Niet-invasieve optische beeldvorming van de lymfatische vasculatuur van een muis

Published 3/08/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Recent ontwikkelde beeldvormende technieken met behulp van nabij-infrarood fluorescentie (NIRF) kan helpen verduidelijken van de rol het lymfestelsel speelt in kanker metastase, immuunrespons, wondheling, en andere lymfatische-geassocieerde ziekten.

Cite this Article

Copy Citation

Robinson, H. A., Kwon, S., Hall, M. A., Rasmussen, J. C., Aldrich, M. B., Sevick-Muraca, E. M. Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse. J. Vis. Exp. (73), e4326, doi:10.3791/4326 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Het lymfatische vasculaire systeem is een belangrijk onderdeel van de bloedsomloop dat vloeistof homeostase handhaaft, biedt immune surveillance en bemiddelt vetopname in de darm. Ondanks deze kritische functie, is er betrekkelijk weinig begrip van hoe het lymfatisch systeem past zich aan dienen deze functies in gezondheid en ziekte 1. Onlangs hebben we aangetoond over het vermogen om dynamisch beeld lymfatische architectuur en de lymfe "pompen" actie in normale proefpersonen en bij personen die lijden lymfatische dysfunctie met trace toediening van een nabij-infrarood fluorescerende (NIRF) kleurstof en een aangepaste, Gen III- geïntensiveerd beeldvormingssysteem 2-4. NIRF beeldvorming dramatische veranderingen in lymfatische architectuur en functie toonde met menselijke ziekte. Het blijft onduidelijk hoe deze veranderingen en nieuwe diermodellen zijn ontwikkeld voor de genetische en moleculaire basis te helderen. In dit protocol, presenteren we NIRF lymfatische, small dier imaging 5,6 met indocyanine groen (ICG), een kleurstof die gebruikt 50 jaar bij mensen 7 en een NIRF kleurstof gelabelde cyclische albumine bindend domein (Abd-IRDye800) peptide dat bij voorkeur bindt muis en humaan albumine 8 . Ongeveer 5,5 keer helderder dan ICG, 'Abd-IRDye800 heeft een soortgelijke lymfatische speling profiel en kan worden geïnjecteerd in kleinere doseringen dan ICG om voldoende NIRF signalen te bereiken voor de beeldvorming 8. Omdat beide Abd-IRDye800 en ICG binden aan albumine in de interstitiële ruimte 8, die beide kunnen actief eiwit transport naar en tonen in de lymfevaten. Intradermale (ID) injectie (5-50 ul) van ICG (645 uM) of Abd-IRDye800 (200 uM) in zoutoplossing worden toegediend aan het dorsale aspect van elke achterpoot en / of de linker en rechter zijde van de basis van de staart van een isofluraan-verdoofde muis. De verkregen kleurstof concentratie in het dier 83-1,250 ug / kg voor ICG of 113-1,700 ug / kg voor'Abd-IRDye800. Onmiddellijk na injecties wordt lymfatische functionele beeldvorming uitgevoerd tot 1 uur met een aangepaste, klein dier NIRF beeldvormingssysteem. Hele dier ruimtelijke resolutie kan afbeelden fluorescent lymfevaten van 100 micrometer of minder, en beelden van structuren tot 3 cm in diepte worden verkregen 9. De beelden werden met behulp van V + + software en geanalyseerd met behulp van ImageJ of MATLAB software. Tijdens de analyse worden opeenvolgende gebieden die van belang (ROI) omvat het gehele vaartuig diameter getrokken langs een bepaalde lymfevat. De afmetingen voor elke ROI constant worden gehouden voor een bepaald vaartuig en NIRF intensiteit wordt gemeten voor elke ROI voor een kwantitatieve beoordeling "pakketten" van lymfe bewegen door schepen.

Protocol

Alle dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de normen van de Universiteit van Texas Health Science Center (Houston, TX), Vakgroep Vergelijkende Geneeskunde en Centrum voor Moleculaire Beeldvorming na nazicht en goedkeuring van het protocol door de respectieve institutionele Animal Care en gebruik Comite (IACUC) of Animal Welfare Committee (AWC).

1. Voorbereiding van de dieren 24 Hr Voorafgaand aan Imaging

De stappen moeten worden uitgevoerd (indien nodig) de dag voor lymfatische beeldvorming plaatsvindt.

  1. Plaats dier in een inductie doos en verdoven met isofluraan.
  2. Zodra het dier is in een staat van diepe anesthesie (bewaakt met teen-snuifje manoeuvre), plaats verdoofd dier op een luier / pluis pad en positie neus in een neuskegel verbonden met isofluraan gas.
  3. Clip alle haar / bont (indien aanwezig) in de omgeving af te beelden.
  4. Breng ontharingsmiddel (NAIR) om het uitgeknipte gebied en laat het on de huid tot 3 minuten.
  5. Veeg korting op alle ontharingsmiddel met warme, vochtige gaas of papieren handdoek.
  6. Spoel de huid met warm water en voorzichtig drogen de ruimte met een gaasje of papieren handdoek.
  7. Toestaan ​​dat dieren om te herstellen op een verwarmingselement of onder een warmtelamp, en hun kooi terug te keren.

2. Dag van de Imaging

  1. Reconstitueren imaging agent met steriel water, vervolgens verdund met steriele normale (0,85%) zoutoplossing tot 645 uM (5 ug/10 pi) bereiken voor ICG of 200 uM (6.8 ug/10 pi) voor Abd-IRDye800. Een oplossing in donker voorwaarden en het gebruik binnen 6 uur na reconstitutie.
  2. Plaats dier in een inductie doos en verdoven met isofluraan.
  3. Zodra het dier in een toestand van diepe anesthesie (gecontroleerd toe-pinch figuur), place verdoofde dier op zijn kant op een luier / pluizen pad en positie neus in een neuskegel verbonden gas isofluraan.
  4. Doe de lichten uit (dus de ruimte isdonker). Indien nodig, kan een klein bureau halogeenlicht worden gebruikt voor een kleine hoeveelheid licht om injecties te zien.
  5. Met een insulinespuit met een 31-gauge naald geïnjecteerd ID 5 pi tot 50 pi ICG of Abd-IRDye800 in het dorsale aspect van elke achterpoot en / of links en rechts van de basis van de staart, afhankelijk het gebied van belang (zie Discussie). Elke geïnjecteerde dosis kan variëren 0.083-+1.25 mg / kg (ICG) of ,113-+1.7 mg / kg (Abd-IRDye800). Injectie volumes zal variëren met dierlijke stam en de plaats van injectie. Voor athymische muizen, kan het volume van injectie 5 ui (achterpoot) of 10 ul (staartaanzet). Wanneer het dier zich niet in het beeldvormingssysteem injectieplaats (s) onmiddellijk het dier onder het beeldvormingssysteem na injectie (s).
  6. Als er geen kleurstof opname wordt gezien in de lymfevaten wordt in stap 2.5 moeten worden herhaald worden per dier protocol.
  7. Zodra lymfevaten worden gezien, de injectieplaats bedekken met zwarte isolatietape of zwart paper.
  8. Verwerven lymfatische beelden tot 1 uur met V + + software en een klein dier, NIRF beeldvormingssysteem. (Dieren worden verdoofd met isofluraan en ademhaling worden bewaakt terwijl de beelden zijn het verwerven van.) Terwijl klein dier, NIRF imagers zijn commercieel verkrijgbaar, maken we gebruik van een op maat gemaakte, klein dier NIRF imaging systeem dat bestaat uit een 785-nm laser diode (1005-9mm-78503 , Intense, North Brunswick, NJ) uitgerust met een asferische lens (C24TME-B, Thorlabs, Newton, NJ), diffuser (ED1-C20, Thorlabs) en filter (LD01-785/10-25, Semrock, Rochester, NY ) een uniforme excitatie veld dat het dier verlicht op een incident fluentie van minder dan 1,4 mW per vierkante centimeter 10 maken. Een elektron vermenigvuldigen charged-coupled device (EMCCD, PhotonMax512, Princeton Instruments, Trenton, NJ) camera systeem met twee 830-nm filters (AND11333, Andover Corp, Salem, NH) en een 28-mm Nikkor-objectief (1992, Nikon, Melville, NY) wordt gebruikt om lymfatische opnamen met integratie times van 200 msec voor dynamische beeldvorming en 800 msec voor statische imaging 5. Zie figuur 1 voor de systeemconfiguratie, de tabel voor meer informatie over elk onderdeel, en de discussie voor een korte bespreking van de belangrijkste imager eigenschappen.
  9. Toestaan ​​dat dieren om te herstellen op een verwarmingselement of onder een warmtelamp en hun kooi terug te keren, of euthanaseren.
  10. Analyseer beelden met behulp van ImageJ of MATLAB software. Zie afbeelding 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voorbeeld van NIRF Lymfatische Imaging in Muizen

Wanneer ICG of Abd-IRDye800 wordt ID geïnjecteerd aan de basis van de staart van een normale muis, moet de lymfatische vasculatuur tussen de injectieplaats aan de basis van de staart en de inguinale lymfeklier (LN) onmiddellijk zichtbaar. Kort na injectie (enkele seconden tot minuten) moet het lymfevat tussen de lies en de axillaire LN LN worden gevisualiseerd zoals weergegeven in figuur 2. Aangezien de lymfevaten in muizen variëren van dier tot dier als in mensen, kan variatie in de architectuur van dieren worden beschouwd als getoond in figuur 3. Wanneer ICG of NIRF-Abd ID wordt geïnjecteerd op het dorsale aspect van de achterpoot van een normale muis kunnen twee lymfevaten gevisualiseerd aftappen aan de knieholte LN zoals getoond in figuur 4. In sommige gevallen is het moeilijk om beide vaten vanwege hun nabijheid onderscheiden met elkaar.

Soms wordt de visualisatie van lymfevaten vertraagd, meestal door de injectie wordt subcutaan (SC) in plaats van ID. Wanneer SC injecties worden gegeven, kan lymfatische transport niet direct zichtbaar zoals in figuur 5 (a) door de extra tijd die de kleurstof te bereiken en die worden door de lymfatische haarvaten in de huid. Daarom is het belangrijk te injecteren ID in plaats van SC. Soms, abnormale lymfevaten waargenomen, zoals in figuur 5 (b), in het gebied van een wond zoals een hapje of delen van het haar / vacht scheren. Het dier lichaamstemperatuur dient te worden gehandhaafd binnen het normale bereik, zoals het veranderen van de lichaamstemperatuur kan leiden tot inconsistente lymfatische functie. Beperkingen van de techniek zijn verduistering van fluorescerende lymfevaten door pigmentatie van de huid, het onvermogen om het imago van de diepe borstkas lymfvaten als gevolg vanom lichtverstrooiing in het weefsel en het onbekende effect van verdoving op lymfatische functie.

Over het algemeen duurt het de ID depot van ICG of 'Abd-IRDye800 tot 2 dagen te wissen de lever en de blaas, en tot 3 dagen de tijd om duidelijk de plaats van de injectie. Wanneer resterende fluorescerende signaal is verdwenen, kan de beeldvorming protocol worden herhaald, waardoor longitudinale lymfatische beeldvorming van veranderingen in de architectuur of lymfe functie te evalueren na enige interventie.

Analyse van Lymfatische Functie

De verkregen beelden kunnen worden geladen in ImageJ of MATLAB voor gegevensanalyse. Constante gebied zijn cirkelvormige ROI geselecteerd of "getekend" over de gehele lengte van het fluorescerende lymfevat zoals voor mens 10 en dier 5 lymfatische imaging zoals getoond in figuren 6 (a) en figuur 6 (d). De ROI zodanig gekozen dat de diameter ongeveer de diameter van het beeld van de fluorescerennt vaartuig. De gemiddelde fluorescentie-intensiteit in elk ROI wordt uitgezet als functie van de tijd imaging de voortstuwende snelheid en de frequentie van "pakketten" van kleurstof beladen lymfe beoordelen voortbewogen langs de lymfevaten zoals getoond in figuren 6 (b) en Figuur 6 (e ). Het lymfatische voortplantingssnelheid en frequentie van lymfatische voortstuwing beoordelen, worden twee ROI's, met duidelijke maxima of minima fluorescentie-intensiteit variaties die de voortplanting van pakketten van lymfe, geselecteerd en hun fluorescerende intensiteitsprofielen uitgezet zoals getoond in figuren 6 (c) en 6 (f). De voortplantingssnelheid wordt berekend door de verhouding van de afstand tussen de twee ROI en de reistijd voor een pakket van lymfe doorgeven tussen hen. Door bepaling van het aantal pulsen fluorescerende of "pakketten" komen tot een ROI per tijd wordt de contractiele frequentie berekend. Hoewel deze techniek is de enige methode assess voortstuwing frequentie en snelheid van een aangedreven lymfatische "pakket," anderen hebben indirect geëvalueerd lymfatische vervoer door het meten van het depot klaring van een imaging agent en dus het berekenen van het verwijderen snelheidsconstanten 11. In uitzaaiingen 10 en vroege infectie, er verlies van lymfatische aandrijving in dieren. Anderen rapporteren veranderingen in contractiliteit in reactie op artritis 12. Bij de mens, rapporteren wij verhoogde voortstuwing na lymfoedeem behandelingen, waaronder pneumatische compressie drainage 13 en manuele lymfedrainage (massage) 14.

Figuur 1
Figuur 1. Het NIRF imaging systeem is maatwerk voor kleine dieren lymfatische beeldvorming. De inrichting bestaat uit een 785-nm laser diode voorzien van een asferische lens, diffuseh, en filters om een uniforme excitatie veld dat het dier en een EMCCD camera verlicht te creëren, met de nadruk lens en optische filters om beelden van fluorescerende lymfe 10 vast te leggen.

Figuur 2
Figuur 2. Bij 10 pl ICG of Abd-IRDye800 geïnjecteerd ID aan de basis van de staart van een normale muis met een 31-gauge naald, de lymfatische vasculatuur tussen de injectieplaats aan de basis van de staart en de inguinale lymfklieren LN moet onmiddellijk gevisualiseerd. Dynamic fluorescentie beelden werden onmiddellijk na injectie en tot 20 min na injectie. Kort na injectie (enkele seconden tot minuten), lymfevaten tussen de injectieplaats en de lies LN en vervolgens de axillaire regio LN worden gevisualiseerd op de laterale. Het beeld in figuur 2 werd 5 min. na injectie with 10 pl ICG ID aan de basis van de staart. Het lichtpunt tussen de lies en okselstreek is de lever.

Figuur 3
Figuur 3. Aangezien de lymfevaten in muizen variëren van dier tot dier als in mensen, kan variatie in de architectuur van dieren zichtbaar en is stabiel. Muis # 124 werd geïnjecteerd met ICG aan de basis van de staart en onmiddellijk afgebeeld op dag 1. Het bovenste paneel toont de afbeelding verkregen op dag 1 en een image 2 dagen later verkregen (op dag 3) met dezelfde muis en injectie / imaging protocol. Het onderpaneel bevat foto bij een andere muis (# 127) geïnjecteerd met ICG onmiddellijk afgebeeld dag 1 en vervolgens afgebeeld op dag 3. Terwijl de lymfatische architectuur (het patroon van lymfevaten) varieert tussen moGebruik # 124 en # 127, de beelden verkregen met NIRF stroken voor elke muis op dag 1 en 3.

Figuur 4
Figuur 4. Als 5-10 ul ICG of NIRF-Abd ID wordt geïnjecteerd op het dorsale aspect van de achterpoot van een normale muis, moeten twee lymfevaten gevisualiseerd afvoeren van de knieholte LN. Dynamic fluorescentie beelden werden onmiddellijk na injectie en tot 20 min na injectie. In sommige gevallen is het moeilijk om beide vaten vanwege hun nabijheid onderscheiden zoals weergegeven in het vergrote beeld weergegeven door de gestippelde rechthoek. Voor de representatieve muis hier werd 10 pi ICG geïnjecteerd in de dorsale aspect van links achterpoot (eerste injectie) en in de linkerkant van de staartbasis (tweede injectie). Dit beeld was captured ongeveer 2 - 3 minuten na de eerste injectie en ongeveer 30 sec - 1 min na de tweede injectie.

Figuur 5
Figuur 5. (A) Af en toe visualisatie van de lymfevaten wordt vertraagd of belemmerd, meestal als gevolg van de injectie wordt toegediend SC in plaats van ID. Bij 10 ul van ICG en Abd-IRDye800 geïnjecteerd SC aan de basis van de staart van een normale muis met een 31-gauge naald wordt lymfatisch transport niet direct worden gevisualiseerd door de extra tijd die de kleurstof te bereiken en worden door de lymfatische haarvaten in de huid. Ook vanwege het relatief diepe subcutane injectie, kan er geen opname lymfatische en dus geen visualisatie van vaartuigen en lymfeklieren. In Figuur 5 (a), Werd een muis geïnjecteerd met 10 ul van ICG aan de basis van de staart SC en beelden werden verkregen 5 min na injectie. De kleurstof op de injectieplaats kunnen worden gevisualiseerd en geen lymfevaten of lymfeklieren kunnen worden gevisualiseerd. Dit is de reden ID injecties belangrijk. (B) Visualisatie van ventrale zijde dier afwijkende lymfevaten gevolg van een wond aangetroffen tijdens een dag eerder fur verwijdering met clippers (weefselbeschadiging ter vermeld aan de rechterkant dier). Van de opname ongeveer 5 min na 10 pl ICG werd toegediend ID aan de basis van de staart op elk links en rechts. Op de niet-verwonde (dier links), de lies LN worden gevisualiseerd en de relatief rechte efferente lymfevat aftappen omhoog naar de oksel LNS. Rechts van de muis kant werd echter normale lymfe vasculatuur onderbroken door verwonding en lijkt afwijkende door weefselherstel (korstje).


Figuur 6. Kwantitatieve analyse van lymfatische contractiele functie bestaat uit het selecteren ROI langs de lymfevaten drainage van (a) de lies LN de axillaire LN en (d) de injectieplaats op het dorsale aspect van de poot naar de knieholte LN. Een vergrote beeld (inzet in (a)) van de rode streepjesrechthoek illustreert de selectie van ROI langs de fluorescerende vaartuig. Een compilatie van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit als functie van de tijd voor ROI uit (a) en (d) wordt voorgesteld door de pseudo-color plot weergegeven in (b) en (e), respectievelijk. De verstoringen in fluorescentie-intensiteit over pixels vertegenwoordigen een lymfatische "puls" verspreiden via de ROI's en are parallel aan de pijlen. De gemiddelde fluorescentie-intensiteit voor enkele ROI 22 en 45 uit (b) wordt in (c) en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit voor enkele ROI 18 en 34 uit (e) wordt in (f). Fluorescentie-intensiteit profielen als functie van de tijd (zoals in (c) en (f)) makkelijker maken om de pakketten van teeltmateriaal lymfe en de extractie van de reistijd en afstand tussen twee ROI. De twee ROI geselecteerd deels gebaseerd op hun plaats langs de lymfevat en de duidelijkheid van de maxima en minima vertegenwoordigen lymfe vermeerdering getoond. Velocity wordt berekend als de verhouding van de afstand tussen twee ROI's en de doorvoer tijd die wordt genomen tussen piek fluorescentie-intensiteit. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken


Figuur 7. Om de lymfevaten drainage van de liesstreek van de axillaire regio te visualiseren, injecteer de linker-of rechterkant van de basis van de staart. In het algemeen aan de linkerkant visualiseren, injecteert locatie 5, 6, 9 of 10, en aan de rechterkant visualiseren, injecteren in plaats 7, 8, 11 of 12. Bestemmingen 1 tot 4 kan te lager de staart voor optimale opname om lymfedrainage visualiseren van de liesstreek van de axillaire regio.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We maken gebruik van een aangepaste, kleine dieren NIRF imaging systeem om beelden van het label lymfevaten in muizen te vangen. Om films van lymfe beweging te construeren, zijn 300 of meer beelden verzameld. Voor functionele analyse van lymfevaten uit films, worden twee of meer ROI's handmatig worden getekend langs een lymfevat. De afmetingen van het ROI worden constant gehouden voor elk vaartuig en ongeveer de diameter van het vat. Terwijl hele dier ruimtelijke resolutie kan afbeelden fluorescent lymfevaten van 100 micron of minder, een macrolens voor fijnere resolutie worden toegepast 10. Wit licht beelden voor anatomische referentie kan ook worden verkregen met behulp van een low-power lamp. Er moet worden opgemerkt dat als beeldvormende agentia bestaan ​​uit andere fluorescente kleurstoffen met verschillende excitatie / emissie spectra fluorescentie dan de hierboven beschreven filters moeten worden aangepast om beeldvorming te behouden, en agent dosering aangepast moet ook. Ook als de excitatie golflengte less dan 750 nm, dan autofluorescentie kan worden gevormd, achtergrond signaal zal toenemen, en imaging gevoeligheid zal afnemen. Bovendien kan instabiliteit van agenten in oplossing sluit het gebruik van een NIRF kleurstoffen zoals Cyanine 7 (Cy7).

Selectie van geschikte injectieplaats zal afhangen van de lymfevaten worden bestudeerd. De lymfevaten drainage van de liesstreek van de okselgebied brengen zal u de linker-of rechterkant van de basis van de staart injecteren, zoals getoond in figuur 7. Om de lymfevaten drainage van de vorstelijke regio te visualiseren, moet u het dorsale aspect van de achterpoot te injecteren. Het is essentieel om het dier lichaamstemperatuur binnen het normale bereik, het wijzigen lichaamstemperatuur kan inconsequente lymfatische functie. Bovendien, vanwege het beperkte dynamische bereik van de meeste CCD moet de injectieplaatsen worden bedekt met zwart papier van fluorescerende thereb blokkereny waardoor visualisatie van dimmer aftappen lymfevaten. Imaging worden uitgevoerd in een donkere kamer om ongewenste achtergrondsignalen door lichtemissie in de fluorescentie van de band kamerlichten verminderen. Het dier moet worden dat op een zwarte achtergrond terwijl imaging wordt uitgevoerd om het licht backscatter verminderen.

NIRF lymfatische beeldvorming kan zorgen voor een beter begrip van lymfeziekten en hoe lymfatische architectuur en functie veranderingen met betrekking tot de ziekte of verwonding. Zo heeft het onderzoeksteam gebruikte NIRF beeldvorming in kleine dieren lymfatische fenotypering van dieren 6,15 te geven en veranderingen in de lymfatische functie en architectuur met kanker uitzaaiingen 10 sporen. Bij de mens is de techniek is gebruikt om de eerste tekenen van lymfoedeem 2 sporen, reactie op de oedeemtherapie 13,14,16, en fenotype familieleden met erfelijke lymfestelselaandoeningen beoordelen. Echter, niet-invasieve visualization diepe lymfevaten (> 3 cm) bij mensen is beperkt door de verstrooiing van licht in weefsel. Beelden van lymfatische structuren tot 3 cm in de diepte werden verworven bij varkens 9 en menselijke beeldvorming. In de mens zijn MRI en dynamische lymfoscintigrafie gebruikt om de looptijd van contrastmiddel uit de injectieplaats naar de lymfeklieren in ziekte kwantificeren. Echter, ze niet over voldoende temporele en ruimtelijke resolutie van de lymfatische voortstuwing gebeurtenissen gemakkelijk afgebeeld met NIRF visualiseren. Bovendien gezonde lymfevaten niet gevisualiseerd met MRI door gebrek aan contrast. NIRF imaging is niet-invasief, anders confocale, multifoton microscopie en intravitale imaging. Typisch confocale en multi microscopische technieken gebruik geheel of gedeeltelijk gereseceerd weefsel. Scintographic methoden vereisen het gebruik van radionucliden en soms kleine schip cannulatie. Een andere methode om de lymfevaten visualiseren omvat intravitale beeldvorming waarin de muisgedood en de dermis wordt teruggetrokken na ID injectie van Evans blauwe kleurstof. Echter, deze methode geen functionele of longitudinale beeldvorming 17,18. LN metastasen kunnen worden afgebeeld met een Siemens Inveon PET / CT, maar deze techniek niet mogelijk visualisatie van lymfatische structuur of functie 19.

Hoewel de auteurs niet aan te raden, noch onderschrijft geen specifieke commerciële imaging-apparaat, onze ervaring wijst erop dat de keuze van de lichtbron en optische filters kunnen de belangrijkste factor die de gevoeligheid van het apparaat bepaalt. Zoals beschreven door Zhu et al.. Voor succesvolle beeldvorming van lage concentraties kleurstof moet er minimale overlap tussen het emissiespectrum van lichtbron en het transmissiespectrum van de optische filters 20. Een andere belangrijke overweging is de absorptie en emissiespectrum van de gebruikte kleurstof NIRF. In dit artikel ICG en 'Abd-IRDye800 hebben soortgelijke spectra en dus de beschreven laserdiode golflengte en filtercombinatie kan worden gebruikt voor elke, maar als een kleurstof wordt gebruikt die niet absorberen en / of fluoresceren bij deze golflengten, de golflengte van de lichtbron en de optische filters moet dienovereenkomstig aangepast. ICG kan voldoende zijn voor vele toepassingen en is al FDA goedgekeurde. NIRF-Abd niet FDA goedgekeurd voor gebruik bij mensen, maar kan bruikbaar zijn voor dierlijke imaging. ICG geen chemische vernetting residuen voor bevestiging richtende delen hebben, zodat andere fluorescerende middelen, zoals NIRF-Abd, ontwikkeld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Auteurs hebben niets openbaar te maken, maar sommige auteurs worden vermeld op een octrooi.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies aan Eva Sevick: NIH R01 CA128919 en NIH R01 HL092923.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Indocyanine green (ICG) Patheon Italia S.P.A. NDC 25431-424-02 Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL)
Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) Bachem Custom Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL)
IRDye800 Li-COR IRDye 800CW Reconstitute according to manufacture's instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations
Sterile Water Hospira, Inc., Lake Forest, IL NDC 0409-4887-10
NAIR Church Dwight Co., Inc. Local Stores www.nairlikeneverbefore.com
Imaging System (components below) Center for Molecular Imaging N/A Custom-built in our laboratories.
Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera Princeton Instruments, Trenton, NJ Photon Max 512
Nikon camera lens Nikon Inc., Melville, NY Model No. 1992, Nikkor 28mm
Optical filter Andover Corp., Salem,NH ANDV11333 Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens
785-nm laser diode Intense Ltd, North Brunswick, NJ 1005-9MM-78503 500 mW of optical output
Collimating optics Thorlabs, Newton, NJ C240TME-B Collimates laser output prior to cleanup filter
Clean-up filter Semrock, Inc., Rochester, NY LD01-785/10-25 Removes laser emission in fluorescence band
Optical diffuser Thorlabs, Newton, NJ ED1-C20 Diffuses the laser over the animal
V++ Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand Version 5.0 Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/
Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis
ImageJ National Institutes of Health, Bethesda, MD Most current version available Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/
MATLAB MathWorks, Natick, MA Version 2008a or later http://www.mathworks.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alitalo, K. The lymphatic vasculature in disease. Nat. Med. 17, 1371-1380 (2011).
  2. Rasmussen, J. C., Tan, I. C., Marshall, M. V., Fife, C. E., Sevick-Muraca, E. M. Lymphatic imaging in humans with near-infrared fluorescence. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 74-82 (2009).
  3. Rasmussen, J. C., et al. Human Lymphatic Architecture and Dynamic Transport Imaged Using Near-infrared Fluorescence. Transl. Oncol. 3, 362-372 (2010).
  4. Sevick-Muraca, E. M. Translation of near-infrared fluorescence imaging technologies: emerging clinical applications. Annu. Rev. Med. 63, 217-231 (2012).
  5. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat. Res. Biol. 5, 219-231 (2007).
  6. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Mouse phenotyping with near-infrared fluorescence lymphatic imaging. Biomed Opt Express. 2, 1403-1411 (2011).
  7. Marshall, M. V., et al. Near-infrared fluorescence imaging in humans with indocyanine green: a review and update. The Open Surgical Oncology Journal. 2, 12-25 (2010).
  8. Davies-Venn, C. A., et al. Albumin-Binding Domain Conjugate for Near-Infrared Fluorescence Lymphatic Imaging. Mol. Imaging Biol. (2011).
  9. Sharma, R. Quantitative imaging of lymph function. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, 3109-3118 (2007).
  10. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Functional lymphatic imaging in tumor-bearing mice. J. Immunol. Methods. 360, 167-172 (2010).
  11. Karlsen, T. V., McCormack, E., Mujic, M., Tenstad, O., Wiig, H. Minimally invasive quantification of lymph flow in mice and rats by imaging depot clearance of near-infrared albumin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 391-401 (2012).
  12. Zhou, Q., Wood, R., Schwarz, E. M., Wang, Y. J., Xing, L. Near-infrared lymphatic imaging demonstrates the dynamics of lymph flow and lymphangiogenesis during the acute versus chronic phases of arthritis in mice. Arthritis Rheum. 62, 1881-1889 (2010).
  13. Adams, K. E., et al. Direct evidence of lymphatic function improvement after advanced pneumatic compression device treatment of lymphedema. Biomed. Opt. Express. 1, 114-125 (2010).
  14. Tan, I. C., et al. Assessment of lymphatic contractile function after manual lymphatic drainage using near-infrared fluorescence imaging. Arch. Phys. Med. Rehabil. 92, 756-764 (2011).
  15. Lapinski, P. E., et al. RASA1 maintains the lymphatic vasculature in a quiescent functional state in mice. J. Clin. Invest. 122, 733-747 (2012).
  16. Maus, E. A., et al. Near-infrared fluorescence imaging of lymphatics in head and neck lymphedema. Head Neck. 34, 448-453 (2012).
  17. Galanzha, E. I., Tuchin, V. V., Zharov, V. P. Advances in small animal mesentery models for in vivo flow cytometry, dynamic microscopy, and drug screening. World J. Gastroenterol. 13, 192-218 (2007).
  18. Schramm, R., et al. The cervical lymph node preparation: a novel approach to study lymphocyte homing by intravital microscopy. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society. 55, 160-167 (2006).
  19. Hall, M. A., et al. Imaging prostate cancer lymph node metastases with a multimodality contrast agent. Prostate. 72, 129-146 (2012).
  20. Zhu, B., Sevick-Muraca, E. M. Minimizing excitation leakage and maximizing measurement sensitivity for molecular imaging with near-infrared fluorescence. J. Innovat. Opt. Health Sci. 4, 301-307 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats