تحليل التصوير من الخلايا العصبية إلى الخلايا الدبقية في التفاعل منهاج الثقافة ميكروفلويديك (MCP) على أساس الخلايا العصبية والخلايا الدبقية اكسون نظام المشاركة في الثقافة

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

هذه الدراسة توضح إجراءات إنشاء محور عصبي رواية العصبية و(الفلكية) الدبقية منصة شارك في الثقافة. في هذا النظام المشترك والثقافة، والتلاعب التفاعل المباشر بين محور عصبي واحد (واحد الخلية الدبقية) يصبح ممكنا، مما يسمح للتحليل الآلي للعصبون إشارات متبادلة لالدبقية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Higashimori, H., Yang, Y. Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System. J. Vis. Exp. (68), e4448, doi:10.3791/4448 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الخلايا العصبية المناسبة لتفاعل الخلايا الدبقية أمر بالغ الأهمية للعمل الفسيولوجية للجهاز العصبي المركزي (CNS). وتوسطت متطور هذا الاتصال ثنائي الاتجاه عن طريق محددة مسارات الإشارات العصبية بين الخلايا الدبقية و1،2. تحديد وتوصيف هذه المسارات إشارة ضرورية لفهم كيفية الخلايا العصبية لعلم وظائف الأعضاء الدبقية التفاعل CNS الأشكال. سابقا، تم الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الثقافات المختلطة المستخدمة على نطاق واسع لاختبار وتميز بين مسارات الإشارات العصبية والخلايا الدبقية. ما تعلمناه من هذه الاستعدادات وغيرها من الأدوات في الجسم الحي، ومع ذلك، فقد اقترح أن يشير المتبادل بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية وقعت في كثير من الأحيان في حجرات داخل الخلايا العصبية المحددة (أي محور عصبي، التغصنات، أو سوما) 3. هذا يجعل من المهم لوضع نظام ثقافة جديدة تسمح فصل الأجزاء العصبية ويتناول على وجه التحديد التفاعل بين الخلايا الدبقية والعصبيةنال محاور عصبية / التشعبات. وبالإضافة إلى ذلك، فإن النظام التقليدي ثقافة مختلطة غير قادر على التمييز بين العوامل القابلة للذوبان وإشارات الاتصال المباشر بين الخلايا العصبية وغشاء الخلايا الدبقية. وعلاوة على ذلك، فإن كمية كبيرة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في نظام المشاركة في الثقافة التقليدية تفتقر إلى القرار اللازم لمراقبة التفاعل بين محور عصبي واحد وخلية الدبقية.

في هذه الدراسة، ونحن تصف الرواية ومحور عصبي الدبقية نظام المشاركة في الثقافة مع استخدام منصة ميكروفلويديك الثقافة (MCP). في هذا النظام شارك في الثقافة، والمثقف الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في غرفتين منفصلتين التي ترتبط من خلال قنوات متعددة المركزية. في هذا المنبر الثقافة ميكروفلويديك، يمكن لعمليات الخلايا العصبية فقط (محاور عصبية خاصة) أدخل الجانب الدبقية عن طريق القنوات المركزية. في تركيبة مع وضع العلامات القوية بروتين فلوري، وهذا النظام يسمح الفحص المباشر للإشارة مسارات التفاعلات بين محور عصبي / شجيري والدبقية، فإن مثل هذاق محور عصبي بوساطة تنظيم النسخي في، الدبقية الاتجار مستقبلات الخلايا الدبقية بوساطة الخلايا العصبية في محطات، والخلايا الدبقية بوساطة نمو محور عصبي. قطر الدائرة الضيقة ليحظر أيضا بشكل كبير من تدفق المتوسطة الخلايا العصبية التخصيب الى غرفة الدبقية، وتسهيل التحقيق للتفاعل غشاء من البروتين مباشرة بين محاور عصبية / التشعبات والسطوح الدبقية.

Protocol

1. جمعية الثقافة ميكروفلويديك الدائرة (MCP)

  1. MCP (الشكل 1) هي الدوائر المفتوحة مصممة للثقافات مجزا من أنواع مختلفة من الخلايا 4. لديها عادة اثنين من مقصورات التي ترتبط من خلال القنوات المركزية (3 ميكرون في القطر). جمعية MCP مع الزجاج ذات قاع الأطباق ضروري لإعداد الثقافات واللاحقة تحليل التصوير.
  2. الأولى، ومعطف العقيمة ذات قاع زجاجي مع الأطباق Polyornithine (سيغما الدريخ، 1 ملغ / مل) الذائب في بورات ثنائي الصوديوم (سيغما الدريخ، 10 ملي درجة الحموضة 8.5) وحضنت بين عشية وضحاها في C. ° 37
  3. في اليوم التالي، تم غسلها المغلفة الزجاج ذات قاع أطباق ثلاث مرات مع DDH 2 O ويجفف تحت غطاء محرك السيارة والدخان العقيمة. كانت الأطباق الزجاجية القاع ثم المغلفة مع مزيد من laminin (سيغما الدريخ، 1 ملغ / مل) وتجفيفها تحت أشعة UV لمدة 1 ساعة. الأطباق المغلفة تكون جاهزة للاستخدام أو يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. هذه لطلاءإعادة طلاء الخلايا العصبية اللازمة لوالخلايا النجمية في الثقافة المشتركة.
  4. لتجميع منصة الثقافة، وضعت منصات الثقافة ميكروفلويديك على رأس من الأطباق الزجاجية ذات قاع المغلفة مع قنوات الاتصال المركزية على الجانب السفلي لتشكيل ختم مشددة. أضيفت الخلايا العصبية العادية أو وسائل الثقافة نجمية (من المناطق الطلاء الخلية) على كلا الجانبين (الشكل 1) في MCP تجميعها وحضنت لمدة 2-4 ساعات في C ° 37، لضمان عدم وجود تسرب بين MCP والزجاج قاع الطبق. لقد اختبرنا قبل الخلايا المتوسطة مع الطلاء لضمان عدم وجود تسرب. وينبغي جمعية MCP على صحن من الزجاج ذات قاع الطازجة قبل استخدامها.

2. إعداد الثقافة الخلايا العصبية ومحاور عصبية تحريض الخلايا العصبية في تجميعها MCP

  1. وأعدت طازجة القشرية مزارع الخلايا العصبية الجنينية من أدمغة فئران 14-16 يوما. وتتكون ثقافة المتوسط ​​الخلايا العصبية من neurobasal المتوسطة، 2٪ B27 neurobasaL الملحق، 2 مم الجلوتامين بإضافة 1٪ من GlutaMAX 100X، و 1٪ البنسلين-streptomysin. بعد تشريح مخ الفأر، تمت إزالة القشرة من السحايا تحت المجهر تشريح. ومفروم ثم الأنسجة مع شفرة حلاقة لجعل كتل الأنسجة الصغيرة من أجل زيادة مساحة السطح المعرض للالتربسين. وtrypsinized كتل الأنسجة (سيغما الدريخ، التربسين 0.05٪) لمدة 10 دقيقة في حمام مائي 37 ° C، وفصلها بعد ذلك بلطف بواسطة سحن مع ماصة باستور النار مصقول. تم تصفية الخلايا من خلال مصفاة فصل ميكرون 70 إلى جمع واضحة التعليق الخلية العصبية.
  2. كانت مطلية الخلايا العصبية (2-3 × 10 6 / مل، 150 ميكرولتر) على المناطق الطلاء الخلية على الجانب الأيمن (الشكل 1) من MCP تجميعها بحيث الخلايا العصبية يمكن أن نعلق في الخلية الاحتفاظ المنطقة (الشكل 1). كانت مطلية الخلايا العصبية الطازجة مع طلاء الخلايا العصبية التي المتوسطة وتستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني (Hyclone) في اللوائح التنظيميةR المتوسطة الخلايا العصبية الثقافة. فقط لأن الخلايا العصبية التي تربط الخلايا في منطقة الاحتفاظ القابلة للنمو محاور عصبية في الجانب الآخر من MCP تجميعها من خلال القنوات المركزية، من المهم أن الكثافة العالية لوحة من الخلايا العصبية في منطقة الخلية الطلاء لضمان ما يكفي من الخلايا العصبية هي التي تعلق على خلية الاحتفاظ المنطقة. يظهر صورة ممثل كثافة عالية من محاور عصبية الخلايا العصبية في الشكل 2A.
  3. في اليوم التالي، تم استبدال المتوسطة الطلاء من قبل الخلايا العصبية الخلايا العصبية الثقافة المتوسطة العادية. تم انجازه من قبل الشفط تغيير المتوسطة بعناية المتوسطة من الخلية المنطقة الطلاء للغرفة، ولكن ليس من الخلية المنطقة الإبقاء على MCP تجميعها. من أجل تجنب فقاعات الهواء في الخلية والاحتفاظ المنطقة الوسطى قنوات الاتصال وسوف فقاعات الهواء تمنع بشدة ثمرة محور عصبي ودخولها لاحقا في القنوات المركزية في MCP. وأضيف أيضا خلايا الدبقية عامل التغذية العصبية المشتقة (GDNF، 10-20 نانوغرام / مل) على الجانب (اليسار) أخرىللغرفة في نفس اليوم لتسهيل ثمرة تحريض محور عصبي 5 من الجانب العصبية وعبر من خلال القنوات المركزية للتجمع MCP (الشكل 2A). ويلاحظ أيضا قدر لا بأس به من عفوية دون ثمرة محوار GDNF من الجانب العصبية وعبر من خلال القنوات المركزية للتجمع MCP. ويلاحظ في كثير من الأحيان محاور عصبية التي تدخل في قناة المركزي 2-3 أيام بعد الطلاء. وبمجرد أن يدخل في محاور عصبية القناة الوسطى، وعادة ما يدخلون الجانب الآخر خلال يوم واحد. محاور عصبية سليمة عادة ما تكون لمدة أسبوع على الأقل بعد دخول الجانب الآخر.

3. إضافة إلى الخلايا النجمية مثقف MCP لإنشاء مجزأة المشارك ثقافة النظام

وأعدت الثقافات نجمية الأساسي من المخ P1-3 الماوس الجرو. الإجراء تفارق الدماغ مشابه للإجراء زنزانة انفرادية العصبية المذكورة أعلاه. كانت مطلية 1 الخلايا النجمية في صحن 10 سم التي تم مسبقا-المغلفة مع Polyornithine (سيغما الدريخ، 1 ملغ / مل). تم تغيير ثقافة المتوسط ​​نجمية (DMEM، و 10٪ مصل بقري جنيني، 1٪ البنسلين-streptomysin) كل يوم لمدة اليومين المقبلين لإزالة الحطام. بعد ذلك، تم تغيير المتوسطة كل ثلاثة أيام.

  1. الخلايا النجمية تصبح متموجة 90٪ وتشكيل أحادي الطبقة بعد 7 أيام. وtrypsinized الخلايا النجمية ومتموجة و150 ميكرولتر من إعادة علقت الخلايا النجمية (1x10 6 / مل) إعادة مطلي في الخلية طلاء المنطقة من الجانب الأيسر من MCP تجميعها عند محاور عصبية على وشك الدخول أو دخلت فقط في الجانب الأيسر من وتجميعها MCP. كانت مطلية عادة 4-5 أيام بعد النجمية الخلايا العصبية كانت مطلية. كان أولا من إزالة الطلاء GDNF قبل إعادة من الخلايا النجمية في الجانب الأيسر من MCP. كانت تعلق إعادة مطلي الخلايا النجمية في الخلية الاحتفاظ المنطقة، كما هو موضح من قبل المناعية GFAP (الشكل 1). تدفق سوى الحد الأدنى من المتوسط ​​بين الجانبين للدوائر (يحددها د مضانتم العثور نعم) في MCP، كما هو موضح سابقا 4،6.
  2. الخلايا النجمية تصبح متموجة 90٪ وتشكيل أحادي الطبقة بعد 7 أيام. وtrypsinized الخلايا النجمية متموجة و 150 ميكرولتر من إعادة علقت الخلايا النجمية (1 × 10 6 / مل) تم إعادة مطلي في الخلية طلاء المنطقة من الجانب الأيسر من MCP تجميعها عند محاور عصبية على وشك الدخول أو دخلت للتو الى اليسار جانب من MCP تجميعها. كانت مطلية عادة 4-5 أيام بعد النجمية الخلايا العصبية كانت مطلية. كان أولا من إزالة الطلاء GDNF قبل إعادة من الخلايا النجمية في الجانب الأيسر من MCP. كانت تعلق إعادة مطلي الخلايا النجمية في الخلية الاحتفاظ المنطقة، كما هو موضح من قبل المناعية GFAP (الشكل 1). تم العثور على تدفق فقط الحد الأدنى من المتوسط ​​بين الجانبين للدوائر (يحدده الأصباغ مضان) في MCP، كما هو موضح سابقا 4،6.
  3. بعد إعادة الطلاء من الخلايا النجمية، محاور عصبية التي دخلت الجانب الأيسر من MCP تجميعها تتفاعل مباشرة مع النجمocytes عن طريق الاتصال المباشر إما محور عصبي أو إطلاق العوامل القابلة للذوبان. المناعية من astroglial GLT1 غشاء البلازما نقل الغلوتامات والعصبية تويولين βIII-أجريت لتصور التفاعل بين الخلايا النجمية ومحاور عصبية، وكما هو مبين في الشكل 2D-F.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الوقت الفاصل بين التصوير من محور عصبي تحليل الناجم عن تفعيل الخلايا النجمية في المروج GLT1

الخلايا العصبية ومجزا نجمية نظام المشاركة في الثقافة يسمح فقط العمليات العصبية، محاور عصبية خاصة، للتفاعل مع انتقائي الخلايا النجمية. بعد نجاح إنشاء محور عصبي ونجمية (أو الخلايا الدبقية الأخرى) شاركت في الثقافة MCP تجميعها، يمكن دراسة أنواع مختلفة من محور عصبي الدبقية التفاعلات مثل؛ محور عصبي الناجم عن تفعيل جين astroglial تفعيل المروج، نجمية الناجم عن توجيه محور عصبي ، محور عصبي التي يسببها astroglial كا 2 + ردا على ذلك، ومحور عصبي الناجم عن توليف المايلين في oligodendrocytes قد. كل هذه التطبيقات الاستفادة من توافر للصحفيين الفلورسنت القوية المتاحة للخلايا الدبقية أو الأصباغ تحميل لهذه الخلايا.

نحن هنا وصف محور عصبي التي يسببها تفعيل الترانسكربتي من astroglial الغلوتامات نقل 1 (GLT1) المروج باستخدام الصبغي الاصطناعي البكتيريبعض (BAC) GLT1 EGFP الفئران المعدلة وراثيا وهذا التجزئة نظام المشاركة في الثقافة. في GLT1 الفئران المعدلة وراثيا BAC EGFP، وoverexpressed مراسل مضان EGFP تحت سيطرة المروج الجينومية GLT1 7. التعبير عن مراسل EGFP يرتبط التعبير الذاتية المروج GLT1 البروتين تفعيل والنشاط وظيفية 7 مما يتيح إجراء تقييم لنشاط المروج في الخلايا النجمية واحد GLT1 في الموقع. Astroglial GLT1 التعبير تعتمد بشكل كبير على تحفيز الخلايا العصبية 6،8. الخلايا النجمية الأولية التعبير عن المستويات الدنيا من GLT1، ومع ذلك، هي التي يسببها بشدة مستويات التعبير GLT1 (سواء مرنا والبروتين) في الخلايا النجمية التي يشترك في الخلايا العصبية مثقف مع 9. ويرد الأدلة هنا من قبل تفاعلية مناعية GLT1 زيادة كبيرة في نظام المشاركة في ثقافة التجزئة (الشكل 3). في الخلايا العصبية التقليدية وشارك في الثقافات نجمية، كثافة عالية من الخلايا العصبية جعلها أقل مثالية لمراقبةتأثير محاور عصبية الخلايا العصبية على تفعيل الترانسكربتي من GLT1 المروج.

وقد حثت لرصد المروج GLT1 محور عصبي التي تعتمد على التنشيط، ومثقف الخلايا العصبية النوع البري في الجانب الأيمن من MCP تجميعها ومحاور عصبية في أعقاب تطبيق GDNF على الجانب الأيسر من MCP تجميعها. تم زراعة الخلايا النجمية المستمدة من الفئران BAC EGFP GLT1 في الجانب الأيسر من MCP بعد أن تم تجميعها الناجمة محاور عصبية ودخلت فقط في الجانب الأيسر من MCP تجميعها. تم جمع ما مجموعه 6 أيام (24 ساعة إلى 140 ساعة) الوقت الفاصل بين الصور لمراقبة EGFP تغير كثافة مضان في الوقت الحقيقي ونمو محور عصبي في MCP. وكما هو مبين في الشكل 4A، لاحظ الحد الأدنى للغاية التعبير مضان EGFP في الخلايا النجمية 24 ساعة بعد الطلاء من الخلايا النجمية. ولوحظ زيادة كبيرة في كثافة EGFP 48 ساعة بعد ثقافة المشترك (في الفترة من 24 إلى 68 ساعة ساعة) عندما محاور عصبية بشكل جيد في الجانب نجمية والتفاعلاتر الاتصال مباشرة مع الخلايا النجمية (الشكل 4 قبل الميلاد). من ناحية أخرى، انخفض تدريجيا كثافة مضان EGFP مرة واحدة وتراجع محاور عصبية ونحط من kainite (200 ميكرومتر) التي يسببها موت الخلايا العصبية في الجانب (اليمين) من الخلايا العصبية MCP تجميعها (الشكل 4D-F). دينامية التغيير من كثافة مضان EGFP ردا على محاور عصبية بوضوح أن astroglial النشاط المروج GLT1 هو عن طريق التضمين التفاعل محور عصبي.

الشكل 1
الشكل 1. الرسم التخطيطي من الخلايا العصبية ميكروفلويديك ونجمية منصة شارك في الثقافة. ميكروفلويديك منصة الثقافة (MCP) واثنين من مقصورات التي ترتبط من خلال القنوات المركزية. يمكن مطلي الخلايا من الخلية المنطقة الطلاء على كل جانب وتكون ناتجة محاور عصبية من الخلايا العصبية المنطقة والاحتفاظ تمر عبر الأنف والحنجرة لقنوات المركزي إيه الجانب الآخر (إدراج مقياس بار 50 ميكرومتر).

الشكل 2
الشكل 2. كشف تحريض الخلايا العصبية محاور عصبية والتفاعل مع محاور عصبية من الخلايا النجمية في MCP MCP. (A) كثافة عالية من الخلايا العصبية في الخلية المنطقة الإبقاء على MCP تجميعها، من خلال βIII-تويولين المناعية. مقياس بار: 50 ميكرومتر (B) مكبرة ضوء محاور عصبية عبور قنوات الوسطى والدخول في الجانب الآخر من MCP. مقياس بار: 100 ميكرومتر النمو اكسون (C) التي كشفت عنها مخروط تلطيخ bIII-تويولين عندما محاور عصبية الدخول في الجانب الآخر من MCP. مقياس بار: 100 ميكرومتر (D) حزم اكسون التي تنمو من خلال قناة الوسطى والدخول في الجانب الآخر من MCP. (E) كشف الخلايا النجمية من قبل المناعية GLT1 في الجانب الدبقية من MCP. (F) الصورة مدموجة يعرض الاتصال بين الخلايا النجمية محاور عصبية وGLT1 إيجابية. مقياس بار: 50 ميكرومتر.

together.within صفحة = "دائما"> الشكل 3
الشكل 3. الخلايا العصبية التي تعتمد على تحريض الخلايا النجمية في التعبير GLT1 الأولية GLT1 تفاعلية مناعية في (A) نجمية الثقافات الأولية، شريط مقياس: 50 ميكرومتر (B) الثقافات العصبية الأولية، و (C) الخلايا العصبية الابتدائية ونجمية شارك في الثقافات. شريط النطاق: تظهر الخلايا المناعية من قبل تويولين-βIII. ولوحظ زيادة كبيرة في الخلايا العصبية في GLT1 تفاعلية مناعية ونجمية شارك في الثقافات.

الشكل 4
الشكل 4. تم جمع الوقت الفاصل بين الصور من محور عصبي التي يسببها تفعيل المروج في GLT1 MCP مع الخلايا النجمية BAC EGFP GLT1 والخلايا العصبية نوع البرية. التغيرات الدينامية من شدة EGFP ونمو محاور عصبية من خلال تسجيل الوقت الفاصل بين 6D بعد الطلاء نجمية. (A) 24H (B) 48h (C) 68h (D) 92H (E) 112H (F) 140H. دخول منولوحظ xons (التي أبرزها الأسهم الصفراء) إلى جانب نجمية من 48h إلى 92H التي ترتبط كثافة EGFP زيادة مضان. خفض كثافة مضان EGFP حدث من 112H 140H بعد لkainite (200 ميكرومتر) تم تطبيق على الجانب العصبية في 92H للحث على موت الخلايا العصبية وضمور محور عصبي. مقياس بار: 50 ميكرومتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخلايا العصبية القائمة على MCP والخلايا النجمية نظام المشاركة في الثقافة يسمح تشريح الخلايا العصبية إشارات تفصيلية لمسارات دبق نجمي الخلايا عن طريق السماح فقط محاور عصبية تمرير القنوات المركزية والتفاعل مع الخلايا astroglial. ويمكن هذا النظام شارك في وضع مريح الثقافة مع الخلايا العصبية التقليدية والإجراءات الثقافة نجمية. وصفنا أيضا التطبيق العملي لهذا النظام المشترك من خلال توظيف الثقافة مراسل EGFP مقرها لإثبات محور عصبي التي تعتمد على تفعيل الخلايا النجمية في المروج GLT1.

هذه الخلايا العصبية على أساس ودبق نجمي الخلايا MCP شارك في ثقافة النظام يوفر مزايا عدة بالمقارنة مع الأساليب التقليدية شارك في الثقافة: 1) القدرة على تصور وتحديد التفاعل بين محاور عصبية واضحة المورفولوجية واحد والخلايا النجمية في الوقت الحقيقي تحت المجهر عالية الدقة 2) بئر التي تسيطر عليها المكروية مستقلة لتطبيق التلاعب الدوائية لخلية محددة تأثير 3) تحليل تفعيل المروجوالتعبير البروتين الناجم حصرا / يصل ينظم الخلايا النجمية التي هي في طريق التضمين الاتصال محاور عصبية. كما تم الإجراءات لثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة الابتدائي 10 و 11 oligodendrocytes قد راسخة، يمكن هذا التعاون الثقافة MCP النظام ينطبق أيضا على الخلايا العصبية لعصبون إلى الخلايا الدبقية الصغيرة ودبقية قليلة التغصن شارك في الثقافات. وفي الوقت نفسه، فإننا ندرك أيضا أن يكون الغرض من هذه الثقافة النظام المشترك لتحليل الصور الحساسة على مستوى خلية واحدة، والتي هي مكملة لنهج التقليدية لتحليل كمية كبيرة من الخلايا، مثل الحمض النووي الريبي أو تحليل البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، لدينا نظام يبسط التفاعل بين الخلايا العصبية الهائلة والخلايا الدبقية في الجسم الحي من خلال التفاعل بين خلية واحدة تجسد ومحور عصبي. وينبغي النظر في كل هذه عند تفسير النتائج من هذا النظام شارك في الثقافة. في الجهاز العصبي المركزي، والتفاعلات بين الخلايا الدبقية محاور عصبية مختلفة موجودة على نطاق واسع وهي ذات أهمية حاسمة لكلا الخلايا العصبية والدبقية ظائف 12،13. وتطوير هذا النظام شارك في ثقافة تسمح التصوير القائم على تشريح هذه التفاعلات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نود أن نشكر الدكتور جيفري روثشتين لتوفير BAC GLT1 الفئران EGFP والأجسام المضادة GLT1؛ تافتس مركز البحوث العصبية (NIH P30 NS047243؛ PI، روب جاكسون) لتوفير المرافق الأساسية قيمة؛ جديد كلية منحة التوظيف (NIH P30-02 5P30NS069254 ؛ PI، فيل هايدون) في علم الأعصاب تافتس الإدارة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal bovine serum Hyclone SH30070.03 for plating neuron for neuron cutlure medium
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F4135 for astrocyte culture medium
Glial derived nerve factor R&D Systems 212-GD Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber
Dulbecco modified eagle medium high glucose Sigma-Aldrich 11995
70 mm cell strainer BD Falcon 352350
Sterile glass bottom dish MatTek Corporation
Microfluidic culture platforms Xona Microfluidics LLC SND150
6 wells of the culture plate Cellstar 657 160

Neuron culture medium

  • Neurobasal medium
  • 2% B27 Neurobasal supplement
  • 2 mM glutamate by adding 1% 100x GlutaMAX
  • 1% Penicillin-streptomysin

Neuron culture medium for plating cell

  • Neurobasal medium
  • 2% B27 Neurobasal supplement
  • 2 mM glutamate by adding 1% 100x GlutaMAX
  • 1% Penicillin-streptomysin
  • 5% Fetal bovine serum SH30070.03

Astrocyte culture medium

  • Dulbecco modified eagle medium high glucose
  • 10% Fetal bovine serum F4135
  • 1% Penicillin-streptomysin

Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stevens, B. Neuron-astrocyte signaling in the development and plasticity of neural circuits. Neuro-Signals. 16, 278-288 (2008).
  2. Paixao, S., Klein, R. Neuron-astrocyte communication and synaptic plasticity. Current opinion in neurobiology. 20, 466-473 (2010).
  3. Fields, R. D., Stevens-Graham, B. New insights into neuron-glia communication. Science. 298, 556-562 (2002).
  4. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature. 1, 2128-2136 (2006).
  5. Wang, C. Y. Regulation of neuromuscular synapse development by glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturin. The Journal of biological chemistry. 277, 10614-10625 (2002).
  6. Yang, Y. Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1. Neuron. 61, 880-894 (2009).
  7. Regan, M. R. Variations in promoter activity reveal a differential expression and physiology of glutamate transporters by glia in the developing and mature CNS. The Journal of neuroscience. 27, 6607-6619 (2007).
  8. Swanson, R. A. Neuronal regulation of glutamate transporter subtype expression in astrocytes. The Journal of neuroscience. 17, 932-940 (1997).
  9. Schlag, B. D. Regulation of the glial Na+-dependent glutamate transporters by cyclic AMP analogs and neurons. Molecular pharmacology. 53, 355-369 (1998).
  10. Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. Journal of immunological. 300, 32-46 (2005).
  11. Espinosa-Jeffrey, A., Wakeman, D. R., Kim, S. U., Snyder, E. Y., de Vellis, J. Culture system for rodent and human oligodendrocyte specification, lineage progression, and maturation. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, (2009).
  12. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
  13. Debanne, D., Rama, S. Astrocytes shape axonal signaling. Science signaling. 4, pe11 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics