Mesures systolique ventriculaire droite pression en combinaison avec la récolte du poumon et des échantillons de tissus immunitaires chez des souris

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Un protocole spécifique et rapide à la fois étudier la fonction cardiaque droite, une inflammation des poumons, et la réponse immunitaire est décrit comme un outil d'apprentissage. Vidéo et chiffres décrivent la physiologie et de techniques de microdissection dans une équipe organisée approche qui est adaptable pour être utilisé pour les petites et grandes études taille.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chen, W. C., Park, S. H., Hoffman, C., Philip, C., Robinson, L., West, J., Grunig, G. Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice. J. Vis. Exp. (71), e50023, doi:10.3791/50023 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

La fonction du cœur droit est de pomper le sang à travers les poumons, reliant ainsi la physiologie du cœur droit et la physiologie vasculaire pulmonaire. L'inflammation est un modificateur de la commune fonctions cardiaques et pulmonaires, par l'élaboration d'une infiltration cellulaire, la production de cytokines et de facteurs de croissance, et en lançant des processus de remodelage 1.

Par rapport au niveau du ventricule gauche, le ventricule droit est une pompe à basse pression qui fonctionne dans une zone relativement étroite de variations de pression. L'augmentation des pressions artérielles pulmonaires sont associés à une pression accrue dans le lit vasculaire pulmonaire et l'hypertension pulmonaire 2. L'hypertension artérielle pulmonaire est souvent associée à des maladies pulmonaires inflammatoires, par exemple maladie pulmonaire obstructive chronique, maladies auto-immunes ou 3. Parce que l'hypertension artérielle pulmonaire confère un mauvais pronostic pour la qualité de vie et l'espérance de vie, beaucoup de recherches sont orientées vers la compréhension des mécanismes qui might être la cible de 4 intervention pharmaceutique. Le principal défi pour le développement d'outils de gestion efficaces pour l'hypertension pulmonaire reste la complexité de la compréhension simultanée des changements moléculaires et cellulaires dans le cœur droit, les poumons et le système immunitaire.

Ici, nous présentons un workflow procédural pour la mesure rapide et précise des variations de pression dans le cœur droit de la souris et la récolte simultanée des échantillons de cœur, les poumons et les tissus immunitaires. La méthode est basée sur le cathétérisme directe du ventricule droit par la veine jugulaire en gros torse souris, d'abord développé dans les années 1990 comme mesure de substitution de pressions dans l'artère pulmonaire 5-13. L'équipe a organisé approche facilite une technique très rapide cathétérisme cardiaque droit. Cela permet d'effectuer les mesures sur des souris qui respirent spontanément l'air ambiant. L'organisation du flux de travail dans les différents domaines de travail-réduit le délai du temps et ouvre la possibilité d'effectuer simultanément des expériences de physiologie et de la récolte des tissus immunitaire, cardiaques et pulmonaires.

Le workflow procédural décrit ici peut être adapté à une grande variété de paramètres de laboratoire et des plans d'étude, des petits, des expériences ciblées, aux grands tests de dépistage de drogue. L'acquisition simultanée de données physiologie cardiaque qui peut être élargi pour inclure l'échocardiographie 5,14-17 et la récolte des tissus cardiaques, pulmonaires et du système immunitaire réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des données qui déplacent la base des connaissances scientifiques vers l'avant. Le workflow procédural présentée ici fournit également une base idéale pour acquérir des connaissances sur les réseaux qui relient immunitaire, pulmonaire et la fonction cardiaque. Les mêmes principes décrits ici peuvent être adaptées pour étudier d'autres organes ou supplémentaires, au besoin.

Protocol

1. Préparation

  1. Préparer les solutions suivantes et tubes (tableau 1) comme suit:
    1. Écheveaux solution, pas de calcium, de magnésium ou de l'indicateur avec de la pénicilline (100 U / ml) / streptomycine (100 mg / ml).
    2. Tampon phosphate salin (PBS), 1x, pas de calcium, de magnésium aucune.
    3. Éthanol, 70%, faire 500 ml.
    4. Tamponnée de formaldéhyde, de 7-10% avec du PBS, faire 500 ml.
    5. Solutions d'anesthésie:
      1. Avertin. Ajouter avec précaution 5 ml de 2-méthyl-2-butanol à 5 ​​g de 2,2,2-tribromoéthanol. Une fois dissous, gardez solution mère à la température ambiante dans l'obscurité. Prenez 0,25 ml de la solution mère et le diluer avec 10 ml d'1xPBS en bouteille à fond de verre. Envelopper la bouteille avec du papier d'aluminium, placer à 37 ° C jusqu'à dissolution, puis aliquote dans des tubes de 5 ml en polypropylène et conserver au réfrigérateur. Chauffez une aliquote du matin de l'expérience.
      2. Barbituriques. Diluer la solution mère avec du PBS pour donner 2,6% barbiturique solution. Placez aliquotes 3-4 ml dans des tubes en polypropylène.
  2. Organiser trois travaux-zones (figure 1).
    1. Zone A: Disposer les éléments suivants: Formulaire étude pour enregistrer le numéro d'identification étude, la date, le poids corporel, le poids du coeur droit, le coeur gauche et du septum, une balance de précision (0-50 g à 0,01 g de précision) pour déterminer le poids du corps; micro-échelle pour déterminer le poids du cœur à 0,001 g de précision; pèsent bateaux, les solutions d'anesthésie (clairement identifiés), petit vase de Dewar d'azote liquide; conteneur isotherme avec de la glace, tubes et plaques à 24 puits pour recueillir des échantillons de sang et de tissus (tableau 1); instruments chirurgicaux ( Le tableau 2, figure 2), et les solutions pour nettoyer les instruments (tableau 1).
    2. Zone B: Disposez les articles suivants: microscope de dissection; cathéter cardiaque droite relié à une unité de contrôle de la pression qui est connecté à un amplificateur et un ordinateur portable. Le cathéter est placé dansun bécher contenant de l'eau. Disposer les instruments chirurgicaux (tableau 2), des morceaux de coupe de suture à la longueur optimale et placés dans un bateau pèse; ruban (ruban autoclave est optimale) coupé à la longueur et la largeur optimale et alignés sur le banc microscope ou au laboratoire pour un accès facile, des cotons-tiges et Epilateur solution. Étalonner le cathéter au début de l'étude.
    3. Zone C: Disposez les éléments suivants: lentilles loupe; canule trachéale; seringues de 1 ml; coupe de suture à la longueur optimale et placé dans un bateau peser, petit vase de Dewar d'azote liquide; conteneur isotherme avec de la glace, tubes et plaques à 24 puits pour recueillir BAL et des échantillons de tissus (tableau 1), les instruments chirurgicaux (tableau 2), des solutions pour effectuer BAL et à nettoyer la canule trachéale et les instruments (tableau 1).

2. Cathétérisme cardiaque droit

  1. Peser souris à l'aide d'une balance de précision en plaçant délicatement la souris dans une pesée bd'avoine. Assurez-vous de traiter l'animal en douceur et en silence. Notez le poids. Le protocole décrit fonctionne le mieux pour les souris qui sont de 20 g ou plus parce que le diamètre de la veine jugulaire doit accueillir le cathéter de pression, il est possible de sonder les petites souris (17 g ou plus) tant que la veine est assez grand.
  2. Anesthésier la souris par injection avec Avertin en fonction du poids corporel (10 ul / g), par exemple pour donner 20 g 200 pi, pour donner 25 g 250 pi, pour donner 30 g 300 pl. Le volume d'injection exacte doit être ajustée en fonction de la souche de souris. Assurez-vous de traiter l'animal en douceur et en silence car le stress peut modifier la réponse à l'anesthésie.
  3. Une fois que la souris est sous sédatif, les placer sur du papier de soie plissé double. Notez le numéro d'identification sur le papier. Frottez doucement la lotion épilation à la face ventrale du cou pour dégager le champ opératoire. Placez la souris en arrière sur le papier et attendre pendant 1-2 min.
  4. Enlever les poils de la face ventraledu col par caressant doucement les cheveux dans le sens de la pousse des cheveux avec des cotons-tiges.
  5. Soin de déterminer la profondeur de l'anesthésie suffisante en vérifiant l'absence du réflexe de pointe: la souris ne réagit pas au pincement de ses orteils.
  6. En travaillant rapidement et détendue, le reste de l'cathétérisme cardiaque droit ne devrait pas prendre plus de 10 minutes, de façon optimale 3-6 min. Il est important que le tissu ne se dessèche pas parce que le cathéter doit glisser dans la veine et se déplacent à l'intérieur de la veine sur une couche d'humidité. Conformément moment de la procédure est importante pour la production de données qui soient comparables entre les groupes.
  7. Placez la souris sur le dos du papier de soie et de transfert de papier tissu sur mousse de polystyrène bord. Fixer les pattes et la tête en place avec du ruban autoclave.
  8. Faire une incision de la peau de mandibules au sternum (sternum).
  9. Disséquer soigneusement vers le haut thyroïde grands vers les mandibules pour exposer la veine jugulaire droite une trachée.
  10. Lieu polystyrène conseil d'administration en tenant la souris sous le microscope de dissection avec le plan focal déjà en place et la lentille à environ 0,8 x grossissement (grossissement total [pièce cristallin x] est d'environ 8x.
  11. Soigneusement microdissect la veine jugulaire droite en enlevant entourant le tissu conjonctif avec des pinces chirurgicales.
  12. Placez deux morceaux de suture au-dessus de la veine jugulaire droite. Attacher le fil de suture proche de la mandibule pour fermer le débit sanguin dans la veine d'un nombre très limité, de placer le fil de suture qui est plus proche de la poitrine / sternum à un noeud lâche autour de la veine. On peut utiliser le mince filet de sang pour trouver plus tard le trou dans la veine, si cela s'avérait nécessaire.
  13. Respirez et détendez-vous (desserrer les muscles du cou et de la mâchoire) pour garder vos yeux sur la veine à travers l'oculaire. Cela permettra d'assurer que vos mains et vos doigts se déplacer en toute sécurité, facilement et détendue. Tout en maintenant la veine avec une pince sur le côté le plus proche deles mandibules, découper un trou dans la veine entre les deux points de suture à l'aide de micro-ciseaux exploités par l'autre main. Déposez les ciseaux micro-, et de garder la main détendue que, pour sentir le cathéter. Doucement récupérer le cathéter en le tenant entre le pouce et l'index (Figure 3). Insérer le cathéter dans l'orifice de la veine.
  14. Avancer doucement le cathéter dans le coeur droit (figure 3). Observer les marques au cathéter qui donne un indice approximatif de la distance du cathéter doit être inséré et observer le moniteur. Une fois les courbes de pression sont affichées, serrez délicatement la partie inférieure de suture autour du cathéter. Parce que le cathéter a résistance à la traction qui lui donne une bobine, et parce que le rythme respiratoire et cardiaque de la souris ajouter du mouvement, en outre fixer le cathéter avec du ruban adhésif.
  15. Mesures de pression records pendant 2 minutes pour une analyse ultérieure (Figure 4).
  16. Ouvrez le support de suture du cathéter, puis doucement Retrieve cathéter. Essuyez la partie arrière du transducteur de pression, replacez-le dans le bol avec de l'eau. Ne touchez pas le capteur de pression.
  17. Transfert de la souris au-dessus du papier de soie à la zone A pour l'euthanasie, la collecte de sang et le tissu splénique. Nettoyer les instruments chirurgicaux.
  18. Démarrez la procédure avec l'animal suivant. Lorsque la synchronisation permet, injecter l'anesthésique dans l'attente d'enregistrer la courbe de pression (2,15).

3. Prélèvement des échantillons de sang et la rate

  1. Injecter barbituriques solution, 400 pi par souris et attendre pendant 1-2 min. Ceci est habituellement effectué dans notre laboratoire afin d'éviter la possibilité que les souris par inadvertance se remettre de l'anesthésie-avertin tout en étant saigné. Normalisation appropriée de l'expérience est réalisée en injectant la même dose de barbiturique solution par souris, et en attendant la même quantité de temps avant la récolte du sang. Si elle est autorisée par la protection des animaux et institutionnel Utiliser Comité etaussi longtemps que les animaux sont suivis pendant la profondeur de l'anesthésie avant la saignée, cette étape peut être omise.
  2. Faire une incision dans l'abdomen. Ouvrez la veine caudale (la veine cave) et recueillir le sang à l'aide d'une pipette de transfert.
  3. Ablation de la rate, ou un morceau de la rate dans le tube Eppendorf et refroidissement rapide dans l'azote liquide, ou dans la plaque à 24 puits dans un tampon contenant bien Hanks pour la préparation ultérieure de cellules individuelles.
  4. Transfert de la souris au-dessus du papier de soie pour le travail et la zone C pour la collecte des BAL, les ganglions lymphatiques drainant poumon, le poumon et les tissus cardiaques. Nettoyer les instruments chirurgicaux.

4. Collecte des échantillons du poumon et coeur

  1. Disséquer la trachée libre de muscle et de tissu conjonctif. Pince placement sous la trachée, tirez suture à travers. Doucement générer suffisamment extensible pour couper un trou. Maintenir l'étirement doux, insérer la canule trachéale en utilisant un mouvement tournant légèrement, et la suture canule into lieu. Pour l'insertion de la canule trachéale, assurez-vous que la trachée est humide, si nécessaire, ajouter une goutte de solution de Hanks. Tout au long de la procédure, respirer, se détendre le cou et les muscles de la mâchoire, de garder mouvements de la main sûre et en douceur.
  2. Disséquer ouvrir la cage thoracique en retirant avec précaution le sternum à partir de l'extrémité abdominale. Ne pas déranger le contenu du thorax car cela rendra très difficile de trouver le ganglion lymphatique.
  3. Effectuer lavage broncho-alvéolaire (LBA) en insérant doucement 1 ml de tampon de Hanks, tournez doucement la seringue et récupérer le liquide de LBA. Répétez 3 fois, tube étroit et place sur la glace. Tout au long de la procédure, garder les yeux sur l'extrémité de la canule trachéale qui se connecte à la seringue. Coup d'œil sur le thorax d'observer l'inflation et la déflation des poumons.
  4. Ganglion lymphatique récolte du poumon en maintenant paroi de la cage thoracique d'un jeu de pinces, la recherche et la récupération des ganglions lymphatiques avec une autre pince. Ganglions lymphatiques lieu en plaque à 24 puits. Il est important de kmaintenant où chercher: à partir de la nuque, trouver l'entrée de la cage thoracique du côté droit de la souris et regarder au-dessus de la colonne vertébrale (figure 5).
  5. Coeur de récolte et les placer sur du papier de soie. Isoler le cœur droit en prenant soin de dissection le long de la cloison. Transfert à l'aire de travail de A à peser, enregistrer le poids et la place dans des tubes Eppendorf de casser le gel dans l'azote liquide.
  6. Placez suture autour du lobe pulmonaire gauche pour fermer la bronche principale. Disséquer le poumon gauche lobe libre, le placer dans tube Eppendorf et refroidissement rapide dans l'azote liquide, ou le placer dans un puits d'une plaque à 24 puits contenant la solution de Hanks pour l'isolation ultérieure de suspensions de cellules isolées.
  7. Insérez env. 0,5 ml solution tamponnée de formaldéhyde par la canule trachéale dans les lobes pulmonaires restantes. Après l'inflation, disséquer les lobes pulmonaires sur le thorax et le placer dans tube de 50 ml contenant une solution de formaldéhyde. Pour une conception de l'étude alternative, les poumons peuvent être gonflés à l'optimal la coupe des médias (PTOM, dilué 1:4 avec du PBS) et congelés dans un moule contenant octobre non dilués pour la préparation ultérieure de coupes congelées. Une autre conception de l'étude pourrait nécessiter l'obtention de tissus pulmonaires pression congelés et des suspensions monocellulaires dans les poumons. Dans ce cas, pas d'inflation est nécessaire: disséquer les lobes pulmonaires restantes; les récupérer depuis le thorax et le placer dans la plaque de 24 puits dans un tampon contenant bien Hanks.
  8. Retirer la canule trachéale, le rincer avec du tampon de Hanks, nettoyer les instruments chirurgicaux.

5. L'analyse des courbes de pression générées à partir du cathéter cardiaque droite

Les données enregistrées pression ventriculaire droite sont analysés en utilisant LabChart 7 du logiciel sans aucune connaissance de l'identité du groupe de chaque enregistrement. Plus de 20 courbes sont sélectionnées de manière aléatoire et la différence entre le maximum et le minimum de pression ventriculaire pour chaque courbe de mesure (AP). L'AP moyenne est calculée pour donner le droit de vpression systolique entricular.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Le paramètre principal pour obtenir les courbes de pression droite du coeur est obtenue par la position correcte du cathéter cardiaque droite. La forme des courbes de temps de pression est essentielle, car le placement correct de l'intérieur du cathéter du ventricule droit se traduira par des plateaux de pression (figure 4). Courbes pointues, au contraire, indiquent un cathéter qui est déplacé par la respiration ou du rythme cardiaque mouvement contre la paroi du ventricule droit. Pour détecter les problèmes potentiels avec le stade de la survie des animaux, l'écart type de l'AP, et la fréquence cardiaque doit être calculé. Les deux valeurs devraient pas être significativement différente entre les groupes de traitement. En outre, on s'attend à ce que les valeurs de Ap et la fréquence cardiaque ne montrent pas de dérive dans le temps d'enregistrement. Par exemple, en augmentant progressivement les valeurs AP indique la vasoconstriction pulmonaire hypoxique 18-20. La diminution de la fréquence cardiaque serait INDICATe que le niveau de l'anesthésie est trop élevée conduit à la mort de l'animal. Dans notre laboratoire, différentes personnes effectuez la procédure. Dans tous les groupes de souris nous avons l'habitude d'atteindre des taux de réussite 90-95% dans l'obtention des données de pression ventriculaire droite.

Alors que l'apprentissage de la procédure, il est préférable de commencer avec les anciennes souris femelles (25-30 g et plus) qui ont une plus grande veine jugulaire et ont tendance à avoir moins de dépôts sous-cutanés de gras que les souris mâles. La meilleure façon de s'assurer de la mise en place du cathéter est d'euthanasier l'animal dès que le cathéter est fixé à l'intérieur de la veine. Disséquer l'animal à partir du cœur de visualiser directement la mise en place du cathéter. Cela facilitera grandement la résolution de problèmes.

Le premier résultat pour obtenir un fluide BAL est le placement correct de la canule trachéale. Ceci est indiqué par l'inflation des poumons lorsque tampon de Hanks est inculqué, et le dégonflement des poumons lorsque le buffer est supprimé. La reprise attendue est de 70-80% du volume instillé chez les animaux témoins, moins (jusqu'à 50%) chez les animaux qui ont une inflammation des poumons. Mousse sur le dessus du fluide récupéré BAL indique la présence d'un tensioactif. Contamination par le sang du fluide récupéré BAL se fait soit en raison de la présence d'une inflammation pulmonaire significative, soit parce que l'instillation et la récupération du fluide de lavage était trop rapide. Il est à noter que certaines mesures ponctuelles de blessures dans les poumons peut être induite par la procédure BAL. Si le protocole expérimental est de comprendre ces paramètres lésion aiguë et l'examen de la BAL est également important, alors un lobe du poumon doit être attaché et enlevé avant de procéder à BAL.

Dans la procédure indiquée ici, nous récoltons les tissus pulmonaires pour l'histologie standard sans inflation et la perfusion des poumons. Dans les cas où la morphométrie histologique exacte est la principale lecture, les poumons doit être gonflé par la trachée, et perfusion doit être effectuée par l'intermédiaire de l'artère pulmonaire, le tout sous pression normalisée.

Dans le protocole indiqué, le cœur est disséqué afin de fournir l'indice de Fulton en tant que mesure de l'hypertrophie cardiaque droite (poids du ventricule droit / poids du ventricule gauche et du septum). En outre, de nouvelles méthodes sont en cours de développement qui sont basées sur une évaluation histologique du cœur droit. Nouvelles mesures histologiques de l'hypertrophie cardiaque droite sont: a) le nombre de noyaux dans une zone définie du coeur droit choisi au hasard, et b) chefs d'accusation de navires, et l'indice de fibrose par région du coeur.

Dans notre laboratoire, la reprise correcte du poumon ganglions lymphatiques médiastinaux et trachéo-bronchique (figure 5) est régulièrement vérifiée par cytométrie en flux, car ces tissus sont très faibles chez les souris témoins. Toutefois, selon le microbiome dans le centre d'hébergement et de l'âge des animaux, de la taille des ganglions lymphatiques dans unchallenged, les souris témoins peuvent être suffisamment grandes pour que la confirmation visuelle. Lors de la vérification par cytométrie en flux, les cellules ganglionnaires doivent être distingués des thymocytes. Par un accident, le thymus peut être facilement échantillonné avec le ganglion lymphatique car le thymus, des ganglions lymphatiques sont situés à proximité les uns aux autres et sont contenus à l'intérieur de la cage thoracique. La différence est que le thymus est situé à proximité du sternum et les ganglions lymphatiques à proximité de la colonne vertébrale. En outre difficile, c'est que le thymus est très grand, contenant de nombreuses cellules plus petites les ganglions lymphatiques. Thymocytes peuvent facilement être distinguées des cellules ganglionnaires en utilisant la cytométrie en flux et CD3, CD4, CD8 et marqueurs. Les ganglions lymphatiques ont typiquement cellules CD3 +, dont la majorité sont soit positifs pour CD4 ou CD8. En revanche, la majorité des thymocytes sont positifs pour les trois marqueurs (CD3 +, CD4 +, CD8 +). De plus en profondeur l'information sur la localisation des ganglions lymphatiques de souris peuvent être trouvées dans le manuscritvan den Broeck et al. 21.

Synchronisme de chaque étape de la procédure principale (cathétérisme cardiaque, récupération du sang et de la rate, la récolte de la BAL, des poumons et des tissus cardiaques) est essentielle pour la production de données permettant une comparaison solide entre les groupes de traitement. Par conséquent, il est recommandé qu'au moins deux, et trois meilleurs, chercheurs collaborent pour réaliser l'expérience. En outre, il est essentiel que les enquêteurs effectuer la procédure sans la connaissance de l'identité du groupe des animaux. Par conséquent, l'identification des données doit être effectuée d'une manière qui obscurcit l'identité de groupe. Enfin, il est également important que l'ordre dans lequel les animaux sont analysés est aléatoire. Par exemple, un simple identifiant correspond à la date de l'expérience et de la numérotation consécutive des animaux. S'il ya par exemple 4 groupes d'animaux (AD), assigner l'identification et l'étude des animaux dans l'ordre suivant: date_1: Aa, date_2: Ba, date_3: Ca, date_4: Da, date_5: Ab, date_6: Sib, date_7: Cb, et ainsi de suite.

Ce flux expérimental permet une analyse approfondie, l'étude simultanée des mécanismes moléculaires qui contrôlent l'inflammation pulmonaire et la fonction cardiaque droite. Les données simultanées et la collecte de l'échantillon permet d'obtenir un meilleur aperçu des réseaux moléculaires et une réduction du nombre d'animaux nécessaires pour obtenir roman connaissances biologiques.

Type de tube / bécher Solution (volume) Utilisation
Traitement du sang
Eppendorf de 1,5 ml Sang pour le sérum
EDTA 2,0 ml couché Sang pour le plasma
Eppendorf de 0,5 ml Gel sérum ou le plasma Traitement des BAL
Polypropylène, fond rond, 4,5 ml Recueillir lavage broncho-alvéolaire
Polypropylène, fond rond, 4,5 ml Congelez BAL surnageant
Plaque de 96 puits, à jupe Cellules BAL
Traitement du tissu
Polypropylène, 50 ml Le formaldéhyde, 7,5 ml Fixer le tissu pulmonaire
Eppendorf de 1,5 ml Enclenchez lobe pulmonaire gel
Eppendorf de 1,5 ml Enclenchez cœur gel droit
Eppendorf de 1,5 ml Enclenchez cœur gel gauche
Plaque de 24 puits Tampon de Hanks, 0,5-1 ml Quick-stockage des lobes pulmonaires pour plus tard, jesolation de cellules uniques
Plaque de 24 puits Tampon de Hanks, 0,5-1 ml Stockage rapide de la rate pour l'isolation ultérieure de cellules individuelles
Plaque de 24 puits Tampon de Hanks, 0,5-1 ml Stockage rapide des ganglions lymphatiques pour l'isolation ultérieure de cellules individuelles
Pour les procédures
Bécher en verre de 300 ml L'eau autoclavée Hydrater et nettoyer cathéter
Tube en polypropylène, 50 ml Tampon de Hanks, 50 ml Effectuer BAL
Tube en polypropylène, 50 ml Tampon de Hanks, 50 ml Laver canule trachéale
Tube en polypropylène, 50 ml Solution désinfectante Nettoyage des instruments
Tube en polypropylène, 50 ml Éthanol à 70% Clinstruments eaning
Tube en polypropylène, 50 ml L'eau du robinet Nettoyage des instruments

Tableau 1. Préparation et organisation des tubes et des solutions.

Instrument Description Utiliser
Ciseaux extrémités arrondies ou droites 5,5 pouces, rond ou pointu Zone A
Ciseaux arrondi 4,0 pouces, des extrémités pointues
Forceps 4,5 pouces, courbé, avec plats, à extrémités saisie
Forceps 4,0 pouces, courbé, avec plats, à extrémités saisie
Ciseaux Slim Blades/Angled- 9 cm Zone B
Micro-ciseaux Vannas Ciseaux Printemps - 2 mm Lames
Forceps pince (Dumon n ° 5-arts)
Forceps 4,0 pouces, courbé, avec plats, à extrémités saisie
Forceps 4,0 pouces, droite, avec plat, extrémités de préhension
Suturer Suture tressée en soie 6-0
Cathéter Cathéter de pression
Ciseaux extrémités arrondies ou droites 5,5 pouces, rond ou pointu Zone C
Ciseaux arrondi 4,0 pouces, des extrémités pointues
Forceps 4,5 pouces, courbé, avec plats, à extrémités saisie
Forceps 4,0 pouces, courbé, avec plats, à extrémités saisie
Canule Canule trachéale
Suturer Suture en soie tressée4-0

Tableau 2. Organisation d'instruments, sutures, cathéter, une canule trachéale.

Figure 1
Figure 1. Schéma de principe des zones de travail-. A) travail-zone A pour l'enregistrement, de pesage, de collecte de sang et le tissu splénique et temporaire de maintien d'espace pour les animaux. B) Le travail de la zone B pour cathétérisme cardiaque droit. C) Les travaux de la zone C pour la récolte de la BAL, les poumons, les ganglions lymphatiques du poumon et les tissus cardiaques.

Figure 2
. Instruments. Figure 2 utilisés pour la procédure A) Instruments pour l'aire de travail a, b) les instruments de cathétérisme cardiaque droit (aire de travail B), C) instruments pour l'aire de travail C. D) canules trachéales. La règle indique la taille des instruments.

Figure 3
Figure 3. Cathéter cardiaque droite. Cathéter cardiaque droite illustré avec des marques et de bande (A), ou tenu à la main (B). Les points de crayon pour les marques faites sur le cathéter (A). L'insertion du cathéter (CE): le nettoyage de la veine jugulaire droite (C); veine suturée tenue avec une pince, un cathéter est avancé vers un trou déjà fait dans la veine (D); cathéter après l'insertion dans la veine (E). Les flèches indiquent le cathéter (D, E).

Figure 4 "/ Files/ftp_upload/50023/50023fig1highres.jpg" />
Figure 4. Exemple de trace des changements de pression dans le cœur droit. Les traces montrent les variations de pression (mmHg) au fil du temps (min: sec), le logiciel affiche chacune des courbes à deux vitesses différentes. Les traces d'une souris témoin (A), et une souris avec une inflammation induite remodelage artériel pulmonaire et l'hypertension (B) sont affichés. Courbes utilisées pour la mesure de la pression systolique ventriculaire droite sont mises en évidence. Notez les plateaux de pression clair dans les courbes en surbrillance. La flèche indique une courbe qui a un pic indiquant une erreur technique. Ces types de courbes pointues ne peut pas être utilisé pour la mesure des pressions systoliques ventriculaires droite. Cliquez ici pour agrandir la figure .

0023fig5.jpg "alt =" Figure 5 "/>
Figure 5. Localisation d'un ganglion lymphatique médiastinal / trachéo-bronchique par rapport à la cage thoracique et la colonne vertébrale. La flèche pointe vers le ganglion lymphatique.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Le flux expérimentale décrite ici permet une mesure rapide et simultanée de la pression systolique ventriculaire droite et la récolte d'échantillons pour l'analyse des réponses dans les poumons, le cœur et le système immunitaire chez la souris. La procédure combine des mesures de la physiologie cardiaque, micro-dissection des tissus et la récolte ultérieure pour les études de cellules vivantes, l'analyse histologique ou omiques-analyse des tissus. La procédure complète prend moins de 20 minutes par souris. Parce que du workflow aire de travail organisé, 2-3 animaux peuvent être étudiés simultanément. Par conséquent, la procédure est bien adaptée pour les petites expériences ciblées 12 et écrans de grande envergure réalisées dans un large éventail de paramètres, à partir d'un petit laboratoire d'une vaste étude pharmaceutique.

La combinaison de mesures physiologie cardiaque et la récolte des tissus ouvre la possibilité d'effectuer une analyse visant à détecter les réseaux biologiques qui contrôlent ou synchroniser cœur, des poumons d'une la fonction immunitaire, utilisant transgéniques et KO ressources souris. Un avantage important de la circulation simultanée procédure est la réduction du nombre d'animaux requis par l'étude. Une autre application de ce workflow procédural est la possibilité d'étudier d'autres organes ou supplémentaires provenant du même animal au besoin.

La procédure décrite ici génère bonnes données de pression cardiaque très rapidement, dans un délai de 5-10 min induction de l'anesthésie. Cela permet d'étudier les animaux, tout en elle respire l'air ambiant spontanément. Une limitation de cette approche est qu'elle est invasive: les animaux sont anesthésiés, ils sont placés sur le dos, et un cathéter est passé par la veine jugulaire à travers l'oreillette dans le ventricule droit. La limitation est aussi l'avantage de cette procédure, car les données représentent les mesures directes des variations de pression au cours du temps dans le ventricule droit. D'autres améliorations techniques, notamment en s'appuyant sur la miniaturisation de la prcathéters Essure, peut permettre de placer permanents, cathéters à demeure chez la souris qui permettent l'enregistrement direct de la pression artérielle pulmonaire au cours du temps de plusieurs semaines, comme cela se exécutées dans les rats 22-24 et autres grands animaux. Si l'insertion d'un cathéter cardiaque à travers la veine jugulaire de fermer le torse, les animaux respirent spontanément n'est pas possible, un autre enregistrement de changements de pression systolique ventriculaire droite peut être faite sur des animaux ventilés par l'ouverture du thorax et de placer le cathéter de pression à travers un incision directement dans le ventricule droit 25. Mesures non invasives de la fonction cardiaque droite peut être fait en utilisant l'échocardiographie. Cette procédure peut être effectuée soit avant cathétérisme cardiaque droit, ou de souris peuvent être examinés par échocardiographie pour plusieurs fois pour étudier la progression de la maladie avant les mesures invasives 5,14-17.

Une autre application de cette procédure est d'obtenir additional données. A titre d'exemple, en utilisant un cathéter qui permet de mesurer les flux et de pression, débit cardiaque droite peut être enregistré simultanément avec les changements de pression à droite du coeur. La procédure décrite ici peut également être utilisé pour mieux comprendre les changements physiologiques, cellulaires et moléculaires qui sont des déclencheurs de l'hypertension artérielle pulmonaire autre que la réponse immunitaire, par exemple, des mutations génétiques, l'exposition 8,10 fumée de cigarette 26, ou des infections microbiennes 27-29 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par le National Institutes of Health 1R21HL092370-01 (GG), 1R01 HL095764-01 (GG); R01HL082694 (JW); American Heart Association, affiliée Fondateurs (0855943D, GG); Stony Wold - Herbert Fonds, New York (SHP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
2-Methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463
2,2,2-Tribrom–thanol Sigma-Aldrich T48402
disinfectant soap (Coverage Spray TB plus Steris) Fisher Scientific 1629-08
Ethyl Alcohol, 200 Proof, Absolute, Anhydrous ACS/USP Grade PHARMCO-AAPER 111000200 Dilute to 70 % with distilled water
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F1635-500ML Dilute to a 7-10 % formaldehyde concentration at a PBS concentration of 1x using PBS stock solution and water
Hanks solution, no calcium, magnesium Fisher Scientific 21-022-CV
O.C.T Tissue-Tek 4583
Penicillin (10,000 U/ml) / Streptomycin (10,000 mg/ml) solution Thermo Scientific SV30010
Phosphate buffered saline (PBS), no calcium, no magnesium, 1x and 10x solutions Fisher Scientific
Sodium pentobarbital 26% Fort Dodge Animal Health NDC 0856-0471-01
Labware
Plates 12, 24, 96 well Falcon
Transfer Pipet Fisher Scientific 13-711-9BM
Tube, EDTA coated Sarstedt 2013-08
Tubes 0.65 ml and 1.7 ml micro-centrifuge VWR
Tubes 12 x 75 mm polypropylene Fisher Scientific 14-956-1D
Tubes, various sizes, polypropylene Fisher Scientific
Instruments
Forceps, Dumon #5 Fine Fine Science Tools 11254-20
Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips curved Fine Science Tools 11152-10
Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips straight Fine Science Tools 11150-10
Cannula 18 ga, 19 ga BD Precision Glide Needles Cut to optimal length, blunted and outside rasped to create a rough outside surface.
Scissors, Dissector scissors-slim blades 9 cm Fine Science Tools 14081-09
Suture for BAL, braided silk suture, 4-0 Fine Science Tools SP116
Suture for right heart catheterization, braided silk suture, 6-0 Teleflex medical 18020-60
Syringe, 1 ml BD 309659
Equipment
Amplifier, PowerLab 4/30 ADInstrument Model ML866
Catheter, pressure F1.4 Millar Instruments, Inc 840-6719
Dissecting Microscope Variscope
Forceps, Vannas spring scissors-2 mm blades Fine Science Tools 15000-00
Halogen Illuminated Desk Magnifier Fisher Scientific 11-990-56
Laptop computer Asus Model number A52F i5 processor; 15 inch
Light Source Amscope HL-250-A
Pressure Control Unit Millar Instruments, Inc PCU-2000
Software, Labchart-Pro V.7 AD Instruments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Price, L. C., et al. Inflammation in pulmonary arterial hypertension. Chest. 141, 210-221 (2012).
  2. Olschewski, H., et al. Cellular pathophysiology and therapy of pulmonary hypertension. J. Lab. Clin. Med. 138, 367-377 (2001).
  3. Hassoun, P. M., et al. Inflammation, growth factors, and pulmonary vascular remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 54, S10-S19 (2009).
  4. Rabinovitch, M. Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension. J. Clin. Invest. 118, 2372-2379 (2008).
  5. Steudel, W., et al. Sustained pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy after chronic hypoxia in mice with congenital deficiency of nitric oxide synthase 3. J. Clin. Invest. 101, 2468-2477 (1998).
  6. Zaidi, S. H., You, X. M., Ciura, S., Husain, M., Rabinovitch, M. Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension. Circulation. 105, 516-521 (2002).
  7. Guignabert, C., et al. Tie2-mediated loss of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in mice causes PDGF receptor-beta-dependent pulmonary arterial muscularization. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 297, L1082-L1090 (2009).
  8. West, J., et al. Pulmonary hypertension in transgenic mice expressing a dominant-negative BMPRII gene in smooth muscle. Circ. Res. 94, 1109-1114 (2004).
  9. Cook, S., et al. Increased eNO and pulmonary iNOS expression in eNOS null mice. Eur. Respir. J. 21, 770-773 (2003).
  10. West, J., et al. Mice expressing BMPR2R899X transgene in smooth muscle develop pulmonary vascular lesions. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L744-L755 (2008).
  11. Tu, L., et al. Autocrine fibroblast growth factor-2 signaling contributes to altered endothelial phenotype in pulmonary hypertension. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 311-322 (2011).
  12. Daley, E., et al. Pulmonary arterial remodeling induced by a Th2 immune response. J. Exp. Med. 205, 361-372 (2008).
  13. Song, Y., et al. Inflammation, endothelial injury, and persistent pulmonary hypertension in heterozygous BMPR2-mutant mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, 677-690 (2008).
  14. Thibault, H. B., et al. Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension. Circulation. Cardiovascular imaging. 3, 157-163 (2010).
  15. Otto, C., et al. Pulmonary hypertension and right heart failure in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor-deficient mice. Circulation. 110, 3245-3251 (2004).
  16. Burton, V. J., et al. Attenuation of leukocyte recruitment via CXCR1/2 inhibition stops the progression of PAH in mice with genetic ablation of endothelial BMPR-II. Blood. 118, 4750-4758 (2011).
  17. Fujita, M., et al. Pulmonary hypertension in TNF-alpha-overexpressing mice is associated with decreased VEGF gene expression. J. Appl. Physiol. 93, 2162-2170 (2002).
  18. Motley, H. L., Cournand, A., Werko, L., Himmelstein, A., Dresdale, D. The Influence of Short Periods of Induced Acute Anoxia Upon Pulmonary Artery Pressures in Man. Am. J. Physiol. 150, 315-320 (1947).
  19. Liljestrand, G. Regulation of Pulmonary Arterial Blood Pressure. Arch. Intern. Med. 81, 162-172 (1948).
  20. Euler, U. S. V., Liljestrand, G. Observations on the pulmonary arterial blood pressure in the cat. Acta Physiol. Scand. 12, 301-320 (1946).
  21. Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. Journal of immunological. 312, 12-19 (2006).
  22. Rabinovitch, M., et al. Angiotensin II prevents hypoxic pulmonary hypertension and vascular changes in rat. Am. J. Physiol. 254, 500-508 (1988).
  23. Rabinovitch, M., Gamble, W., Nadas, A. S., Miettinen, O. S., Reid, L. Rat pulmonary circulation after chronic hypoxia: hemodynamic and structural features. Am. J. Physiol. 236, 818-827 (1979).
  24. Rabinovitch, M., et al. Changes in pulmonary blood flow affect vascular response to chronic hypoxia in rats. Circ. Res. 52, 432-441 (1983).
  25. Kugathasan, L., et al. The angiopietin-1-Tie2 pathway prevents rather than promotes pulmonary arterial hypertension in transgenic mice. J. Exp. Med. 206, 2221-2234 (2009).
  26. Bearer, C., Emerson, R. K., ORiordan, M. A., Roitman, E., Shackleton, C. Maternal tobacco smoke exposure and persistent pulmonary hypertension of the newborn. Environ. Health Persp. 105-202 (1997).
  27. Graham, B. B., et al. Schistosomiasis-induced experimental pulmonary hypertension: role of interleukin-13 signaling. Am. J. Pathol. 177, 1549-1561 (2010).
  28. Butrous, G., Ghofrani, H. A., Grimminger, F. Pulmonary vascular disease in the developing world. Circulation. 118, 1758-1766 (2008).
  29. Crosby, A., et al. Praziquantel reverses pulmonary hypertension and vascular remodeling in murine schistosomiasis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 184, 467-473 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics