Captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de DNA genómico

Published 10/05/2012
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Descrita é um processo de rotulagem em duas etapas usando β-glicosiltransferase (β-GT) para transferir uma azida de glucose para 5 HMC, seguido por química do clique para transferir de um ligante de biotina para o enriquecimento fácil e densidade independente. Este método de marcação eficiente e específico permite o enriquecimento de 5 HMC com fundo extremamente baixo e de alto rendimento de mapeamento epigenômico via sequenciamento de última geração.

Cite this Article

Copy Citation

Li, Y., Song, C. X., He, C., Jin, P. Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA. J. Vis. Exp. (68), e4441, doi:10.3791/4441 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

5-metilcitosina (5-mC) constitui ~ 2-8% das citosinas totais no DNA genómico humano e um impacto de uma ampla gama de funções biológicas, incluindo a expressão de genes, a manutenção da integridade do genoma, a impressão parental, inactivação do cromossoma X, a regulação dos desenvolvimento, envelhecimento, cancro e 1. Recentemente, na presença de um oxidado 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5 HMC), foi descoberto em células de mamíferos, em particular no estaminais embrionárias (ES) e células neuronais 2-4. 5 HMC é gerado por oxidação de 5-mC catalisada por TET família de ferro (II) / α-cetoglutarato-dependente dioxigenases 2, 3. 5 HMC é proposto para ser envolvido na manutenção de células estaminais embrionárias (MES), a hematopoiese normal e doenças malignas, e o desenvolvimento do zigoto 2, 5-10. Para melhor compreender a função da 5-HMC, um sistema de sequenciação fiável e simples é essencial. Seqüenciamento bissulfito tradicional não pode distinguir 5 HMC de 5-MC 11 12.

Aqui descrevemos um procedimento em duas etapas simples para rotulagem química seletiva de 5-HMC. No passo de rotulagem em primeiro lugar, 5 HMC em ADN genómico é marcado com um catalisada 6-azida-glucose por β-GT, uma glicosiltransferase de bacteriófago T4, de uma maneira que transmite a 6-azida-glucose a 5 HMC do cofactor modificado, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). No segundo passo, biotinilação, de um ligante de biotina de dissulfureto é ligado ao grupo azida por química do clique. Ambos os passos são altamente específicos e eficiente, levando à completa marcação, independentemente da abundância de 5 HMC em regiões genómicas e dando de fundo extremamente baixos. Seguindo a biotinilação de 5 HMC, os fragmentos de 5 HMC contendo ADN são então selectivamente capturadautilizando contas de estreptavidina de um modo independente de densidade. Os fragmentos resultantes de 5 HMC enriquecidas de DNA pode ser utilizado para as análises a jusante, incluindo a última geração de sequenciação.

Nossa marcação selectiva e protocolo de captura confere alta sensibilidade, aplicável a qualquer fonte de DNA genômico com variáveis ​​/ diverso 5 HMC-abundâncias. Embora o objetivo principal deste protocolo é a sua aplicação a jusante (ou seja., Sequenciamento de última geração para mapear a distribuição de 5 HMC no genoma), é compatível com molécula única, em tempo real SMRT (DNA) de seqüenciamento, que é capaz de fornecer uma única base de sequenciação de resolução de 5 HMC.

Protocol

1. A fragmentação de ADN genómico

Fragmento de ADN genómico utilizando sonicação de uma gama de tamanhos desejada adequada para a plataforma de sequenciamento do genoma. (Nós normalmente sonicar a ~ 300 pb.) Verificar a distribuição do tamanho do ADN genómico fragmentado em 1% de gel de agarose (Figura 1).

2. Preparação de ADN

Determinar as quantidades de ADN a partir baseadas na abundância de 5 HMC em ADN genómico. Desde 5-HMC níveis variam significativamente em diferentes tipos de tecidos, quantidades de DNA a partir dependem dos níveis de 5-HMC das amostras. Por favor, consulte a Tabela 1 para exemplos.

