Höger systolisk tryckmätningar i kombination med Skörd av lung-och Immune vävnadsprover i möss

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

En specifik och snabb protokoll att samtidigt undersöka höger hjärtfunktion, lunginflammation och immunsvaret beskrivs som ett verktyg för lärande. Video och siffror beskriver fysiologi och teknik mikrodissektion i en organiserad grupp-strategi som kan anpassas för att användas för små till stora studier.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chen, W. C., Park, S. H., Hoffman, C., Philip, C., Robinson, L., West, J., Grunig, G. Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice. J. Vis. Exp. (71), e50023, doi:10.3791/50023 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Funktionen av den högra hjärtat att pumpa blod genom lungorna, vilket förbinder högerhjärtat fysiologi och pulmonell vaskulär fysiologi. Inflammation är en vanlig modifierare av hjärta och lungfunktion, genom att utarbeta cellulär infiltration, produktion av cytokiner och tillväxtfaktorer, och genom att initiera ombyggnad processer 1.

Jämfört med vänster kammare, är den högra ventrikeln en lågtryckspump som verkar i en relativt smal zon av tryckförändringar. Ökade lungartären tryck är förknippade med ökat tryck i lungan kärlbädden och pulmonell hypertension 2. Pulmonell hypertoni är ofta förknippad med inflammatoriska lungsjukdomar, exempelvis kronisk obstruktiv lungsjukdom, eller autoimmuna sjukdomar 3. Eftersom pulmonell hypertension ger en dålig prognos för livskvalitet och livslängd är mycket forskning inriktad mot att förstå de mekanismer som MIGht vara mål för läkemedel ingripande 4. Den största utmaningen för utvecklingen av effektiva verktyg för pulmonell hypertension är komplexiteten i den samtidiga förståelse av molekylära och cellulära förändringar i den högra hjärtat, lungorna och immunsystemet.

Här presenterar vi en processuell arbetsflöde för snabb och exakt mätning av tryckförändringar i rätt hjärta möss och samtidigt skörden av prover från hjärta, lungor och immunförsvar vävnader. Metoden är baserad på direkta kateterisering av höger kammare via jugularvenen i nära överkropp möss, först utvecklades i slutet av 1990-talet som surrogat mått tryck i lungartären 5-13. Den organiserade team-strategi underlättar en mycket snabb rätt teknik hjärtkateterisering. Detta gör det möjligt att utföra mätningar i möss som spontant andas rumsluft. Organisationen av arbetet flöde i olika arbets-områdenminskar tidsfördröjning och öppnar möjligheten att samtidigt utföra fysiologiska experiment och skörd immun, hjärt-och lung vävnader.

Den processuella arbetsflöde beskrivs här kan anpassas för en mängd olika laboratoriemiljö och mönster studie, från små, riktade experiment till stora analyser av läkemedel. Den samtidiga förvärv av hjärt fysiologi data som kan utvidgas till att omfatta ekokardiografi 5,14-17 och skörd av hjärta, lungor och immunförsvar vävnad minskar antalet djur som behövs för att få fram data som rör den vetenskapliga kunskapsbas framåt. Den formella arbetsflödet presenteras här ger också en idealisk bas för att få kunskap om de nätverk som sammanbinder immun-, lung-och hjärtfunktion. Samma principer som beskrivs här kan anpassas för att studera andra eller ytterligare organ som behövs.

Protocol

1. Förberedelser

  1. Bered följande lösningar och rör (tabell 1) enligt följande:
    1. Hanks lösning, inget kalcium, magnesium eller indikator med penicillin (100 E / ml) / streptomycin (100 mg / ml).
    2. Fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 1x, inget kalcium, ingen magnesium.
    3. Etanol, 70%, gör 500 ml.
    4. Buffrad formaldehyd, 7-10% med PBS, göra 500 ml.
    5. Bedövning lösningar:
      1. Avertin. Tillsätt försiktigt 5 ml 2-metyl-2-butanol för att 5 g 2,2,2-Tribromoethanol. När löst, hålla förrådslösning vid rumstemperatur i mörker. Tag 0,25 ml av stamlösning och späd den med 10 ml 1 x PBS i glas botten flaska. Slå in flaskan med aluminiumfolie, rum vid 37 ° C tills löst och sedan alikvot till 5 ml polypropylenrör och hålla i kylskåp. Värm en alikvot på morgonen av experimentet.
      2. Barbiturat. Späd förrådslösning med PBS för att ge 2,6% barbiturat solmepannor. Placera 3-4 ml portioner i polypropenrör.
  2. Organisera tre arbets-områden (figur 1).
    1. Område A: Ordna följande: Studieform att rekordmånga studera identifiering, datum, kroppsvikt, vikter höger hjärta, hjärtats vänstra och septum, precision skala (0-50 g vid 0,01 g precision) för att bestämma kroppsvikt; mikro att fastställa hjärta vikter på 0,001 g noggrannhet, väga båtar, anestesi-lösningar (tydligt markerade), små dewar med flytande kväve, isolerad behållare med is, rör och 24-brunnars platta för att samla blod och vävnadsprov (tabell 1), kirurgiska instrument ( Tabell 2, Fig. 2), och lösningar för att rengöra instrument (tabell 1).
    2. Område B: Ordna följande: dissektionsmikroskop, rätt hjärta kateter ansluten till en tryck styrenhet som är ansluten till en förstärkare och bärbar dator. Katetern placeras ien bägare innehållande vatten. Ordna kirurgiska instrument (tabell 2), bitar av sutur snittet för optimal längd och placeras i en väger båt, tejp (autoklav band är optimalt) kapas till optimal längd och bredd och uppradade på mikroskop eller lab bänk för enkel åtkomst, kompresser bomull och hår borttagningslösning. Kalibrera katetern vid början av studien.
    3. Område C: Ordna följande: förstoringsglas lins, trakealkanyl, 1 ml sprutor, suturer kapas till optimal längd och placeras i en väger båt, små dewar med flytande kväve, isolerad behållare med is, rör och 24-brunnar för att samla BAL och vävnadsprover (tabell 1), kirurgiska instrument (tabell 2), lösningar för att utföra BAL och att rengöra trakealkanyl och instrument (tabell 1).

2. Rätt hjärtkateterisering

  1. Väg mus med användning av en precisions skala genom att försiktigt placera musen i en väger bhavre. Se till att hantera djuret mjukt och tyst. Spela vikt. Den beskrivna protokollet fungerar bäst för möss som är 20 g eller mer, eftersom diametern hos jugularvenen måste rymma tryck katetern, är det möjligt att kateterisera mindre möss (17 g eller mer) så länge som venen är tillräckligt stor.
  2. Bedöva musen genom injektion med Avertin beroende på kroppsvikten (10 pl / g), t.ex. för 20 g ger 200 pl, för 25 g ger 250 pl, för 30 g ge 300 pl. Den exakta injektionsvolymen behöver justeras beroende på musstam. Se till att hantera djuret mjukt och tyst eftersom stress kan ändra svaret på bedövningsmedel.
  3. När musen är lugnande preparat, plats på dubbel-veckat mjukpapper. Notera ID-numret på papperet. Försiktigt gnugga lotion hårborttagning i den ventrala aspekten av halsen för att rensa det kirurgiska området. Placera musen tillbaka på papperet och vänta 1-2 minuter.
  4. Ta bort hår från den ventrala aspektenav halsen genom att försiktigt stryka håret mot riktning hårväxt med tops.
  5. Försiktigt fastställa det erforderliga djupet av anestesi genom att kontrollera frånvaron av tån reflex: musen reagerar inte snatta sina tår.
  6. Arbeta snabbt och avslappnad, resten av rätt hjärtkateterisering inte ta mer än 10 minuter, optimalt 3-6 min. Det är viktigt att vävnaden inte torkar ut på grund av att katetern måste glida in i venen och flytta inuti venen på ett skikt av fukt. Konsekvent timing av förfarandet är viktig för generering av data som är jämförbara mellan grupperna.
  7. Placera musen igen mjukpapper och överföring med silkespapper på frigolit styrelse. Fix tassar och huvud på plats med autoklav tejp.
  8. Gör snitt i huden från mandibles till bröstbenet (bröst-ben).
  9. Försiktigt dissekera sköldkörtel stora uppåt mot mandibler att exponera den högra halsvenen ennd trakea.
  10. Placera frigolit styrelse håller musen under dissektion mikroskop med inriktning planet redan på plats och linsen cirka 0,8 x förstoring (total förstoring [lins X okular] är ungefär 8x.
  11. Försiktigt microdissect den högra jugularvenen genom avlägsnande omgivande bindväv med kirurgisk tång.
  12. Placera två bitar av sutur ovanpå den högra halsvenen. Knyt suturen närmast mandibles att stänga blodflödet i venen till en liten rännil, placera sutur som är närmast bröstbenet / bröst-ben i en lös knut runt venen. Man kan använda den lilla rännil av blod till senare hitta hålet i venen, det skulle bli nödvändigt.
  13. Andas och slappna av (lossa muskler i nacke och käke) för att hålla ögonen på venen genom okularet. Detta kommer att se till att dina händer och fingrar rör sig säkert, smidigt och avslappnad. Håll venen med pincett vid sidan närmastde mandibles, skär ett hål i venen mellan de två suturer med en mikro-sax drivs av den andra handen. Lägg ner de mikro-sax och hålla handen avslappnad, känsla för katetern. Försiktigt hämta katetern håller den mellan tummen och pekfingret (Figur 3). Föra in katetern i hålet av venen.
  14. Försiktigt föra katetern i den högra hjärtat (figur 3). Beakta markeringarna på katetern som ger en ungefärlig index hur långt katetern måste sättas och observera bildskärmen. När tryckkurvorna visas försiktigt dra den nedre suturen runt katetern. Eftersom katetern har draghållfastheten som ger det en spole, och eftersom andning och hjärtslag av musen lägga till rörelse, dessutom anbringa katetern med tejp.
  15. Rekord tryckmätningar för 2 minuter för senare analys (Figur 4).
  16. Öppna den suturhållande katetern, sedan försiktigt retrieve katetern. Torka del bakom tryckgivaren, placera tillbaka i bägaren med vatten. Rör inte tryckgivaren.
  17. Överför musen ovanpå tissuepapperet till område A för eutanasi, uppsamling av blod och mjältvävnad. Rengör kirurgiska instrument.
  18. Starta proceduren med nästa djur. När tidpunkten tillåter, injicera bedövningsmedel i väntan på att registrera tryckkurvan (2,15).

3. Insamling av blod och mjälte Prov

  1. Injicera barbiturat lösning, 400 pl per mus och vänta 1-2 minuter. Detta utförs rutinmässigt i vårt laboratorium för att undvika möjligheten att mössen oavsiktligt återhämta sig från Avertin-anestesi samtidigt som blod. Lämplig standardisering av experimentet uppnås genom att injicera samma dos av barbiturat lösning per mus, och genom att vänta på samma tid före skörd av blod. Om tillåtet enligt Institutional Animal Care och användning kommittén ochså länge djuren noggrant övervakas för djupet av anestesi före blodtappning, kan detta steg utelämnas.
  2. Gör snitt i buken. Öppna kaudalvenen (vena cava) och samla blod med hjälp av en överföringspipett.
  3. Avlägsna mjälten, eller en bit av mjälten i Eppendorf-rör och snäpp frysning i flytande kväve, eller i 24 brunnar i en brunn innehållande Hanks buffert för senare beredning av enskilda celler.
  4. Överför musen ovanpå tissuepapperet till arbets-område C för uppsamling av BAL, lunga dränerande lymfnod, lunga och hjärta vävnader. Rengör kirurgiska instrument.

4. Insamling av lung-och prov hjärta

  1. Dissekera luftstrupe fri från muskler och bindväv. Placera pincett under luftstrupen, dra suturen igenom. Försiktigt generera tillräcklig sträcka för att skära ett hål. Underhålla milda sträckan sätter trakealkanyl med en något vridrörelse och sutur kanyl into rum. För insättning av trakealkanylen, kontrollera att luftstrupen är fuktig, tillsätt vid behov en droppe Hanks lösning. Under hela förfarandet, andas, slappna av nacken och musklerna käke, för att hålla handrörelser säker och smidig.
  2. Dissekera öppna bröstkorgen genom att försiktigt avlägsna bröstbenet från den abdominala änden. Stör inte innehållet i bröstkorgen, eftersom detta kommer att göra det mycket svårt att hitta lymfkörteln.
  3. Utför bronkoalveolär lavage (BAL) genom att försiktigt föra in 1 ml Hanks buffert, vrid försiktigt sprutan och hämta BAL-vätska. Upprepa 3 gånger, nära röret och placera på is. Under hela förfarandet, hålla ögonen på änden av den trakeala kanylen som ansluter till sprutan. Blick till bröstkorgen för att observera uppblåsning och tömning av lungorna.
  4. Skörd lunga lymfkörtel genom att hålla väggen bröstkorgen med en uppsättning av tång, hitta och hämta lymfkörtel med en annan peang. Placera lymfkörtel i 24 brunnars platta. Det är viktigt att kNu var du vill söka: från nacken, hitta ingången av bröstkorgen från höger sida av musen och titta över ryggraden (Figur 5).
  5. Skörd hjärta och plats på mjukpapper. Isolera rätt hjärtat genom att försiktigt dissekera längs skiljeväggen. Överföring till arbets-område A att väga, notera vikten och placera in eppendorfrör att knäppa frysa i flytande kväve.
  6. Placera sutur runt den vänstra lungan loben för att stänga den viktigaste luftrör. Dissekera vänstra lungloben fri, plats i Eppendorf-rör och snäpp frysning i flytande kväve, eller plats i en brunn i en 24-brunnsplatta innehållande Hanks lösning för senare isolering av enkelcellsuspensioner.
  7. Infoga ca. 0,5 ml buffrad formaldehydlösning genom trakealkanylen in i de återstående lungloberna. Efter uppblåsning, dissekera lungloberna ur bröstkorgen och plats i 50 ml rör innehållande formaldehydlösning. För en alternativ studiedesign, kan lungorna blåsas med Optimal skära media (oktober, utspädd 1:4 med PBS) och frystes i en form med outspädda oktober för senare beredning av frusna sektioner. En annan studie utformning kan kräva att få snabbfrystes lungvävnad och enstaka cellsuspensioner från lungorna. I detta fall, är ingen inflation nödvändig: dissekera de återstående lungloberna, hämta dem från bröstkorgen och plats i den 24 brunnar i en brunn innehållande Hanks buffert.
  8. Ta trakealkanyl, ren genom att skölja med Hanks buffert, rena kirurgiska instrument.

5. Analys av Tryckkurvor genereras från höger hjärtkateter

De inspelade höger kammare tryckdata analyseras med hjälp LabChart 7 mjukvara med ingen kunskap om gruppens identitet varje inspelning. Mer än 20 kurvor väljs slumpmässigt och skillnaden mellan högsta och lägsta ventrikulära trycket för varje kurva uppmätt (AP). Den genomsnittliga AP beräknas ge rätt ventricular systoliska trycket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det primära effektmåttet för att erhålla rätt kurvor hjärta trycket uppnås genom rätt position för den högra hjärtat katetern. Formen på kurvorna tryck tiden är kritisk, eftersom den korrekta placeringen av katetern inuti den högra ventrikeln resulterar i tryck platåer (figur 4). Taggiga kurvor istället indikerar en kateter som förflyttas av andning eller hjärtslag rörelse mot väggen av den högra ventrikeln. Att upptäcka potentiella problem med stadiet av överlevnad hos djuren, måste standardavvikelsen för AP, och hjärtfrekvensen beräknas. Båda värdena förväntas vara ingen signifikant skillnad mellan behandlingsgrupperna. Dessutom är förväntningarna att AP värden och puls inte visar en drift över inspelningstid. Till exempel skulle sakta ökande Ap värden anger hypoxisk pulmonell vasokonstriktion 18-20. Minskad hjärtfrekvens skulle indikerase att nivån av anestesi är för hög leder till döden hos djuret. I vårt laboratorium olika människor utföra proceduren. Inom alla grupper av möss vi uppnår rutinmässigt 90-95% framgång priser att få rätt uppgifter ventrikulära trycket.

Medan du lär förfarandet, är det bäst att börja med äldre honmöss (25-30 g och mer) som har en större halsvenen och tenderar att ha mindre subkutana fettdepåer än hanmöss. Det bästa sättet att kontrollera placeringen av katetern är att avliva djuren så snart som katetern är fäst på insidan av venen. Dissekera djuret från hjärtat till direkt visualisera placeringen av katetern. Detta kommer i hög grad underlätta problemlösning.

Det första resultatet för att erhålla BAL-vätska är den korrekta placeringen av trakealkanylen. Detta indikeras av inflationen i lungorna när Hanks buffert ingjutit och tömning av lungorna när buffER avlägsnas. Den förväntade återhämtningen är 70-80% av den ingjutit volymen i kontrolldjur, mindre (ner till 50%) i djur som har lunginflammation. Skum på toppen av den återvunna BAL-vätskan indikerar närvaron av ytaktivt medel. Blod kontaminering av den återvunna BAL-vätskan sker antingen på grund av närvaron av betydande lunginflammation, eller på grund av instillation och återvinning av tvättvätska var alltför snabb. Det är att notera att vissa akuta åtgärder skada i lungorna kan induceras genom BAL förfarande. Om den experimentella designen är att förstå dessa akut skada parametrar och undersökning av BAL är också viktigt, då en lunga lob behöver bindas upp och avlägsnas före genomförande BAL.

I proceduren som visas här, skördar vi lungvävnad för histologi utan standardiserad inflation och perfusion i lungorna. I fall där exakt histologisk morfometri är den stora utläsning, bör lungorna blåsas via luftstrupen, och perfusion bör utföras via lungartären, allt under standardiserade tryck.

I det visade protokollet, hjärtat dissekeras att ge Fulton index mått på höger hjärthypertrofi (vikt höger kammare / vikt vänster kammare och septum). Dessutom är nya metoder utvecklas som bygger på histologisk utvärdering av den högra hjärtat. Framväxande histologiska mått på höger hjärthypertrofi är a) antalet kärnor inom ett definierat område av slumpmässigt utvalda rätt hjärta, och b) räknas av fartyg och fibrotisk index per område i hjärtat.

I vårt laboratorium är korrekt återvinning av lunga tömning mediastinal-och trakeobronkial lymfkörtlar (Figur 5) rutinmässigt kontrolleras av flödescytometri eftersom dessa vävnader är mycket små i kontrollmöss. Emellertid, beroende på microbiome i höljet anläggningen och djurens ålder, storlek av lymfkörtlarna i unchallenged kan kontrollmöss vara tillräckligt stor för endast visuell bekräftelse. Vid verifiering av flödescytometri, lymfkörtelceller måste skiljas från tymocyter. Av en slump, kan tymus lätt samplas tillsammans med lymfkörtel eftersom tymus och lymfknutor ligger nära varandra och finns i bröstkorgen. Distinktionen är att tymus ligger nära bröstbenet och lymfkörtel nära ryggraden. Ytterligare en utmaning är att bräss är mycket stor, med många fler celler än de små lymfkörtlar. Tymocyter kan lätt skiljas från lymfkörtelceller genom användning av flödescytometri och CD3, CD4, CD8 och markörer. Lymfkörtlar har karakteristiskt CD3 +-celler, av vilka de flesta är antingen positiva för CD4 eller CD8. I motsats, de flesta tymocyter är positiva för alla tre markörer (CD3 +, CD4 +, CD8 +). Närmare ingående information om lokalisering av noder mus lymfkörtlar finns i manuskriptet genomVan den Broeck et al. 21.

Konsekvent tidpunkten för varje huvud steget i förfarandet (hjärtkateterisering, återvinning av blod och mjälte, skörd av BAL-, lung-och vävnader hjärta) är avgörande för att ta fram uppgifter som gör det möjligt för robust jämförelse mellan behandlingsgrupperna. Därför rekommenderas det att åtminstone två, och tre bästa, utredarna samarbetar för att åstadkomma experimentet. Dessutom är det viktigt att utredarna utföra proceduren utan kännedom om gruppens identitet djuren. Därför har identifieringen av de uppgifter som skall göras på ett sätt som döljer gruppidentitet. Slutligen, är det också viktigt att den ordning i vilken djuren analyseras är randomiserad. Till exempel är en enkel identifierare dagen för experimentet och numreringen av djuren. Om det finns till exempel 4 grupper av djur (AD), tilldela identifiering och studera djuren i följande ordning: date_1: Aa, date_2: Ba, date_3: Ca date_4: Da date_5: Ab, date_6: Bb, date_7: CB, och så vidare.

Denna experimentella flöde möjliggör en djupgående, samtidigt studie av de molekylära mekanismer som styr lunginflammation och rätt hjärtfunktion. Samtidiga data och provtagningen uppnår bättre insikter molekylära nätverk och en minskning av antalet djur som behövs för att få nya biologiska kunskaper.

Typ av rör / bägare Lösning (volym) Utnyttjande
Behandling av blod
Eppendorf, 1,5 ml Blod för serum
EDTA belagd 2,0 ml Blod för plasma
Eppendorf, 0,5 ml Frys serum eller plasma Bearbetning av BAL
Polypropen, rund botten, 4,5 ml Samla lungsköljning
Polypropen, rund botten, 4,5 ml Frys BAL supernatanten
96-brunnsplatta, kjolar BAL-celler
Bearbetning av vävnad
Polypropylen, 50 ml Formaldehyd, 7,5 ml Fix lungvävnad
Eppendorf, 1,5 ml Snap lob frysa lunga
Eppendorf, 1,5 ml Snap frysa rätt hjärta
Eppendorf, 1,5 ml Snap frysa vänster hjärta
24-brunnars platta Hanks buffert, 0,5-1 ml Quick-lagring av lunglober för senare isolation av enstaka celler
24-brunnars platta Hanks buffert, 0,5-1 ml Snabb lagring av mjälte för senare isolering av enstaka celler
24-brunnars platta Hanks buffert, 0,5-1 ml Snabb lagring av lymfkörtlar för senare isolering av enstaka celler
För förfaranden
Glasbägare, 300 ml Autoklaverat vatten Fuktgivande och rengöring kateter
Polypropylenrör, 50 ml Hanks buffert, 50 ml Utför BAL
Polypropylenrör, 50 ml Hanks buffert, 50 ml Tvätta trakealkanyl
Polypropylenrör, 50 ml Desinfektionslösning Rengöring instrument
Polypropylenrör, 50 ml 70% etanol Cleaning instrument
Polypropylenrör, 50 ml Kranvatten Rengöring instrument

Tabell 1. Förberedelse och organisation av rör och lösningar.

Instrument Beskrivning Använd
Sax rundade eller raka 5,5 tum, runda eller vassa ändar Område A
Sax rundade 4,0 inches, vassa kanter
Tång 4,5 tum, böjd, med platta, gripa ändar
Tång 4,0 tum, böjd, med platta, gripa ändar
Sax Slim Blades/Angled- 9 cm B
Micro-sax Vannas Spring Sax - 2 mm klingor
Tång pincett (Dumon # 5 Fin)
Tång 4,0 tum, böjd, med platta, gripa ändar
Tång 4,0 tum, rak, med platta, gripande ändar
Sutur Flätad silkessutur 6-0
Kateter Tryckkateter
Sax rundade eller raka 5,5 tum, runda eller vassa ändar Område C
Sax rundade 4,0 inches, vassa kanter
Tång 4,5 tum, böjd, med platta, gripa ändar
Tång 4,0 tum, böjd, med platta, gripa ändar
Kanyl Trakealkanyl
Sutur Flätad silkessutur4-0

Tabell 2. Organisation av instrument, suturer, kateter, trakealkanyl.

Figur 1
Figur 1. Schematisk skiss av arbets-områdena. A) Arbets-område A för inspelning, vägning, insamling av blod och mjälte vävnad och tillfälliga innehav utrymme för djuren. B) Arbete-område B för höger hjärtkateterisering. C) Work-område C för skörd av BAL, lungor, lungor lymfkörtel, och vävnader hjärta.

Figur 2
.. Figur 2 instrument som används för förfarandet a) instrument för arbete-område A, B) instrument för höger hjärtkateterisering (arbets-område B), c) programtruments för arbete-område C. d) Trakealtuber kanyler. Linjalen visar storleken av instrumenten.

Figur 3
Figur 3. Höger hjärtkateter. Rätt hjärta kateter visas med märken och tejp (A), eller hållas för hand (B). Pennan pekar på de märken som gjorts på katetern (A). Införande av katetern (CE): rengöring av den högra halsvenen (C), sutureras venen hålls med pincett, är katetern förs fram mot ett hål som tidigare gjorts i venen (D), kateter efter insättning i ven (E). Pilarna pekar på katetern (D, E).

Figur 4 "/ Files/ftp_upload/50023/50023fig1highres.jpg" />
Figur 4. Exempel spår av tryckförändringar i den högra hjärtat. Spåren visar tryckförändringar (mmHg) över tid (min: sek), mjukvaran visar varje av kurvorna vid två olika hastigheter. Spåren av en kontroll mus (A), och en mus med inflammation inducerad pulmonell arteriell ombyggnad och hypertoni (B) visas. Kurvor används för mätning av den högra systoliska ventrikulära trycket är markerade. Notera den tydliga trycket platåer i de markerade kurvor. Pilen pekar på en kurva som har en spik som indikerar ett tekniskt fel. Dessa taggiga typer av kurvor kan inte användas för mätning av höger tryck systolisk. Klicka här för att se större bild .

0023fig5.jpg "alt =" Bild 5 "/>
Figur 5. Placering av en mediastinum / trakeobronkial lymfkörtel i förhållande till bröstkorg och ryggrad. Pilen pekar på lymfkörteln.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den experimentella flöde beskrivs här möjliggör snabb och samtidig mätning av höger kammare systoliskt blodtryck samt skörd av prover för analys av svaren i lungorna, hjärtat och immunförsvaret hos möss. Förfarandet kombinerar mätningar hjärta fysiologi, mikro-dissekering och senare vävnad skörd för levande celler studier, histologisk analys eller genomik-analys av vävnader. Hela förfarandet tar mindre än 20 minuter per mus. På grund av arbets-området organiserade arbetsflöde kan 2-3 djur studeras samtidigt. Därför är förfarandet lämpligt för små målinriktade försök 12 och stora skärmar skala i en mångfald olika inställningar, från ett litet laboratorium i ett stort läkemedelsföretag studie.

Kombinationen av mätningar hjärta fysiologi och vävnader skörd öppnar möjligheten att utföra analyser för att upptäcka biologiska nätverk som styr eller synkronisera hjärta, lungor ennd immunförsvar, utnyttja transgena och KO mus resurser. En viktig fördel med den samtidiga förfarandet flödet är minskningen av antalet djur som behövs per studie. En annan tillämpning av denna processuella arbetsflödet är möjligheten att studera andra eller ytterligare organ från samma djur som behövs.

Det förfarande som beskrivs här genererar rätt uppgifter hjärta trycket mycket snabbt, inom 5-10 minuter av anestesi induktion. Detta gör det möjligt att studera djuren medan de andas rumsluft spontant. En begränsning av tillvägagångssättet är att det är invasiv: Djuren bedövas, placeras de på ryggen, och en kateter förs via jugularvenen genom förmaket i den högra ventrikeln. Begränsningen är också fördelen med detta förfarande, eftersom data representerar direkta mätningar av tryckförändringar över tiden i den högra ventrikeln. Ytterligare tekniska förbättringar, särskilt beroende av miniatyrisering prEssure katetrar, kan tillåta att placera permanenta, kvarliggande katetrar i möss som gör det möjligt att direkt inspelning av lungartärtryck över flera veckor, vilket utförs på råttor 22-24 och andra större djur. Om införandet av en hjärt-kateter genom halsvenen i nära överkropp, spontanandning djur inte är möjligt kan en alternativ inspelning av rätt tryck systolisk ändringar görs i ventilerade djur genom öppning av bröstkorgen och placera trycket katetern genom en snitt direkt in i den högra ventrikeln 25. Icke-invasiva mätningar av höger hjärtfunktion kan göras med hjälp av ekokardiografi. Detta förfarande kan antingen utföras före rätt hjärtkateterisering eller möss kan undersökas med ekokardiografi för flera gånger för att studera sjukdomsförloppet innan de invasiva mätningar 5,14-17.

En annan tillämpning av detta förfarande är att erhålla Additional uppgifter. Som ett exempel, med användning av en kateter som kan mäta flöden och tryck, kunde högerhjärtat utgång samtidigt registreras tillsammans med rätt förändringar hjärta tryck. Det förfarande som beskrivs här kan också användas för att ytterligare förstå de fysiologiska, cellulära och molekylära förändringar som utlöser pulmonell hypertension annat än immunsvaret, t ex genetiska mutationer 8,10, cigarettrök exponering 26, eller infektioner mikrobiella 27-29 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements

Detta arbete har finansierats av National Institutes of Health 1R21HL092370-01 (GG), 1R01 HL095764-01 (GG), R01HL082694 (JW), American Heart Association, Founders affiliate (0855943D, GG), Stony Wold - Herbert Fund, New York (SHP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
2-Methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463
2,2,2-Tribrom–thanol Sigma-Aldrich T48402
disinfectant soap (Coverage Spray TB plus Steris) Fisher Scientific 1629-08
Ethyl Alcohol, 200 Proof, Absolute, Anhydrous ACS/USP Grade PHARMCO-AAPER 111000200 Dilute to 70 % with distilled water
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F1635-500ML Dilute to a 7-10 % formaldehyde concentration at a PBS concentration of 1x using PBS stock solution and water
Hanks solution, no calcium, magnesium Fisher Scientific 21-022-CV
O.C.T Tissue-Tek 4583
Penicillin (10,000 U/ml) / Streptomycin (10,000 mg/ml) solution Thermo Scientific SV30010
Phosphate buffered saline (PBS), no calcium, no magnesium, 1x and 10x solutions Fisher Scientific
Sodium pentobarbital 26% Fort Dodge Animal Health NDC 0856-0471-01
Labware
Plates 12, 24, 96 well Falcon
Transfer Pipet Fisher Scientific 13-711-9BM
Tube, EDTA coated Sarstedt 2013-08
Tubes 0.65 ml and 1.7 ml micro-centrifuge VWR
Tubes 12 x 75 mm polypropylene Fisher Scientific 14-956-1D
Tubes, various sizes, polypropylene Fisher Scientific
Instruments
Forceps, Dumon #5 Fine Fine Science Tools 11254-20
Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips curved Fine Science Tools 11152-10
Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips straight Fine Science Tools 11150-10
Cannula 18 ga, 19 ga BD Precision Glide Needles Cut to optimal length, blunted and outside rasped to create a rough outside surface.
Scissors, Dissector scissors-slim blades 9 cm Fine Science Tools 14081-09
Suture for BAL, braided silk suture, 4-0 Fine Science Tools SP116
Suture for right heart catheterization, braided silk suture, 6-0 Teleflex medical 18020-60
Syringe, 1 ml BD 309659
Equipment
Amplifier, PowerLab 4/30 ADInstrument Model ML866
Catheter, pressure F1.4 Millar Instruments, Inc 840-6719
Dissecting Microscope Variscope
Forceps, Vannas spring scissors-2 mm blades Fine Science Tools 15000-00
Halogen Illuminated Desk Magnifier Fisher Scientific 11-990-56
Laptop computer Asus Model number A52F i5 processor; 15 inch
Light Source Amscope HL-250-A
Pressure Control Unit Millar Instruments, Inc PCU-2000
Software, Labchart-Pro V.7 AD Instruments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Price, L. C., et al. Inflammation in pulmonary arterial hypertension. Chest. 141, 210-221 (2012).
  2. Olschewski, H., et al. Cellular pathophysiology and therapy of pulmonary hypertension. J. Lab. Clin. Med. 138, 367-377 (2001).
  3. Hassoun, P. M., et al. Inflammation, growth factors, and pulmonary vascular remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 54, S10-S19 (2009).
  4. Rabinovitch, M. Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension. J. Clin. Invest. 118, 2372-2379 (2008).
  5. Steudel, W., et al. Sustained pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy after chronic hypoxia in mice with congenital deficiency of nitric oxide synthase 3. J. Clin. Invest. 101, 2468-2477 (1998).
  6. Zaidi, S. H., You, X. M., Ciura, S., Husain, M., Rabinovitch, M. Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension. Circulation. 105, 516-521 (2002).
  7. Guignabert, C., et al. Tie2-mediated loss of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in mice causes PDGF receptor-beta-dependent pulmonary arterial muscularization. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 297, L1082-L1090 (2009).
  8. West, J., et al. Pulmonary hypertension in transgenic mice expressing a dominant-negative BMPRII gene in smooth muscle. Circ. Res. 94, 1109-1114 (2004).
  9. Cook, S., et al. Increased eNO and pulmonary iNOS expression in eNOS null mice. Eur. Respir. J. 21, 770-773 (2003).
  10. West, J., et al. Mice expressing BMPR2R899X transgene in smooth muscle develop pulmonary vascular lesions. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L744-L755 (2008).
  11. Tu, L., et al. Autocrine fibroblast growth factor-2 signaling contributes to altered endothelial phenotype in pulmonary hypertension. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 311-322 (2011).
  12. Daley, E., et al. Pulmonary arterial remodeling induced by a Th2 immune response. J. Exp. Med. 205, 361-372 (2008).
  13. Song, Y., et al. Inflammation, endothelial injury, and persistent pulmonary hypertension in heterozygous BMPR2-mutant mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, 677-690 (2008).
  14. Thibault, H. B., et al. Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension. Circulation. Cardiovascular imaging. 3, 157-163 (2010).
  15. Otto, C., et al. Pulmonary hypertension and right heart failure in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor-deficient mice. Circulation. 110, 3245-3251 (2004).
  16. Burton, V. J., et al. Attenuation of leukocyte recruitment via CXCR1/2 inhibition stops the progression of PAH in mice with genetic ablation of endothelial BMPR-II. Blood. 118, 4750-4758 (2011).
  17. Fujita, M., et al. Pulmonary hypertension in TNF-alpha-overexpressing mice is associated with decreased VEGF gene expression. J. Appl. Physiol. 93, 2162-2170 (2002).
  18. Motley, H. L., Cournand, A., Werko, L., Himmelstein, A., Dresdale, D. The Influence of Short Periods of Induced Acute Anoxia Upon Pulmonary Artery Pressures in Man. Am. J. Physiol. 150, 315-320 (1947).
  19. Liljestrand, G. Regulation of Pulmonary Arterial Blood Pressure. Arch. Intern. Med. 81, 162-172 (1948).
  20. Euler, U. S. V., Liljestrand, G. Observations on the pulmonary arterial blood pressure in the cat. Acta Physiol. Scand. 12, 301-320 (1946).
  21. Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. Journal of immunological. 312, 12-19 (2006).
  22. Rabinovitch, M., et al. Angiotensin II prevents hypoxic pulmonary hypertension and vascular changes in rat. Am. J. Physiol. 254, 500-508 (1988).
  23. Rabinovitch, M., Gamble, W., Nadas, A. S., Miettinen, O. S., Reid, L. Rat pulmonary circulation after chronic hypoxia: hemodynamic and structural features. Am. J. Physiol. 236, 818-827 (1979).
  24. Rabinovitch, M., et al. Changes in pulmonary blood flow affect vascular response to chronic hypoxia in rats. Circ. Res. 52, 432-441 (1983).
  25. Kugathasan, L., et al. The angiopietin-1-Tie2 pathway prevents rather than promotes pulmonary arterial hypertension in transgenic mice. J. Exp. Med. 206, 2221-2234 (2009).
  26. Bearer, C., Emerson, R. K., ORiordan, M. A., Roitman, E., Shackleton, C. Maternal tobacco smoke exposure and persistent pulmonary hypertension of the newborn. Environ. Health Persp. 105-202 (1997).
  27. Graham, B. B., et al. Schistosomiasis-induced experimental pulmonary hypertension: role of interleukin-13 signaling. Am. J. Pathol. 177, 1549-1561 (2010).
  28. Butrous, G., Ghofrani, H. A., Grimminger, F. Pulmonary vascular disease in the developing world. Circulation. 118, 1758-1766 (2008).
  29. Crosby, A., et al. Praziquantel reverses pulmonary hypertension and vascular remodeling in murine schistosomiasis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 184, 467-473 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics