Ventricolo destro di pressione sistolica Misure in combinazione con raccolta di campioni di tessuto polmonare e immunitaria nei topi

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Immunology and Infection

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Summary

Un protocollo specifico e rapido per indagare contemporaneamente la funzione del cuore destro, infiammazione polmonare, e la risposta immunitaria viene descritto come strumento di apprendimento. Video e dati descrivono fisiologia e tecniche di microdissezione organizzata in un approccio di squadra che è adattabile per essere utilizzato per piccole e grandi dimensioni studi.

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Chen, W. C., Park, S. H., Hoffman, C., Philip, C., Robinson, L., West, J., Grunig, G. Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice. J. Vis. Exp. (71), e50023, doi:10.3791/50023 (2013).

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Abstract

La funzione del cuore destro è di pompare sangue attraverso i polmoni, collegando così fisiologia del cuore destro e fisiologia vascolare polmonare. L'infiammazione è un modificatore comune di cuore e funzione polmonare, elaborando infiltrazione cellulare, la produzione di citochine e fattori di crescita, e avviando processi di rimodellamento 1.

Rispetto al ventricolo sinistro, il ventricolo destro è una pompa a bassa pressione che opera in una zona relativamente ristretta di variazioni di pressione. Aumentato la pressione arteriosa polmonare sono associati con un aumento della pressione nel letto vascolare polmonare e ipertensione polmonare 2. L'ipertensione polmonare è spesso associata a malattie polmonari infiammatorie, ad esempio cronica ostruttiva, o malattie autoimmuni 3. Poiché l'ipertensione polmonare conferisce una prognosi negativa per la qualità della vita e la speranza di vita, gran parte della ricerca è orientata verso la comprensione dei meccanismi che might essere gli obiettivi per 4 intervento farmaceutico. La sfida principale per lo sviluppo di strumenti di gestione efficaci per l'ipertensione polmonare rimane la complessità della comprensione simultanea di cambiamenti molecolari e cellulari nel cuore destro, i polmoni e il sistema immunitario.

Qui, presentiamo un workflow procedurale per la misurazione rapida e precisa delle variazioni di pressione nel cuore destro di topi e la raccolta simultanea di campioni dal cuore, polmoni e tessuti immunitarie. Il metodo si basa sulla cateterizzazione diretta del ventricolo destro attraverso la vena giugulare in stretta a torso topi, sviluppato alla fine del 1990 come parametro di misurazione della pressione in arteria polmonare 5-13. La squadra ha organizzato approccio facilita una tecnica molto rapida diritto cateterismo cardiaco. Ciò rende possibile effettuare le misure in topi che spontaneamente respirano aria ambiente. L'organizzazione del flusso di lavoro in distinte aree di lavoro-riduce il tempo di ritardo e si apre la possibilità di eseguire contemporaneamente esperimenti di fisiologia e di raccolta dei tessuti immunitario, cardiache e polmonari.

Il flusso di lavoro procedurale qui descritto può essere adattato per una vasta gamma di ambienti di laboratorio e disegni di studio, da piccoli, esperienze mirate, di grandi saggi di screening di stupefacenti. L'acquisizione contemporanea dei dati di fisiologia cardiaca che può essere ampliato per includere l'ecocardiografia 5,14-17 e la raccolta dei tessuti del cuore, del polmone e del sistema immunitario riduce il numero di animali necessari per ottenere i dati che si muovono la base delle conoscenze scientifiche in avanti. Il flusso di lavoro procedurale qui presentato fornisce anche una base ideale per la conoscenza delle reti che collegano immunitario, polmoni e la funzione del cuore. Gli stessi principi descritti qui possono essere adattati per studiare altri organi o aggiuntiva come richiesto.

Protocol

1. Preparazione

  1. Preparare le seguenti soluzioni e tubi (Tabella 1) come segue:
    1. Hanks soluzione, no, magnesio calcio o indicatore con penicillina (100 U / ml) / streptomicina (100 mg / ml).
    2. Tampone fosfato salino (PBS), 1x, no calcio, magnesio no.
    3. Etanolo, 70%, 500 ml fare.
    4. Tamponata di formaldeide, il 7-10% con PBS, fare 500 ml.
    5. Anestesia soluzioni:
      1. Avertin. Cautela aggiungere 5 ml di 2-metil-2-butanolo a 5 g di 2,2,2-Tribromoethanol. Una volta sciolto, tenere soluzione madre a temperatura ambiente al buio. Prendete 0,25 ml di soluzione madre e diluire con 10 ml di 1xPBS in bottiglia di vetro inferiore. Avvolgere la bottiglia con foglio di alluminio, posto a 37 ° C fino a completa dissoluzione e poi aliquotare in tubi di polipropilene da 5 ml e conservare in frigorifero. Scaldare uno aliquota la mattina dell'esperimento.
      2. Barbiturici. Diluire soluzione madre con PBS per ottenere 2,6% barbiturici solution. Posizionare aliquote 3-4 ml in tubi di polipropilene.
  2. Organizzare il lavoro tre-aree (Figura 1).
    1. Area A: Disporre i seguenti elementi: la forma di studio per registrare il numero di identificazione di studio, la data, il peso corporeo, i pesi del cuore destro, cuore sinistro e del setto, bilancia di precisione (0-50 g a 0,01 g di precisione) per determinare il peso corporeo; scala micro per determinare i pesi del cuore a 0,001 g di precisione, pesa imbarcazioni; soluzioni anestesia (chiaramente); dewar piccola con azoto liquido, contenitore isolato sotto ghiaccio, tubi e piastra a 24 pozzetti per la raccolta di sangue e campioni di tessuto (Tabella 1), strumenti chirurgici ( Tabella 2, Figura 2), e soluzioni per pulire gli strumenti (Tabella 1).
    2. Area B: Disporre i seguenti elementi: microscopio da dissezione; catetere cuore destro collegato a un'unità di controllo della pressione che è collegato ad un amplificatore e computer portatile. Il catetere viene inserito inun becker contenente acqua. Disporre di strumenti chirurgici (Tabella 2), pezzi di taglio di sutura per lunghezza ottimale e inseriti in una pesa barca; nastro (nastro autoclave è ottimale), tagliati in lunghezza ottimale e larghezza e allineati sul banco microscopio o di laboratorio per un facile accesso, tamponi di cotone e Depilatore soluzione. Calibrare il catetere all'inizio dello studio.
    3. Area C: Disporre le seguenti voci: lente d'ingrandimento lente, cannula tracheale, siringhe da 1 ml, con taglio di sutura per lunghezza ottimale e inserito in un peso barca, piccolo dewar con azoto liquido, contenitore isolato sotto ghiaccio, tubi e 24 pozzetti per la raccolta BAL e campioni di tessuto (Tabella 1), strumenti chirurgici (Tabella 2), soluzioni per eseguire BAL e per la pulizia della cannula tracheale e gli strumenti (Tabella 1).

2. Cateterismo cardiaco destro

  1. Pesare mouse utilizzando una bilancia di precisione con un leggero posizionando il mouse in una pesata bavena. Assicurati di gestire l'animale delicato e silenzioso. Registrare il peso. Il protocollo descritto funziona meglio per topi che sono 20 go più perché il diametro della vena giugulare deve accogliere il catetere di pressione, è possibile cateterizzare piccoli topi (17 g o più) purché la vena è abbastanza grande.
  2. Anestetizzare il mouse per iniezione con Avertin a seconda del peso corporeo (10 microlitri / g), ad esempio per dare 20 g 200 pl, per dare 25 g 250 microlitri, per dare 30 g 300 ul. Il volume di iniezione esatta deve essere regolato a seconda del ceppo di topo. Assicurati di gestire l'animale delicato e silenzioso perché lo stress può alterare la risposta al anestetico.
  3. Una volta che il mouse è sedato, posto su due pieghe carta velina. Prendere nota del numero ID sulla carta. Strofinare delicatamente la rimozione lozione per capelli nella parte ventrale del collo per cancellare il campo operatorio. Posizionare il mouse avanti sulla carta e attendere per 1-2 min.
  4. Eliminare i peli sotto l'aspetto ventraledel collo accarezzando delicatamente i capelli contro la direzione della crescita dei capelli con tamponi di cotone.
  5. Attentamente determinare la profondità sufficiente di anestesia controllando l'assenza del riflesso punta: il mouse non reagisce pizzicamento delle sue dita.
  6. Di lavoro in modo rapido e rilassato, il resto del cateterismo cardiaco destro non dovrebbe richiedere più di 10 minuti, in modo ottimale 3-6 min. È importante che il tessuto non si asciuga, perché il catetere deve scivolare nella vena e muoversi all'interno della vena su un livello di umidità. Temporizzazione consistente della procedura è importante per la generazione di dati comparabili fra i gruppi.
  7. Mouse avanti Posto su carta velina e il trasferimento con la carta velina sul polistirolo bordo. Fissare le zampe e la testa in posizione con del nastro autoclave.
  8. Fare un'incisione della pelle da mandibole allo sterno (sterno).
  9. Sezionare con cura verso l'alto della tiroide grandi verso le mandibole per esporre la vena giugulare destra unnd trachea.
  10. Luogo polistirolo bordo tenendo premuto il mouse sotto il microscopio dissezione con il piano di messa a fuoco già in atto e l'obiettivo a circa 0,8 x ingrandimento (ingrandimento totale [x lente oculare] è di circa 8x.
  11. Attenzione microdissect la vena giugulare destra rimuovendo circostante tessuto connettivo con una pinza chirurgica.
  12. Posto due pezzi di sutura sopra la vena giugulare destra. Legare la sutura più vicina alle mandibole per chiudere il flusso di sangue nella vena di un filo piccolo, posizionare la sutura che è più vicino allo sterno / sterno in un nodo allentato attorno alla vena. Si può utilizzare il filo 'di sangue per trovare poi il foro nella vena, ciò dovesse rendersi necessario.
  13. Respirare e rilassarsi (sciogliere i muscoli del collo e della mascella) di tenere gli occhi sulla vena attraverso l'oculare. Questo farà sì che le mani e le dita si muovono in modo sicuro, senza intoppi e rilassata. Tenendo la vena con pinza sul lato più vicinole mandibole, un foro nella vena tra le due suture utilizzando micro-forbici operati da dall'altro. Metti giù le micro-forbici, e mantenendo quel rilassato mano, sentire per il catetere. Recuperare il catetere delicatamente tenendolo tra il pollice e l'indice (Figura 3). Inserire il catetere nel foro della vena.
  14. Delicatamente avanzare il catetere nel cuore destro (Figura 3). Osservare i segni al catetere che danno un indice approssimativo di quanto il catetere deve essere inserito e osservare il monitor. Una volta che le curve di pressione vengono visualizzati, serrare leggermente la sutura inferiore intorno al catetere. Poiché il catetere presenta resistenza alla trazione che dà una bobina, e perché il battito cardiaco e la respirazione del mouse aggiungere movimento, inoltre apporre il catetere con nastro.
  15. Misurazioni della pressione record per 2 minuti per una successiva analisi (Figura 4).
  16. Aprire la sutura tenendo il catetere, poi delicatamente Retrieve catetere. Pulire la parte dietro il trasduttore di pressione, posizionare nuovamente dentro il bicchiere con acqua. Non toccare il trasduttore di pressione.
  17. Trasferire il mouse sopra la carta velina per area A per l'eutanasia, la raccolta di sangue e di tessuto milza. Pulire gli strumenti chirurgici.
  18. Avviare la procedura con l'animale successivo. Quando la temporizzazione permette, iniettare l'anestetico in attesa di registrare la curva di pressione (2,15).

3. Raccolta di campioni di sangue e Milza

  1. Iniettare la soluzione barbiturici, 400 microlitri per topo e attendere 1-2 min. Questa viene eseguita di routine nel nostro laboratorio per evitare la possibilità che i topi inavvertitamente recuperare da Avertin-anestesia, mentre dissanguamento. Normalizzazione appropriata dell'esperimento è ottenuta iniettando la stessa dose di soluzione barbiturico per topo, e attendendo la stessa quantità di tempo prima della raccolta del sangue. Se consentito dal Animal Care istituzionale e uso Comitato epurché gli animali sono attentamente monitorati per la profondità di anestesia prima dissanguamento, questo passaggio può essere omesso.
  2. Fai incisione nell'addome. Aprire la vena caudale (vena cava) e raccogliere il sangue con una pipetta di trasferimento.
  3. Rimuovere la milza, o un pezzo di milza nel tubo Eppendorf e congelare a scatto in azoto liquido, o nella piastra a 24 pozzetti in un tampone contenente ben Hanks per la preparazione successiva delle singole cellule.
  4. Trasferire il mouse sopra la carta velina per area di lavoro C per la raccolta di BAL, linfonodo drenante polmone, polmone, e tessuti cardiaci. Pulire gli strumenti chirurgici.

4. Raccolta di polmone e Campioni Cuore

  1. Staccare il libero trachea del muscolo e del tessuto connettivo. Pinza messa sotto la trachea, tirare sutura attraverso. Delicatamente generare tratto sufficiente per tagliare un buco. Mantenere il tratto gentile, inserire la cannula tracheale con un movimento un po 'di svolta, e sutura cannula into posto. Per l'inserimento della cannula tracheale, assicurarsi che la trachea è umido, eventualmente aggiungere una goccia di soluzione di Hanks. Nel corso della procedura, respirare, rilassare collo e muscoli della mascella, per mantenere i movimenti della mano sicura e agevole.
  2. Dissect aprire la gabbia toracica con attenzione rimuovendo lo sterno a partire dalla fine addominale. Non disturbare il contenuto del torace, perché questo rende molto difficile trovare il linfonodo.
  3. Eseguire lavaggio broncoalveolare (BAL) delicatamente inserendo 1 ml di tampone Hanks, ruotare leggermente la siringa e recuperare BAL. Ripetere 3 volte, tubo stretto e posto sul ghiaccio. Durante tutta la procedura, tenere gli occhi sulla estremità della cannula tracheale che collega alla siringa. Uno sguardo al torace per osservare l'inflazione e la deflazione dei polmoni.
  4. Harvest linfonodi polmonari tenendo gabbia toracica parete con un set di pinze, trovare e recuperare il linfonodo con un altro pinza. Luogo linfonodo in 24 pozzetti. È importante kora dove cercare: partendo dal collo, trovare l'entrata della gabbia toracica dal lato destro del mouse e guardare sopra la colonna vertebrale (Figura 5).
  5. Harvest cuore e il luogo su carta velina. Isolare il cuore destro con attenzione dissezione lungo il setto. Trasferimento a lavoro-area A pesare, registrare il peso e il luogo in provette eppendorf a scatto congelamento in azoto liquido.
  6. Posizionare sutura intorno al lobo polmonare sinistro per chiudere il bronco principale. Staccare il polmone sinistro lobo libero, posto nel tubo eppendorf e congelare in azoto liquido a scatto, o il luogo in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenenti soluzione di Hanks per l'isolamento successivo di sospensioni di cellule singole.
  7. Inserisci ca. 0,5 ml di soluzione tamponata di formaldeide attraverso la cannula tracheale nei lobi polmonari rimanenti. Dopo l'inflazione, sezionare i lobi polmonari fuori del torace e del luogo in tubo da 50 ml contenente una soluzione di formaldeide. Per un progetto di studio alternativo, i polmoni possono essere gonfiati con ottiMal di taglio dei media (OCT, diluito 1:4 con PBS) e congelato in uno stampo contenente ottobre non diluiti per la preparazione successiva di sezioni congelate. Un altro disegno dello studio potrebbe richiedere di ottenere tessuto polmonare congelato a scatto e sospensioni di cellule singole dai polmoni. In tal caso, non è necessario inflazione: sezionare i lobi polmonari rimanenti; recuperarli dal torace e posto nella piastra a 24 pozzetti in un tampone contenente ben Hanks.
  8. Rimuovere cannula tracheale, pulita risciacquo con tampone Hanks, pulire strumenti chirurgici.

5. L'analisi delle curve di pressione generate dallo catetere cardiaco destro

I dati relativi alla pressione registrati destro ventricolare vengono analizzati utilizzando LabChart 7 software senza conoscere l'identità di gruppo di ogni registrazione. Più di 20 curve sono selezionati in modo casuale e la differenza tra la massima e la pressione ventricolare minima per ogni curva misurata (AP). Il AP medio è calcolato per ottenere il diritto vpressione sistolica entricular.

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Representative Results

Il risultato primario per ottenere giuste curve di pressione cardiaca si ottiene il corretto posizionamento del catetere cuore destro. La forma delle curve tempo la pressione è fondamentale perché il corretto posizionamento del catetere all'interno del ventricolo destro comporterà altipiani pressione (Figura 4). Spine ricurve, invece, indicano un catetere che viene spostato dal respiro o battito cardiaco movimento contro la parete del ventricolo destro. Per rilevare potenziali problemi con la fase di sopravvivenza degli animali, la deviazione standard del AP, e la frequenza cardiaca deve essere calcolato. Entrambi i valori dovrebbero essere non significativamente diversa tra i gruppi di trattamento. Inoltre, l'aspettativa è che i valori di AP e la frequenza cardiaca non mostrano una deriva in tutto il tempo di registrazione. Ad esempio, aumentando lentamente valori AP indicherebbe vasocostrizione ipossica polmonare 18-20. La diminuzione della frequenza cardiaca si indicate che il livello di anestesia è troppo alto determina la morte dell'animale. Nel nostro laboratorio persone diverse eseguire la procedura. In tutti i gruppi di topi che abitualmente raggiungere tassi di successo del 90-95% per ottenere i dati di pressione ventricolare destra.

Mentre l'apprendimento della procedura, è meglio cominciare con vecchi topi di sesso femminile (25-30 g e più) che hanno una grande vena giugulare e tendono ad avere meno depositi di grasso sottocutaneo di topi maschi. Il modo migliore per determinare il posizionamento del catetere è euthanize l'animale appena il catetere è fissata all'interno della vena. Sezionare l'animale partendo dal cuore di visualizzare direttamente il posizionamento del catetere. Ciò faciliterà notevolmente la risoluzione dei problemi.

Il primo risultato per ottenere BAL è il corretto posizionamento della cannula tracheale. Questo è indicato dal l'inflazione dei polmoni quando Hanks buffer viene instillato, e la deflazione dei polmoni quando la pelle di bufaloer è rimosso. Il recupero è previsto il 70-80% del volume da infondere in animali di controllo, meno (fino al 50%) in animali che hanno infiammazione polmonare. Schiuma sopra il fluido recuperato BAL indica la presenza di tensioattivo. Contaminazione del sangue del fluido recuperato BAL si verifica sia per la presenza di infiammazione polmonare significativa, o perché instillazione e recupero del fluido di lavaggio era troppo veloce. È da notare che alcune misure di lesioni acute del polmone può essere indotta dalla procedura BAL. Se il disegno sperimentale è quello di capire questi parametri lesioni acute e esame delle BAL è anche importante, quindi un lobo del polmone deve essere collegato e rimosso prima di effettuare BAL.

Nella procedura illustrata, raccogliamo tessuti polmonari per istologia senza inflazione standardizzato e perfusione dei polmoni. Nei casi in cui esatto morphometry istologico è il principale lettura, i polmoni dovrebbero essere gonfiati attraverso la trachea, e perfusion deve essere effettuata attraverso l'arteria polmonare, il tutto sotto la pressione standard.

Nel protocollo mostrato, il cuore è sezionato per fornire l'indice Fulton come misura di ipertrofia cardiaca destra (peso del ventricolo destro / peso del ventricolo sinistro e del setto). Inoltre, nuovi metodi sono stati sviluppati che si basano sulla valutazione istologica del cuore destro. Emergenti misure istologici di ipertrofia cardiaca destra sono: a) il numero di nuclei all'interno di una zona definita di scelta a caso del cuore destro, e b) i conteggi delle navi, e l'indice fibrotico per area di cuore.

Nel nostro laboratorio, il corretto recupero dei polmoni drenaggio linfonodi mediastinici e tracheobronchiale (Figura 5) è abitualmente verificata mediante citometria di flusso perché questi tessuti sono molto piccole in topi di controllo. Tuttavia, a seconda della microbiome nella struttura abitativa e l'età degli animali, la dimensione dei linfonodi unchallenGED, i topi di controllo possono essere sufficientemente grande per solo conferma visiva. Quando si verifica mediante citometria di flusso, le cellule dei linfonodi devono essere distinti da timociti. Per caso, il timo può facilmente essere campionati con il linfonodo perché il timo e linfonodi sono situati vicino all'altro e sono contenute all'interno della gabbia toracica. La differenza è che il timo è situato vicino alla sterno e il linfonodo vicino alla colonna vertebrale. Ulteriore sfida è che il timo è molto grande, che contiene molte cellule più linfonodi di piccole dimensioni. Timociti possono essere facilmente distinte dalle cellule dei linfonodi mediante citometria di flusso e CD3, CD4, CD8 e marcatori. Linfonodi hanno caratteristicamente cellule CD3 +, la maggioranza dei quali sono o positivi per CD4 o CD8. In contrasto, la maggior parte dei timociti sono positivi per tutti e tre i marcatori (CD3 +, CD4 +, CD8 +). Per ulteriori informazioni approfondite sulla localizzazione dei linfonodi del mouse possono essere trovate nel manoscritto divan den Broeck et al. 21.

Temporizzazione consistente di ogni fase principale procedurale (cateterismo, recupero di sangue e milza, raccolta di BAL, polmone e tessuti cardiaci) è critica per la generazione di dati che permette la comparazione robusto tra i gruppi di trattamento. Pertanto, si raccomanda che almeno due, tre e migliore, investigatori collaborano per realizzare l'esperimento. Inoltre, è fondamentale che gli investigatori eseguire la procedura senza conoscenza dell'identità gruppo degli animali. Pertanto, l'identificazione dei dati deve essere effettuato in modo che oscura l'identità del gruppo. Infine, è anche importante che l'ordine in cui vengono analizzati gli animali è randomizzato. Per esempio, un identificatore semplice è la data dell'esperimento e numerazione consecutiva degli animali. Se ci sono ad esempio 4 gruppi di animali (AD), assegnare l'identificazione e studiare gli animali nel seguente ordine: datE_1: Aa, date_2: Ba, date_3: Ca, date_4: Da, date_5: Ab, date_6: Bb, date_7: Cb, e così via.

Questo flusso sperimentale consente un approfondimento, studio simultaneo dei meccanismi molecolari che controllano l'infiammazione polmonare e funzione cardiaca destra. I dati simultanee e raccolta del campione raggiunge migliori intuizioni reti molecolari, e una riduzione del numero di animali necessari per ottenere romanzo conoscenza biologica.

Tipo di tubo / bicchiere Soluzione (volume) Utilizzo
Elaborazione di sangue
Eppendorf, 1,5 ml Sangue per il siero
EDTA rivestito 2,0 ml Sangue per il plasma
Eppendorf, 0,5 ml Fermo siero o plasma Elaborazione di BAL
Polipropilene, fondo rotondo, 4,5 ml Raccogliere lavaggio broncoalveolare
Polipropilene, fondo rotondo, 4,5 ml Congelare BAL surnatante
Piastra a 96 pozzetti, costeggiava Cellule BAL
Trattamento dei tessuti
Polipropilene, 50 ml La formaldeide, 7,5 ml Fix tessuto polmonare
Eppendorf, 1,5 ml Snap lobo polmonare congelamento
Eppendorf, 1,5 ml Snap cuore destro congelamento
Eppendorf, 1,5 ml Snap cuore sinistro congelamento
24-pozzetti Hanks tampone, 0,5-1 ml Quick-stoccaggio di lobi polmonari per dopo isolation di celle singole
24-pozzetti Hanks tampone, 0,5-1 ml Memorizzazione veloce di milza per l'isolamento di singole cellule in seguito
24-pozzetti Hanks tampone, 0,5-1 ml Memorizzazione rapida dei linfonodi per l'isolamento di singole cellule in seguito
Per le procedure
Bicchiere di vetro, 300 ml Acqua autoclavata Idratante e pulizia del catetere
Polipropilene tubo 50 ml Hanks buffer, 50 ml Eseguire BAL
Polipropilene tubo 50 ml Hanks buffer, 50 ml Lavare cannula tracheale
Polipropilene tubo 50 ml Disinfettante soluzione Pulizia degli strumenti
Polipropilene tubo 50 ml Etanolo 70% Clstrumenti IGNIFICATO
Polipropilene tubo 50 ml L'acqua del rubinetto Pulizia degli strumenti

Tabella 1. Preparazione e organizzazione di tubi e soluzioni.

Strumento Descrizione Utilizzare
Forbici estremità arrotondate o dritto 5,5 pollici, rotondo o taglienti Area A
Forbici arrotondato 4,0 pollici, estremità taglienti
Forcipe 4,5 pollici, piegato, con piatti, estremità di presa
Forcipe 4,0 pollici, piegato, con piatti, estremità di presa
Forbici Slim Blades/Angled- 9 centimetri Area B
Micro-forbici Furgonenas Forbici Primavera - 2 mm Lame
Forcipe pinza (Dumon # 5 arti)
Forcipe 4,0 pollici, piegato, con piatti, estremità di presa
Forcipe 4,0 pollici, diritto, con piano, le estremità di presa
Suturare Intrecciato di seta sutura 6-0
Catetere Pressione catetere
Forbici estremità arrotondate o dritto 5,5 pollici, rotondo o taglienti Area C
Forbici arrotondato 4,0 pollici, estremità taglienti
Forcipe 4,5 pollici, piegato, con piatti, estremità di presa
Forcipe 4,0 pollici, piegato, con piatti, estremità di presa
Cannula Cannula tracheale
Suturare Silk sutura intrecciata4-0

Tabella 2. Organizzazione di strumenti, suture, catetere, cannula tracheale.

Figura 1
Figura 1. Disegno schematico della lavoro-aree. A) di lavoro-area A per la registrazione, la pesatura, la raccolta di tessuto del sangue e della milza e temporaneo vano di contenimento per gli animali. B) Work-zona B per cateterismo cardiaco destro. C) Work-zona C per il raccolto di BAL, polmoni, linfonodi del polmone, e dei tessuti cardiaci.

Figura 2
.. Figura 2 Strumenti utilizzati per la procedura A) Strumenti per il lavoro-zona A, B) strumenti di cateterismo cardiaco destro (lavoro-area B), C) instruments per il lavoro-zona C. D) cannule tracheali. Il righello mostra la dimensione degli strumenti.

Figura 3
Figura 3. Catetere cardiaco destro. Catetere cardiaco destro mostrato con segni e nastro (A), o tenuti a mano (B). I punti matita per i segni fatti sul catetere (A). Inserimento del catetere (CE): pulizia della vena giugulare destra (C); vena suturata tenuto con una pinza, catetere viene fatto avanzare verso un foro precedentemente realizzato in vena (D), dopo l'inserimento del catetere nella vena (E). Le frecce indicano il catetere (D, E).

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Figura 4. Esempio traccia di variazioni di pressione nel cuore destro. Le tracce mostrano variazioni di pressione (mmHg) nel tempo (min: sec), il software visualizza ciascuna delle curve a due velocità diverse. Le tracce di un topo di controllo (A), e un topo con infiammazione indotta rimodellamento polmonare e ipertensione arteriosa (B) sono mostrati. Curve usate per la misurazione della pressione sistolica ventricolare destra sono evidenziate. Nota altipiani chiara pressione nelle curve evidenziate. La freccia indica una curva che ha un picco che indica un errore tecnico. Questi tipi spinosi di curve non possono essere utilizzati per la misurazione della pressione sistolica del ventricolo destro. Clicca qui per ingrandire la figura .

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Figura 5. Posizione di un mediastinica / tracheobronchiale linfonodi rispetto alla gabbia toracica e della colonna vertebrale. La freccia indica il linfonodo.

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Discussion

Il flusso sperimentale qui descritto consente la misurazione rapida e simultanea della pressione sistolica ventricolare destra e la raccolta di campioni per l'analisi delle risposte nel cuore, i polmoni e il sistema immunitario in topi. La procedura combina misure di fisiologia cardiaca, micro-dissezione e la raccolta dei tessuti successivo per studi sulle cellule vive, analisi istologiche, o omiche-analisi dei tessuti. La procedura completa richiede meno di 20 minuti per topo. A causa della zona lavoro organizzato workflow, 2-3 animali possono essere studiati simultaneamente. Pertanto, la procedura è adatto per piccoli esperimenti mirati 12 e schermi di grandi dimensioni eseguite in una vasta gamma di impostazioni, da un piccolo laboratorio di un ampio studio farmaceutica.

La combinazione di misurazioni fisiologia dei tessuti cardiaci e raccolto apre la possibilità di effettuare analisi progettato per rilevare reti biologiche che controllano o sincronizzare cuore, polmone and funzione immunitaria, utilizzando transgenici e KO risorse del mouse. Un importante vantaggio del procedimento flusso simultaneo è la riduzione del numero di animali necessari per studio. Un'altra applicazione di questa workflow procedurale è la possibilità di studiare altri organi o aggiuntivi dallo stesso animale come necessario.

La procedura descritta qui a destra genera i dati di pressione cardiaca molto rapidamente, entro 5-10 minuti di induzione dell'anestesia. Questo rende possibile studiare gli animali mentre sono in aria ambiente spontaneamente. Un limite del metodo è che è invasiva: gli animali sono anestetizzati, essi sono posti sulle loro schiene, e un catetere viene fatto passare attraverso la vena giugulare attraverso l'atrio nel ventricolo destro. La limitazione è anche il vantaggio di questa procedura perché i dati rappresentano misure dirette di variazioni nel tempo della pressione nel ventricolo destro. Ulteriori miglioramenti tecnici, in particolare basandosi su miniaturizzare il prcateteri Essure, può consentire di inserire cateteri permanenti, in topi che consentono la registrazione diretta della pressione arteriosa polmonare tempo su più settimane, come viene effettuato in ratti 22-24 e altri animali più grandi. Se l'inserimento di un cuore-catetere attraverso la vena giugulare in stretta torso, respiro spontaneo animali non è possibile, una registrazione alternativa di variazioni di pressione sistolica ventricolare destro può essere effettuata in animali ventilate aprendo il torace e posizionare il catetere di pressione attraverso un incisione direttamente nel ventricolo destro 25. Non invasivi misure della funzione cardiaca destra può essere effettuata utilizzando l'ecocardiografia. Questa procedura può essere eseguita prima di cateterismo cardiaco destro, o topi possono essere esaminati con l'ecocardiografia per più volte per studiare la progressione della malattia prima delle misurazioni invasive 5,14-17.

Un'altra applicazione di questa procedura è quello di ottenere additional dati. Come esempio, utilizzando un catetere che può misurare portate e pressioni, uscita cuore destro può essere simultaneamente registrato insieme giusti cambiamenti di pressione cardiaca. Il procedimento qui descritto può essere utilizzato anche per meglio comprendere i cambiamenti fisiologici, cellulari e molecolari che rappresentano trigger di ipertensione polmonare diversa risposta immunitaria, per esempio, mutazioni genetiche 8,10, esposizione al fumo di sigaretta 26, o infezioni microbiche 27-29 .

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health 1R21HL092370-01 (GG), 1R01 HL095764-01 (GG); R01HL082694 (JW), American Heart Association, affiliato Founders (0855943D, GG), Stony Wold - Herbert Fund, New York (SHP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
2-Methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463
2,2,2-Tribrom–thanol Sigma-Aldrich T48402
disinfectant soap (Coverage Spray TB plus Steris) Fisher Scientific 1629-08
Ethyl Alcohol, 200 Proof, Absolute, Anhydrous ACS/USP Grade PHARMCO-AAPER 111000200 Dilute to 70 % with distilled water
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F1635-500ML Dilute to a 7-10 % formaldehyde concentration at a PBS concentration of 1x using PBS stock solution and water
Hanks solution, no calcium, magnesium Fisher Scientific 21-022-CV
O.C.T Tissue-Tek 4583
Penicillin (10,000 U/ml) / Streptomycin (10,000 mg/ml) solution Thermo Scientific SV30010
Phosphate buffered saline (PBS), no calcium, no magnesium, 1x and 10x solutions Fisher Scientific
Sodium pentobarbital 26% Fort Dodge Animal Health NDC 0856-0471-01
Labware
Plates 12, 24, 96 well Falcon
Transfer Pipet Fisher Scientific 13-711-9BM
Tube, EDTA coated Sarstedt 2013-08
Tubes 0.65 ml and 1.7 ml micro-centrifuge VWR
Tubes 12 x 75 mm polypropylene Fisher Scientific 14-956-1D
Tubes, various sizes, polypropylene Fisher Scientific
Instruments
Forceps, Dumon #5 Fine Fine Science Tools 11254-20
Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips curved Fine Science Tools 11152-10
Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips straight Fine Science Tools 11150-10
Cannula 18 ga, 19 ga BD Precision Glide Needles Cut to optimal length, blunted and outside rasped to create a rough outside surface.
Scissors, Dissector scissors-slim blades 9 cm Fine Science Tools 14081-09
Suture for BAL, braided silk suture, 4-0 Fine Science Tools SP116
Suture for right heart catheterization, braided silk suture, 6-0 Teleflex medical 18020-60
Syringe, 1 ml BD 309659
Equipment
Amplifier, PowerLab 4/30 ADInstrument Model ML866
Catheter, pressure F1.4 Millar Instruments, Inc 840-6719
Dissecting Microscope Variscope
Forceps, Vannas spring scissors-2 mm blades Fine Science Tools 15000-00
Halogen Illuminated Desk Magnifier Fisher Scientific 11-990-56
Laptop computer Asus Model number A52F i5 processor; 15 inch
Light Source Amscope HL-250-A
Pressure Control Unit Millar Instruments, Inc PCU-2000
Software, Labchart-Pro V.7 AD Instruments

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References

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