Non invasiva di imaging ottico del sistema vascolare linfatico di un mouse

Published 3/08/2013
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Immunology and Infection

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Summary

Tecniche di imaging di recente sviluppate utilizzando fluorescenza nel vicino infrarosso (NIRF) può aiutare a chiarire il ruolo del sistema linfatico gioca in metastasi del cancro, la risposta immunitaria, la riparazione delle ferite, e altre malattie associate linfatico.

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Robinson, H. A., Kwon, S., Hall, M. A., Rasmussen, J. C., Aldrich, M. B., Sevick-Muraca, E. M. Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse. J. Vis. Exp. (73), e4326, doi:10.3791/4326 (2013).

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Abstract

Il sistema vascolare linfatico è un componente importante del sistema circolatorio che mantiene l'omeostasi fluido, fornisce la sorveglianza immunitaria, e media l'assorbimento di grassi nell'intestino. Eppure, nonostante la sua funzione critica, non vi è la comprensione relativamente poco di come il sistema linfatico si adatta a servire queste funzioni in materia di salute e malattia 1. Recentemente, abbiamo dimostrato la capacità di architettura dinamica linfatica immagine e linfa azione "pompaggio" in soggetti umani normali e anche a persone che soffrono di disfunzione linfatica mediante somministrazione traccia di un vicino infrarosso fluorescente (NIRF) colorante e un costume, Gen III- intensificata sistema di imaging 2-4. NIRF di imaging hanno mostrato cambiamenti drammatici in architettura linfatica e la funzione con la malattia umana. Non è ancora chiaro come questi cambiamenti si verificano e di nuovi modelli animali che sono in fase di sviluppo per chiarire la loro base genetica e molecolare. In questo protocollo, presentiamo linfatico NIRF, small animale Imaging 5,6 utilizzando verde indocianina (ICG), un colorante che è stato usato per 50 anni nell'uomo 7, e un colorante marcato NIRF ciclico dominio di legame (CabD-IRDye800) peptide che si lega preferenzialmente topo e albumina umana 8 . Circa 5,5 volte più luminoso di ICG, 'Abd-IRDye800 ha un profilo simile gioco linfatico e può essere iniettato in piccole dosi di ICG per ottenere segnali NIRF sufficienti per l'imaging 8. Poiché sia bind 'Abd-IRDye800 e ICG all'albumina nello spazio interstiziale 8, entrambi possono descrivere trasporto attivo le proteine ​​in e nei vasi linfatici. Intradermica (ID) iniezioni (microlitri 5-50) di ICG (645 uM) o CabD-IRDye800 (200 pM) in soluzione salina sono somministrati al dorso di ciascuna zampa posteriore e / o il lato sinistro e destro della base del coda di un topo anestetizzato-isoflurano. La concentrazione di colorante conseguente animale è 83-1,250 mcg / kg per ICG o 113-1,700 mg / kg per'Abd-IRDye800. Subito dopo le iniezioni, l'imaging funzionale linfatico è condotto per un massimo di 1 ora con un personalizzato, piccolo sistema animale NIRF imaging. Risoluzione animale intero territorio può rappresentare vasi linfatici fluorescenti di 100 micron o meno, e le immagini di strutture fino a 3 cm di profondità possono essere acquisite 9. Le immagini sono acquisite in V + software + e analizzati utilizzando il software ImageJ o MATLAB. Durante l'analisi, consecutivi regioni di interesse (ROI) comprende l'intero diametro nave sono disegnati lungo un vaso linfatico dato. Le dimensioni di ogni ROI sono mantenute costanti per un determinato peschereccio e intensità NIRF è misurato per ciascuna ROI per valutare quantitativamente "pacchetti" di linfa si muove attraverso le navi.

Protocol

Tutti gli studi sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le norme della University of Texas Health Science Center (Houston, TX), Dipartimento di Medicina comparativa, e Centro di Imaging Molecolare dopo l'esame e l'approvazione del protocollo da parte loro rispettivi Cura degli animali e uso Comitato Istituzionale (IACUC) o il benessere degli animali Committee (AWC).

1. Preparazione del 24 Hr Animali Prima di Imaging

La procedura che segue deve essere fatto (se necessario) il giorno prima di imaging linfatico avviene.

  1. Inserire animale in una scatola di induzione e sedare con isoflurano.
  2. Una volta che l'animale è in uno stato di anestesia profonda (monitorato con toe-pinch manovra), animale sedato posto su un pannolino / fluff pad naso e la posizione in un cono collegato gas isoflurano.
  3. Agganciare tutti i capelli / pelliccia (se del caso) intorno alla zona da acquisire.
  4. Applicare un agente depilatoria (NAIR) per l'area ritagliata e lasciare on la pelle fino a 3 min.
  5. Pulire delicatamente fuori tutte agente depilatoria con il caldo, garza umida o un tovagliolo di carta.
  6. Lavare delicatamente la pelle con acqua tiepida e asciugare delicatamente la zona con una garza o un tovagliolo di carta.
  7. Consentire agli animali di recuperare su una piastra elettrica o sotto una lampada di calore, e tornare alla loro gabbia.

2. Giorno di Imaging

  1. Agente di imaging Ricostituire con acqua sterile, quindi diluire con sterile, normale (0,85%) soluzione fisiologica per ottenere 645 pM (5 μg/10 pl) per ICG o 200 mM (6.8 μg/10 pl) per 'Abd-IRDye800. Conservare le soluzioni al buio condizioni e l'uso entro 6 ore dalla ricostituzione.
  2. Inserire animale in una scatola di induzione e sedare con isoflurano.
  3. Una volta che l'animale è in uno stato di anestesia profonda (monitorato con toe-pinch manovra), animale sedato posto su un lato su un pannolino / fluff pad naso e la posizione in un cono collegato gas isoflurano.
  4. Spegni le luci (quindi la camera èscuro). Se necessario, una piccola luce alogena scrivania può essere utilizzato per una piccola quantità di luce per vedere iniezioni.
  5. Utilizzando una siringa da insulina con un ago di calibro 31, iniettare ID 5 pl a 50 pl di ICG o CabD-IRDye800 nel dorso di ciascuna zampa posteriore e / o sul lato sinistro e destro della base della coda, a seconda l'area di interesse (vedi Discussione). Ogni dose iniettata può variare 0,083-1,25 mg / kg (ICG) o 0,113-1,7 mg / kg (CabD-IRDye800). Volumi di iniezione varia con il ceppo animale e sito di iniezione. Per topi atimici, il volume di iniezione può essere 5 microlitri (zampa posteriore) o 10 microlitri (base della coda). Se animale non è sotto il sistema di imaging per l'iniezione (s), collocare l'animale sotto il sistema di imaging immediatamente dopo l' iniezione (s).
  6. Se non si vede l'assorbimento colorante nei vasi linfatici, passo 2,5 dovrà essere ripetuta, se necessario per protocollo animale.
  7. Una volta che si vedono vasi linfatici, coprire il sito di iniezione con nastro isolante nero o nero paper.
  8. Acquisire le immagini linfatiche per un massimo di 1 ora con V + software + e un piccolo animale, NIRF sistema di imaging. (Gli animali vengono sedati con isoflurano e respirazione sono monitorati mentre le immagini stanno acquisendo.) Mentre per piccoli animali, imager NIRF sono disponibili in commercio, ci avvaliamo di un personalizzato, piccolo sistema animale NIRF immagini costituito da un 785-nm diodo laser (1005-78503-9mm , intenso, North Brunswick, NJ) dotato di una lente asferica (C24TME-B, Thorlabs, Newton, NJ), diffusore (ED1-C20, Thorlabs), e filtro (LD01-785/10-25, Semrock, Rochester, NY ) per creare un campo uniforme di eccitazione che illumina l'animale a un tasso incidente fluenza inferiore a 1,4 mW per centimetro quadrato 10. Un elettrone moltiplicando charged-coupled dispositivo (EMCCD, PhotonMax512, Princeton Instruments, Trenton, NJ) sistema di telecamere con due 830-nm (filtri AND11333, Andover Corp., Salem, NH) e da 28 mm, obiettivo Nikkor (1992, Nikon, Melville, NY) viene utilizzato per catturare le immagini linfatici con integrazione times di 200 msec per immagini dinamiche e 800 msec per l'imaging statico 5. Vedere la Figura 1 per la configurazione del sistema, la tabella per ulteriori dettagli di ogni componente, e la discussione per una breve discussione delle proprietà imager chiave.
  9. Consentire agli animali di recuperare su una piastra elettrica o sotto una lampada di calore e ritornano nella loro gabbia, o eutanasia.
  10. Analizzare le immagini utilizzando ImageJ o software MATLAB. Vedere la Figura 6.

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Representative Results

Esempio di Imaging linfatico NIRF in Mouse

Quando ICG o CabD IRDye800-ID viene iniettato alla base della coda di un topo normale, la vascolarizzazione linfatica tra il sito di iniezione alla base della coda e il linfonodo inguinale (LN) dovrebbe essere immediatamente visualizzata. Poco dopo l'iniezione (pochi secondi o minuti), il vaso linfatico tra la LN inguinale e ascellare LN deve essere visualizzato come visibile in figura 2. Poiché i linfatici nei topi variano da un animale all'altro come fanno negli esseri umani, variazione architettura tra gli animali possono essere visti come mostrato in Figura 3. Quando ICG o NIRF-CabD viene iniettato ID sulla parte dorsale della zampa posteriore di un topo normale, due vasi linfatici possono essere visualizzati drenante alla LN poplitea come mostrato in Figura 4. In alcuni casi, è difficile distinguere due navi a causa della loro vicinanza con l'altro.

A volte, visualizzazione dei linfatici è ritardata, più comunemente causa dell'iniezione essere somministrato per via sottocutanea (SC) invece di ID. Quando iniezioni SC sono date, trasporto linfatico non può essere immediatamente visualizzata come visto in Figura 5 (a) a causa del tempo aggiuntivo necessario per la tintura di raggiungere ed essere ripreso dalla capillari linfatici nella pelle. Questo motivo è importante iniettare ID anziché SC. Occasionalmente, vasi linfatici anomali si osservano, come illustrato nella Figura 5 (b), nella zona di una ferita, come un morso o tagliato dalla tosatrici / fur. Temperatura corporea dell'animale deve essere mantenuta entro valori normali, come cambiando la temperatura corporea può provocare funzione linfatica incoerente. Limiti della tecnica includono oscuramento dei vasi linfatici fluorescenti da pigmentazione della pelle, l'incapacità di immagine dotti linfatici profondi del torace a causaalla luce dispersione nel tessuto, e l'effetto sconosciuto dell'anestesia sulla funzione linfatica.

In generale, ci vuole il deposito ID di ICG o 'Abd-IRDye800 fino a 2 giorni per cancellare il fegato e della vescica, e fino a 3 giorni per cancellare il sito di iniezione. Quando residuo segnale fluorescente ha autorizzato, il protocollo di imaging può essere ripetuta, permettendo di imaging linfatico longitudinale per valutare le variazioni in architettura o funzione linfa dopo qualche intervento.

Analisi della funzione linfatico

Le immagini acquisite possono essere caricati in ImageJ o MATLAB per l'analisi dei dati. Costante-area, ROI circolare vengono selezionate o "disegnato" lungo l'intera lunghezza del vaso linfatico fluorescente come fatto per 10 umana e animale 5 immagini linfatico, come mostrato nelle figure 6 (a) e Figura 6 (d). Le ROI sono selezionati in modo tale che il loro diametro è approssimativamente il diametro dell'immagine della fluorescenzant nave. L'intensità di fluorescenza media all'interno di ogni ROI viene tracciata in funzione del tempo di imaging per valutare la velocità propulsiva e la frequenza dei "pacchetti" di colorante carico di linfa spinto lungo i vasi linfatici, come mostrato nelle figure 6 (b) e Figura 6 (e ). Per valutare la velocità di propagazione linfatica e la frequenza di propulsione linfatica, due ROI, con chiaramente definiti massimi o variazioni di intensità Minimi fluorescenti rappresentano la propagazione di pacchetti di linfa, vengono selezionati e loro profili di intensità fluorescenti sono tracciate come mostrato nelle figure 6 (c) e 6 (f). La velocità di propagazione è calcolato prendendo il rapporto della distanza tra i due ROI e il tempo di transito di un pacchetto di linfa per propagarsi tra loro. Valutando il numero di impulsi fluorescenti o "pacchetti" arrivano in un unico ROI per tempo, la frequenza viene calcolata contrattile. Mentre questa tecnica fornisce l'unico metodo per Assefrequenza di propulsione ss e la velocità di una propulsione linfatica "pacchetto", altri hanno valutato indirettamente trasporto linfatico misurando la liquidazione deposito di un agente di imaging e quindi calcolare le costanti di velocità di rimozione 11. In metastasi del cancro 10 e infezione precoce, troviamo la perdita di propulsione linfatico negli animali. Altri hanno riportato cambiamenti nella contrattilità in risposta ad artrite 12. Negli esseri umani, si segnala un aumento di propulsione linfedema dopo trattamenti tra cui la compressione pneumatica di scarico 13 e il drenaggio linfatico manuale (massaggio) 14.

Figura 1
Figura 1. NIRF Il sistema di imaging è costruito su misura per l'imaging piccolo animale linfatico. Il dispositivo è costituito da un 785-nm diodo laser provvisto di una lente asferica, diffuser, e filtri per creare un campo uniforme di eccitazione che illumina l'animale e una fotocamera EMCCD, lenti di messa a fuoco, e filtri ottici per catturare immagini di linfa fluorescente 10.

Figura 2
Figura 2. Quando 10 pl di ICG o CabD IRDye800-ID viene iniettato alla base della coda di un topo normale usando un ago di calibro 31, la vascolarizzazione linfatica tra il sito di iniezione alla base della coda e la LN linfa inguinale dovrebbe essere immediatamente visualizzata. Dinamiche immagini di fluorescenza vengono acquisite immediatamente dopo l'iniezione e per un massimo di 20 min iniezione seguente. Poco dopo l'iniezione (pochi secondi o minuti), vasi linfatici tra il sito di iniezione e la LN inguinale e successivamente alla regione ascellare LN sono visualizzati nella vista laterale. L'immagine illustrata nella figura 2 è stata presa 5 min. dopo l'iniezione with 10 pl di ICG ID alla base della coda. Il punto luminoso tra le regioni inguinali e ascellari è il fegato.

Figura 3
Figura 3. Dal momento che i vasi linfatici nei topi variano da animale ad animale, come fanno negli esseri umani, la variazione in architettura tra gli animali possono essere visti ed è stabile nel tempo. Mouse # 124 è stato iniettato con ICG alla base della coda e ripreso immediatamente il giorno 1. Il pannello superiore contiene l'immagine ottenuta al giorno 1 e un'immagine ottenuta 2 giorni dopo (il giorno 3) utilizzando il mouse e la stessa iniezione / protocollo di imaging. Il pannello inferiore contiene immagini ottenute da un altro mouse (# 127) iniettato con ICG e il giorno immediatamente ripreso 1 e successivamente ripreso il giorno 3. Mentre l'architettura linfatico (il modello dei vasi linfatici) varia tra moutilizzare # 124 e # 127, le immagini ottenute con NIRF sono coerenti per ogni mouse nei giorni 1 e 3.

Figura 4
Figura 4. Quando microlitri 5-10 ICG o NIRF 'Abd-ID viene iniettato sulla faccia dorsale della zampa posteriore di un normale mouse, due vasi linfatici devono essere visualizzati drenante per la LN poplitea. Dinamiche immagini di fluorescenza vengono acquisite immediatamente dopo l'iniezione e per un massimo di 20 min iniezione seguente. In alcuni casi è difficile distinguere due navi per la loro vicinanza come illustrato nell'immagine ingrandita rappresentata dal riquadro tratteggiato. Per il mouse rappresentante mostrato qui, 10 pl di ICG è stato iniettato nella parte dorsale sinistra, zampa posteriore (sito di iniezione prima) e nella parte sinistra della base della coda (sito di iniezione secondo). Questa immagine è stata captured circa 2 - 3 minuti dopo la prima iniezione e circa 30 sec - 1 min dopo la seconda iniezione.

Figura 5
Figura 5. (A) Occasionalmente visualizzazione dei linfatici è ritardata o alterato, più comunemente causa dell'iniezione viene somministrata SC invece di ID. Quando 10 pl di ICG o CabD-IRDye800 SC viene iniettato alla base della coda di un topo normale usando un ago di calibro 31, trasporto linfatico non sarà immediatamente visualizzata causa dei tempi necessari per la tintura di raggiungere e prendere dalla capillari linfatici nella pelle. Inoltre, a causa dell'iniezione relativamente profonda SC, può non esserci assorbimento linfatico e quindi nessuna visualizzazione dei vasi e linfonodi. Nella Figura 5 (a), Un topo è stato iniettato con 10 microlitri di ICG alla base della coda e SC immagini sono state acquisite 5 min dopo l'iniezione. Il colorante al sito di iniezione possono essere visualizzati e non vasi linfatici o linfonodi possono essere visualizzati. Questo è il motivo per iniezioni ID sono importanti. (B) Visualizzazione dal lato ventrale dell'animale dei vasi linfatici aberranti derivanti da una ferita si trovò un giorno prima durante la rimozione di pelliccia con tagliaunghie (lesione dei tessuti notato sul lato destro dell'animale). L'immagine è stata catturata circa 5 minuti dopo 10 pl di ICG ID è stato somministrato alla base della coda su ciascun lato sinistro e destro. Sulla non-feriti (animale sinistro), la LN inguinale può essere visualizzato e la nave relativamente semplice drenaggio linfatico efferente in alto verso il LNS ascellari. Sul lato destro del mouse, tuttavia, sistema vascolare linfatico normale è stato interrotto a causa di ferite e sembra aberrante a causa di riparazione dei tessuti (formazione di croste).


Analisi di Figura 6. Quantitativa della funzione contrattile linfatico consiste nel selezionare ROI lungo i vasi linfatici drenanti da (a) la LN inguinale alla LN ascellare e (d) il sito di iniezione sulla parte dorsale della zampa al LN poplitea. Una immagine ingrandita (inserto in (a)) del rettangolo rosso tratteggiato illustra la selezione della ROI lungo il vaso fluorescente. Una compilazione di intensità media di fluorescenza in funzione del tempo per tutte le ROI da (a) e (d) è rappresentato dalla pseudo-colore grafico mostrato in (b) e (e), rispettivamente. Le perturbazioni di intensità di fluorescenza in pixel rappresentano una linfatico "impulso" che si propaga attraverso il ROI e are parallelo alle frecce. L'intensità media di fluorescenza per rois 22 e 45 da (b) sono mostrati in (c) e l'intensità media di fluorescenza per rois 18 e 34 da (e) sono mostrati in (f). Profili di intensità di fluorescenza in funzione del tempo (come mostrato in (c) e (f)) facilitare l'identificazione di pacchetti di linfa moltiplicazione e l'estrazione del tempo di transito e la distanza tra due ROI. Il due ROI sono selezionati sulla base in parte alla loro posizione lungo il vaso linfatico e la chiarezza con cui vengono visualizzati i valori massimi e minimi rappresenta propagazione linfa. Velocità viene calcolata come il rapporto tra la distanza tra due ROI e il tempo di transito che è preso tra il picco di intensità di fluorescenza. Clicca qui per ingrandire la figura


Figura 7. Per visualizzare i vasi linfatici drenanti dalla regione inguinale alla regione ascellare, iniettare il lato sinistro o destro della base della coda. In generale, per visualizzare il lato sinistro, iniettare in posizione 5, 6, 9, o 10, e per visualizzare il lato destro, iniettare in posizione 7, 8, 11, o 12. Posizioni da 1 a 4 può essere troppo inferiore sulla coda di un assorbimento ottimale di visualizzare drenaggio linfatico dalla regione inguinale alla regione ascellare.

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Discussion

Usiamo una consuetudine, piccolo sistema animale NIRF immagini per catturare immagini di vasi linfatici etichettati nei topi. Per costruire film di circolazione linfatico, 300 o più immagini sono raccolte. Per l'analisi funzionale dei vasi linfatici da film, ROI due o più sono disegnata a mano lungo un vaso linfatico. Le dimensioni della ROI sono mantenute costanti per ciascun recipiente e sono approssimativamente il diametro del vaso. Mentre risoluzione animale intero territorio può rappresentare vasi linfatici fluorescenti di 100 micron o meno, un macrolens per immagini con risoluzione più fini possono essere impiegati 10. Bianco-luce immagini di riferimento anatomico può essere acquisito anche con un basso consumo della lampada. Va notato che se gli agenti di imaging sono composti di altri coloranti fluorescenti con eccitazione differente / spettri di emissione di fluorescenza, allora i filtri sopra descritti devono essere modificati per mantenere le prestazioni di imaging, e dosaggio agente può essere necessario regolare pure. Inoltre, se la lunghezza d'onda di eccitazione è Less di 750 nm, quindi autofluorescenza può provocare, segnale di fondo aumenta, e la sensibilità di imaging diminuirà. Inoltre, l'instabilità di agenti in soluzione può precludere l'uso di alcuni coloranti NIRF, come Cyanine 7 (Cy7).

La scelta del sito di iniezione adeguato dipende in cui vasi linfatici sono in fase di studio. Per visualizzare i vasi linfatici drenanti dalla regione inguinale alla regione ascellare, è necessario iniettare il lato sinistro o destro della base della coda, come mostrato in Figura 7. Per visualizzare i vasi linfatici di drenaggio della regione palazzo, è necessario iniettare l'aspetto dorsale della zampa posteriore. È essenziale per mantenere la temperatura corporea degli animali entro valori normali, come cambiando la temperatura corporea può provocare funzione linfatica incoerente. Inoltre, a causa della limitata gamma dinamica della maggior parte CCD, i siti di iniezione devono essere coperti con carta nera per bloccare thereb fluorescentey che consente la visualizzazione dei dimmer drenaggio vasi linfatici. Imaging deve essere eseguita in una stanza buia per ridurre segnali di fondo indesiderati dovuti a emissione di luce nella banda di fluorescenza dalle luci camera. L'animale deve essere disteso su sfondo nero mentre immagini viene eseguita per ridurre la retrodiffusione luce.

Immagini linfatico NIRF può consentire una migliore comprensione delle malattie linfatiche e di come cambia l'architettura linfatici e la funzione in relazione a malattie o lesioni. Ad esempio, il gruppo di ricerca ha utilizzato NIRF immagini nei piccoli animali per fornire fenotipizzazione linfatico degli animali 6,15 e per rilevare i cambiamenti nella funzione linfatica e architettura con metastasi del cancro 10. Negli esseri umani, la tecnica è stata utilizzata per rilevare i primi segni di linfedema 2, valutare la risposta alla terapia linfedema 13,14,16, e dei membri della famiglia con fenotipo linfatico ereditari. Tuttavia, non invasiva visualization dei linfatici profondi (> 3 cm) nell'uomo è limitata dalla dispersione della luce nel tessuto. Immagini di strutture linfatiche fino a 3 cm di profondità sono state acquisite nei suini 9 e imaging umano. Negli esseri umani, linfoscintigrafia MRI e dinamica sono stati utilizzati per quantificare il tempo di transito del mezzo di contrasto dal sito di iniezione ai linfonodi nella malattia. Tuttavia, non hanno sufficiente risoluzione temporale e spaziale di visualizzare gli eventi linfatici propulsione prontamente ripreso con NIRF. Inoltre, linfatici sani non sono visualizzate con risonanza magnetica a causa della mancanza di contrasto. NIRF di imaging non è invasiva, a differenza confocale, microscopia multiphoton, e di imaging intravitale. Tecniche di microscopia confocale e genere multifotone utilizzare tessuti parzialmente o totalmente asportato. Metodi Scintographic richiedono l'impiego di radionuclidi e cannula nave a volte minore. Un altro metodo per visualizzare i vasi linfatici coinvolge l'imaging intravitale nel corso del quale si trova il mousel'eutanasia e il derma è tirato indietro dopo iniezione ID di Evans colorante blu. Tuttavia, questo metodo non fornisce imaging funzionale o longitudinale 17,18. Metastasi LN possono essere esposte utilizzando un Siemens Inveon PET / CT, tuttavia, questa tecnica non permette la visualizzazione di struttura linfatica o funzione 19.

Anche se gli autori non raccomanda né sostiene alcun specifico dispositivo di imaging commerciale, la nostra esperienza indica che la scelta della fonte di luce e filtri di luce può essere il fattore più importante che determina la sensibilità del dispositivo. Come descritto da Zhu et al., Per l'imaging di successo di basse concentrazioni di colorante, ci deve essere sovrapposizione minima tra lo spettro di emissione della sorgente luminosa e lo spettro di trasmissione dei filtri ottici 20. Un altro fattore chiave è lo spettro di assorbimento e di emissione del colorante NIRF utilizzato. In questo ICG carta e 'Abd-IRDye800 hanno spe similectra e quindi la lunghezza d'onda descritta diodo laser e combinazioni di filtro può essere utilizzato per ogni, tuttavia, se un altro colorante è da utilizzare che non assorbe e / o fluorescenza a queste lunghezze d'onda, la lunghezza d'onda della sorgente di luce e dei filtri ottici devono essere adeguato di conseguenza. ICG può essere sufficiente per molte applicazioni, ed è già approvato dalla FDA. NIRF-'Abd non è approvato dalla FDA per l'uso negli esseri umani, ma possono essere utili per l'imaging animale. ICG non ha residui chimici collegamento per collegare porzioni di targeting, agenti fluorescenti, così come altri NIRF-CabD, vengono sviluppate.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare, ma alcuni autori sono elencati su un brevetto.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da i seguenti aiuti a Eva Sevick: NIH R01 CA128919 e NIH R01 HL092923.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Indocyanine green (ICG) Patheon Italia S.P.A. NDC 25431-424-02 Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL)
Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) Bachem Custom Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL)
IRDye800 Li-COR IRDye 800CW Reconstitute according to manufacture's instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations
Sterile Water Hospira, Inc., Lake Forest, IL NDC 0409-4887-10
NAIR Church Dwight Co., Inc. Local Stores www.nairlikeneverbefore.com
Imaging System (components below) Center for Molecular Imaging N/A Custom-built in our laboratories.
Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera Princeton Instruments, Trenton, NJ Photon Max 512
Nikon camera lens Nikon Inc., Melville, NY Model No. 1992, Nikkor 28mm
Optical filter Andover Corp., Salem,NH ANDV11333 Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens
785-nm laser diode Intense Ltd, North Brunswick, NJ 1005-9MM-78503 500 mW of optical output
Collimating optics Thorlabs, Newton, NJ C240TME-B Collimates laser output prior to cleanup filter
Clean-up filter Semrock, Inc., Rochester, NY LD01-785/10-25 Removes laser emission in fluorescence band
Optical diffuser Thorlabs, Newton, NJ ED1-C20 Diffuses the laser over the animal
V++ Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand Version 5.0 Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/
Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis
ImageJ National Institutes of Health, Bethesda, MD Most current version available Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/
MATLAB MathWorks, Natick, MA Version 2008a or later http://www.mathworks.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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