3. β-GT reacção catalisada (reacção de transferência de Glicose)

  1. Misturar por pipetagem da mistura, como detalhado na Tabela 2 e incuba-se em um banho de água a 37 ° C durante 1 h.
  2. Após a incubação, limpar-se a mistura reaccional com remoção Kit QIAquick Nucleotide, utilizando 10 jig de DNA porcoluna. Eluir com 30 ul de água por coluna e combinar.

4. Reação Biotinilação (Clique Química)

  1. Adicionar DBCO-SS-PEG3-biotina conjugado de solução de trabalho (1 mM) na solução de ADN eluído (do passo 3) para uma concentração final de 150 uM (ou seja, 5 uL de solução de trabalho por 30 ul de solução de ADN).
  2. Misturar por pipetagem, e incubar em banho de água a 37 ° C durante 2 horas.
  3. Limpe a reação com QIAquick Removal Kit Nucleotide. O volume de eluição total ideal é de 100 uL.
  4. Quantificar a quantidade de DNA recuperado usando microlitro espectrofotômetro escala (por exemplo., NanoDrop).

5. Captura de 5 HMC contendo DNA

  1. Lave 50 ul de Dynabeads MyOne Estreptavidina C1 3 vezes com 1 ml de 1X tampão B & W de acordo com as instruções do fabricante. Separa-se as pérolas com um suporte magnético.
  2. Adicionar um volume igual de 2X tampão B & W para o D recuperado biotiniladoNA (100 ul) às pérolas lavadas.
  3. Incubar durante 15 min à temperatura ambiente com rotação suave num agitador rotativo.
  4. Separa-se as pérolas com um suporte magnético e lavar as pérolas três vezes com 1 ml de 1X tampão B & W.
  5. Eluir o DNA através da incubação as pérolas em 100 ul de DTT mM preparada de fresco 50 durante 2 h à temperatura ambiente, com rotação suave num agitador rotativo.
  6. Separa-se as pérolas com um suporte magnético. Aspirar o eluente e uma carga para Micro Bio-Spin 6 Coluna de acordo com a instrução de fabrico para remover o DTT. O ADN alvo é a solução agora.
  7. Purifica-se o DNA eluído a partir do passo anterior, Qiagen Purification Kit MinElute PCR DNA e elui-se em 10 ul de tampão EB. Quantificar DNA usando Fluorometer Qubit ou NanoDrop se a concentração é superior a 20 ng / ul. O DNA está pronto para jusante preparação biblioteca genômica sequenciação.

6. Resultados representativos

Se a qualidade de of DNA genómico é elevada, o rendimento de recuperação típicos após a β-GT e reacções de biotinilação são ~ 60-70%. No entanto, a eficiência da captação variar significativamente com os tipos de tecidos diferentes, dependendo dos níveis de 5-HMC das amostras. Normalmente, a eficiência da captação de DNA genómico cérebro é ~% 4-9, e, em alguns casos extremos, a eficiência pode atingir até 12%. No caso de células ES, a eficiência da captação média é de aproximadamente 2-4%, em contraste com a ~ 0,5% para as células estaminais neurais. A menor eficiência visto até agora foi para o DNA genômico de células cancerosas. Todos DNA enriquecido está pronto para o padrão da próxima geração de protocolos de preparação de bibliotecas. Além disso, o ADN capturado pode também ser usado como molde para a PCR em tempo real para detectar o enriquecimento de alguns fragmentos em comparação com o ADN de entrada, se os iniciadores relacionados estão disponíveis.

Figura 1
Figura 1. Sonicados fragmentos genómicos humanos de DNA em1% de gel de agarose. De 10 ug de DNA genómico isolado a partir de células humanas do iPS em 120 ul de tampão TE 1X foi sonicada usando um dispositivo de ultra-sons (Covaris). Após sonicação, 2 ul do DNA sonicado foi carregada num gel de agarose a 1% utilizando 100 pb do marcador de DNA para comparar os tamanhos dos fragmentos de DNA sonicados.

Componente Volume Concentração Final
Água _ Ul
10 X tampão de reacção β-GT 2 ul 1 X
Até 10 ug de ADN genómico _ Ul Até 500 ng / uL
UDP-N-6, 3-Glc (3 mM) 0,67 ul 100 uM
β-GT (40 uM) 1 ul 2 uM
Volume total 20 ul

i) Para o DNA genômico de tecidos (conteúdo 5 HMC alta> 0,1%)

Componente Volume Concentração Final
Água _ Ul
10 X tampão de reacção β-GT 10 ul 1 X
Até 20 ug de ADN genómico _ Ul Até 500 ng / uL
UDP-6-N3-Glc (3 mM) Ul 1,33 100 uM
β-GT (40 uM) 2 ul 2 uM
Volume total 40 ul

ii) Para o ADN genómico de células estaminais (mediana 5 HMC conteúdo ~ 0,05%)

Componente Volume Concentração Final
Água _ Ul
10 X tampão de reacção β-GT 10 ul 1 X
Até 50 ug de ADN genómico _ Ul Até 500 ng / uL
UDP-6-N3-Glc (3 mM) 3,33 ul 100 uM
β-GT (40 uM) 5 ul 2 uM
Volume total 100 ul

iii) Para o câncer de DNA genômico de células (conteúdo 5 HMC baixo ~ 0,01%)

Tabela 1. Exemplos de quantidades de ADN de entrada e de reacções de etiquetagem utilizando as amostras com diferentes níveis de HMC-5 através do método selectivo química rotulagem.

Amostra 5 HMC nível ADN de partida (mg) A recuperação após a etiquetagem (entrada de esferas) (ig) Rendimento de recuperação Pull-down DNA (ng) Puxe para baixo rendimento
Cerebelo do rato adulto 0,4% 10 7,5 75% 236 3,1%
Pós-natal do rato 7 dias cerebelo 0,1% 11 9 82% 140 1,6%
Rato de células ES E14 0,05% 60 42 70% 350 0,8%

Tabela 2. Resultados representativos a partir de tecidos e células do cérebro de rato ES.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

5-hydroxymethylcytosine (5 HMC) é uma modificação do presente recentemente identificado epigenética em quantidades substanciais em certos tipos de células de mamíferos. O método aqui apresentado é para determinar a distribuição de todo o genoma de 5 HMC. Usamos bacteriófago T4 β-glicosiltransferase para transferir uma porção glucose engenharia contendo um grupo azida para o grupo hidroxilo de 5 HMC. O grupo azida pode ser quimicamente modificados com biotina para a detecção, o enriquecimento por afinidade, e sequenciamento de fragmentos de 5 HMC contendo ADN em genomas de mamíferos. Este processo tem vantagens sobre 5 HMC DNA imunoprecipitação com anticorpos hidroximetilada (hMeDIP-Seq) 13-15, embora o hMeDIP é simples, que tem uma forte tendência para a alta densidade de 5-HMC regiões e geralmente dá resultados inconsistentes de puxar independente -downs. Nosso método não introduzir viés.

Há, contudo, dois problemas possíveis em termos de rotulagem e a capturar meCTO. A primeira preocupação seria a especificidade da marcação e de captura. Uma vez que um estudo recente indicou que o 5 hydroxymethyluracil-(5-HMU) também pode servir como um substrato de β-GT, sinais falsos positivos podem ser introduzidos, levando a fragmentos enriquecidos, que são não-específica para 5 HMC-relação 16. Esta preocupação pode ser infundadas, embora, desde que altamente activos de 5-hydroxymethyluracil ADN-glicosilase são constantemente removendo este dano no DNA, resultando em essencialmente indetectável 5-HMU no genoma dos mamíferos 17,18. A segunda preocupação é a eficiência da rotulagem e da captura. Uma vez que os níveis de 5-HMC variar significativamente em diferentes tecidos e células, variando entre 0,5% em tecidos de cérebro de 0,05% em células de MES e de 0,01% para as células cancerosas, é essencial que os nossos métodos são aplicáveis ​​a todos estes tecidos em termos de a jusante aplicações do ADN marcado e capturado genómico. A nossa experiência mostra que os métodos descritos aqui são, de facto sensível e específicosuficiente para analisar todos estes tecidos para o propósito de comparação, quer a quantificação baseado de 5-HMC níveis entre os tecidos ou para aplicações a jusante, tais como a sequenciação de profundidade para mapear a distribuição de 5 HMC no genoma 19-21.

A chave para o nosso método é a utilização de uma quantidade apropriada de partida de ADN genómico. Se a concentração de ADN genómico é muito baixa, a eficiência e especificidade de rotulagem diminuirá na mesma proporção. Com base na nossa experiência, apesar da abundância de 5 HMC é suficientemente elevada no DNA a partir de tecidos do cérebro, se a concentração é inferior a 25 ng / ul em 20 ul de reacção, a etiquetagem e a eficiência de captura, bem como a especificidade, será significativamente reduzido. Para as amostras de baixa abundância de ADN, para além do requisito de concentração, a quantidade total de ADN é essencial para obter elevada e eficiência de captura específico. Assim, embora se necessita apenas de 25 ng de fragmentos de 5 HMC enriquecidas de DNA para o st jusanteprotocolos de biblioteca andard geração empregadas pelas plataformas da próxima geração de sequenciação, a quantidade inicial de ADN genómico a partir de tecidos cerebrais não deve ser inferior a 2 ug (e a quantidade ideal de partida é ug 5-10). Através de tentativa e erro, temos aperfeiçoado o montante inicial de DNA genômico a partir de tecidos diferentes, com variáveis ​​5-HMC abundâncias para obter eficiência de marcação e especificidade, como detalhado na Tabela 2.

Em resumo, nosso método é qualificado para rotular precisamente genômica 5 HMC e especificamente capturar os fragmentos 5 HMC contendo, tornando-se um protocolo bem sucedido em termos de sensibilidade e especificidade para a jusante ensaios de seqüenciamento da próxima geração.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgements

Este estudo foi financiado em parte pelo Instituto Nacional de Saúde (GM071440 a CH e NS051630/MH076090/MH078972 para PJ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
5M Sodium chloride (NaCl) Promega V4221
0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Promega V4231
1M Trizma base (Tris) pH7.5 Invitrogen 15567-027)
HEPES 1M, pH7.4 Invitrogen 15630
Magnesium chloride (MgCl2) 1M Ambion AM9530G
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418
Tween 20 Fisher BioReagents BP337-100
DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate Click Chemistry Tools A112P3
1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure Invitrogen 15508-013
QIAquick Nucleotide Removal Kit Qiagen 28304
Micro Bio-Spin 6 Column Bio-Rad 732-6222
Dynabeads MyOne Invitrogen 650-01
Streptavidin C1
Qiagen MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004
UltraPure Agarose Invitrogen 16500500
UDP-6-N3-glucose Active Motif 55013
Enzyme
β-glucosyltransferase (β-GT) New England Biolab M0357
Equipment
Sonication device Covaris
Desktop centrifuge
Water bath Fisher Scientific
Gel running apparatus Bio-Rad
NanoDrop1000 Thermo Scientific
Labquake Tube Shaker Barnstead
Labquake Tube Shaker Thermolyne
Magnetic Separation Stand Promega Z5342
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen
Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. Suppl 33. 245-254 (2003).
  2. Ito, S. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466, 1129-1133 (2010).
  3. Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
  4. Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
  5. Ko, M. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
  6. Koh, K. P. Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).
  7. Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).
  8. Wossidlo, M. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nat. Commun. 2, 241 (2011).
  9. Gu, T. P. The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes. Nature. 477, 606-610 (2011).
  10. Dawlaty, M. M. Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development. Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).
  11. Huang, Y. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One. 5, e8888 (2010).
  12. Song, C. X. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).
  13. Pastor, W. A. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473, 394-397 (2011).
  14. Matarese, F., Pau, C. arrillo-deS. anta, E,, Stunnenberg, H. G. 5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block. Mol. Syst. Biol. 7, 562 (2011).
  15. Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, 181 (2010).
  16. Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. Biochemical characterization of recombinant β-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes. Biochemistry. (2012).
  17. Rusmintratip, V., Sowers, L. C. An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).
  18. Globisch, D. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
  19. Yildirim, O. Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells. Cell. 147, 1498-1510 (2011).
  20. Szulwach, K. E. Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells. PLoS Genet. 7, e1002154 (2011).
  21. Szulwach, K. E. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats