekkelig temporal og romlig oppløsning å visualisere lymfatisk fremdriftssystemer hendelser lett bilde av med NIRF. I tillegg, sunne lymfekar ikke visualisert med MRI på grunn av manglende kontrast. NIRF bildebehandling er ikke-invasiv, i motsetning confocal, multiphoton mikroskopi, og intravital bildebehandling. Vanligvis confocal og multiphoton mikroskopi teknikker utnytte delvis eller helt resected vev. Scintographic metoder nødvendiggjøre bruk av radionuklider og noen ganger mindre fartøy kanylering. En annen metode for å visualisere lymfekar innebærer intravital bildebehandling hvor musen eravlives og dermis er trukket tilbake etter ID injeksjon av Evans blå fargestoff. Men denne metoden ikke gir funksjonell eller langsgående bildebehandling 17,18. LN metastaser kan avbildes ved hjelp av en Siemens Inveon PET / CT, men ikke denne teknikken ikke tillate visualisering av lymfatisk struktur eller funksjon 19.

Mens forfatterne anbefaler ikke heller støtter noen spesifikke kommersielle bildebehandlingsenheten, viser vår erfaring at valg av lyskilde og optiske filtre kan være den viktigste faktoren som bestemmer følsomheten av enheten. Som beskrevet av Zhu et al., For vellykket avbildning av lave konsentrasjoner av fargestoff, må det være minimal overlapping mellom emisjonsspektrum av lyskilden og overføring spekteret av de optiske filtre 20. Annen viktig vurdering er absorpsjon og emisjonsspektrum av NIRF fargestoff brukes. I denne utredningen ICG og cABD-IRDye800 har lignende spectra og så den beskrevne laserdioden bølgelengde og filterkombinasjoner kan brukes for hver, men hvis en annen farge er å bli brukt som ikke absorberer og / eller fluoresce ved disse bølgelengdene, bør bølgelengden til lyskilden og de optiske filtre være justeres tilsvarende. ICG kan være tilstrekkelig for mange bruksområder, og er allerede FDA-godkjent. NIRF-cABD er ikke FDA-godkjent for bruk i mennesker, men kan være nyttig for dyr imaging. ICG har ikke kjemisk lenking rester for å feste målretting molekyldeler, så andre fluorescerende midler, slik som NIRF-cABD, utvikles.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfattere har ingenting å avsløre, men noen forfattere er notert på et patent.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskudd til Eva Sevick: NIH R01 CA128919 og NIH R01 HL092923.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Indocyanine green (ICG) Patheon Italia S.P.A. NDC 25431-424-02 Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL)
Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) Bachem Custom Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL)
IRDye800 Li-COR IRDye 800CW Reconstitute according to manufacture's instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations
Sterile Water Hospira, Inc., Lake Forest, IL NDC 0409-4887-10
NAIR Church Dwight Co., Inc. Local Stores www.nairlikeneverbefore.com
Imaging System (components below) Center for Molecular Imaging N/A Custom-built in our laboratories.
Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera Princeton Instruments, Trenton, NJ Photon Max 512
Nikon camera lens Nikon Inc., Melville, NY Model No. 1992, Nikkor 28mm
Optical filter Andover Corp., Salem,NH ANDV11333 Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens
785-nm laser diode Intense Ltd, North Brunswick, NJ 1005-9MM-78503 500 mW of optical output
Collimating optics Thorlabs, Newton, NJ C240TME-B Collimates laser output prior to cleanup filter
Clean-up filter Semrock, Inc., Rochester, NY LD01-785/10-25 Removes laser emission in fluorescence band
Optical diffuser Thorlabs, Newton, NJ ED1-C20 Diffuses the laser over the animal
V++ Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand Version 5.0 Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/
Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis
ImageJ National Institutes of Health, Bethesda, MD Most current version available Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/
MATLAB MathWorks, Natick, MA Version 2008a or later http://www.mathworks.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alitalo, K. The lymphatic vasculature in disease. Nat. Med. 17, 1371-1380 (2011).
  2. Rasmussen, J. C., Tan, I. C., Marshall, M. V., Fife, C. E., Sevick-Muraca, E. M. Lymphatic imaging in humans with near-infrared fluorescence. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 74-82 (2009).
  3. Rasmussen, J. C., et al. Human Lymphatic Architecture and Dynamic Transport Imaged Using Near-infrared Fluorescence. Transl. Oncol. 3, 362-372 (2010).
  4. Sevick-Muraca, E. M. Translation of near-infrared fluorescence imaging technologies: emerging clinical applications. Annu. Rev. Med. 63, 217-231 (2012).
  5. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat. Res. Biol. 5, 219-231 (2007).
  6. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Mouse phenotyping with near-infrared fluorescence lymphatic imaging. Biomed Opt Express. 2, 1403-1411 (2011).
  7. Marshall, M. V., et al. Near-infrared fluorescence imaging in humans with indocyanine green: a review and update. The Open Surgical Oncology Journal. 2, 12-25 (2010).
  8. Davies-Venn, C. A., et al. Albumin-Binding Domain Conjugate for Near-Infrared Fluorescence Lymphatic Imaging. Mol. Imaging Biol. (2011).
  9. Sharma, R. Quantitative imaging of lymph function. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, 3109-3118 (2007).
  10. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Functional lymphatic imaging in tumor-bearing mice. J. Immunol. Methods. 360, 167-172 (2010).
  11. Karlsen, T. V., McCormack, E., Mujic, M., Tenstad, O., Wiig, H. Minimally invasive quantification of lymph flow in mice and rats by imaging depot clearance of near-infrared albumin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 391-401 (2012).
  12. Zhou, Q., Wood, R., Schwarz, E. M., Wang, Y. J., Xing, L. Near-infrared lymphatic imaging demonstrates the dynamics of lymph flow and lymphangiogenesis during the acute versus chronic phases of arthritis in mice. Arthritis Rheum. 62, 1881-1889 (2010).
  13. Adams, K. E., et al. Direct evidence of lymphatic function improvement after advanced pneumatic compression device treatment of lymphedema. Biomed. Opt. Express. 1, 114-125 (2010).
  14. Tan, I. C., et al. Assessment of lymphatic contractile function after manual lymphatic drainage using near-infrared fluorescence imaging. Arch. Phys. Med. Rehabil. 92, 756-764 (2011).
  15. Lapinski, P. E., et al. RASA1 maintains the lymphatic vasculature in a quiescent functional state in mice. J. Clin. Invest. 122, 733-747 (2012).
  16. Maus, E. A., et al. Near-infrared fluorescence imaging of lymphatics in head and neck lymphedema. Head Neck. 34, 448-453 (2012).
  17. Galanzha, E. I., Tuchin, V. V., Zharov, V. P. Advances in small animal mesentery models for in vivo flow cytometry, dynamic microscopy, and drug screening. World J. Gastroenterol. 13, 192-218 (2007).
  18. Schramm, R., et al. The cervical lymph node preparation: a novel approach to study lymphocyte homing by intravital microscopy. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society. 55, 160-167 (2006).
  19. Hall, M. A., et al. Imaging prostate cancer lymph node metastases with a multimodality contrast agent. Prostate. 72, 129-146 (2012).
  20. Zhu, B., Sevick-Muraca, E. M. Minimizing excitation leakage and maximizing measurement sensitivity for molecular imaging with near-infrared fluorescence. J. Innovat. Opt. Health Sci. 4, 301-307 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats