Détection de la palmitoylation des protéines dans les neurones de l'hippocampe en culture par immunoprécipitation et Acyl-biotine Exchange (ABE)

Neuroscience
 

Summary

L'addition réversible aux protéines de palmitate est un régulateur important du trafic intracellulaire des protéines. Ceci est d'un intérêt particulier dans les neurones où de nombreuses protéines synaptiques sont palmitoylées. Nous utilisons une méthode simple biochimique pour détecter les protéines dans les neurones en culture palmitoylées, qui peuvent être adaptés à plusieurs types de cellules et de tissus.

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Brigidi, G. S., Bamji, S. X. Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE). J. Vis. Exp. (72), e50031, doi:10.3791/50031 (2013).

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Abstract

Palmitoylation est une modification post-traductionnelle des lipides comportant la fixation d'un 16-carbone des acides gras saturés, le palmitate, de résidus cystéine de protéines substrat par une liaison labile thioester [commentaire en 1]. Palmitoylation d'une protéine substrat augmente son hydrophobicité, et facilite en général son trafic vers les membranes cellulaires. Des études récentes ont montré palmitoylation d'être l'une des modifications les plus courantes de lipides dans les neurones 1, 2, suggérant que le roulement du palmitate est un mécanisme important par lequel ces cellules régulent le ciblage et le trafic des protéines. L'identification et la détection des substrats palmitoylées peut donc améliorer notre compréhension de la traite des protéines dans les neurones.

La détection de la protéine palmitoylation dans le passé a été techniquement entravé en raison de l'absence d'une séquence consensus parmi les substrats protéiques, et le recours à métabolique labeling de palmitoyl-protéines avec 3 H-palmitate, un dosage biochimique de temps avec une faible sensibilité. Développement de l'Acyl-biotine Exchange (ABE) test permet la détection rapide et une plus grande sensibilité élevée de protéines palmitoylées 2-4, et est optimale pour mesurer le chiffre d'affaires dynamique de palmitate de protéines neuronales. Le test ABE est composé de trois étapes biochimiques (figure 1): 1) le blocus irréversible de non modifiés groupements thiols de cystéine en utilisant la N-ethylmaliemide (NEM), 2) un clivage spécifique et le démasquage du groupe thiol de la cystéine palmitoylée par hydroxylamine (HAM), et 3) le marquage sélectif de la cystéine palmitoylé l'aide d'un réactif de biotinylation thiol-réactive, la biotine-BMCC. La purification des protéines thiol-biotinylées en suivant les étapes de FBA a été différente, en fonction de l'objectif global de l'expérience.

Ici, nous décrivons une méthode pour purifier une protéine d'intérêt dans palmitoylée hippocampe primaireneurones al par une immunoprécipitation initial (IP) étape en utilisant un anticorps dirigé contre la protéine, suivie par le dosage de l'EBA et western blot de mesurer directement les niveaux de palmitoylation de cette protéine, qui est appelé le test IP-ABE. Faible densité des cultures de neurones hippocampiques de rat embryonnaires ont été largement utilisées pour étudier la localisation, la fonction et le trafic des protéines neuronales, ce qui les rend parfaitement adapté pour l'étude des protéines neuronales palmitoylation en utilisant le test IP-ABE. Le test IP-ABE exige essentiellement la norme IP et de l'Ouest réactifs buvard, et n'est limitée que par la disponibilité d'anticorps contre le substrat cible. Ce test peut facilement être adapté pour la purification et la détection des protéines transfectées palmitoylées dans des cultures de cellules hétérologues, cultures primaires de neurones issus de différents tissus du cerveau de la souris et du rat, et les tissus du cerveau, même primaire elle-même.

Protocol

1. Extraction des protéines cibles à partir de culture primaires neurones de l'hippocampe

  1. Avant la récolte protéine endogène à partir des cellules primaires de l'hippocampe, préparer un tampon de lyse (LB; Tableau 1) les inhibiteurs de protéase. A 10 ml de tampon de lyse, ajouter 0,1 ml solution de fluorure phénylméthanesulfonyle (PMSF) à une concentration finale de 10 mM, et 1 comprimé cocktail inhibiteur de la protéase.
  2. Préparer le N-éthylmaléimide (NEM) solution (Tableau 1) de poudre lyophilisée. Dissoudre délicatement dans de l'EtOH à 100% à la température ambiante (RT). Toujours préparer la solution NEM frais pour le jour de l'expérience.
  3. Suivant combiner le tampon de lyse et NEM. Ajouter 0,5 ml de solution 2M NEM à un nouveau tube de 50 ml conique. Ajouter 20 ml de LB sur le dessus, et LB place rapidement NEM + (concentration finale de 50 mM) sur une plate-forme à bascule à 4 ° C pour bien mélanger pendant 5 min. Toujours ajouter la deuxième solution NEM / EtOH premier et LB, afin de bien mélanger les deux.
  4. Retirer des neurones en culture de pépinière et les placer sur la glace *. Retirez délicatement les médias cellulaires, et doucement laver deux fois avec une solution saline tamponnée de phosphate froid (PBS) 1x. Ajouter 300 ml de LB + 50 mM NEM au premier puits de neurones de l'hippocampe et des cellules gratter à l'aide d'un élévateur portable jetable. Recueillir le lysat cellulaire, puis décharger le lysat dans le puits à côté de ce groupe. Racler les cellules dans le deuxième puits en utilisant le dispositif de levage cellule, recueillir, et répétez l'aide d'un troisième puits, si nécessaire de concentrer davantage le lysat.
  5. Recueillir lysat cellulaire dans un pré-refroidi (sur la glace), tube de 1,5 ml. Répétez l'étape 1.4 en utilisant 100 pl de LB + NEM 50 mM de recueillir toute lysat cellulaire restant. Passez lysat cellulaire total à travers une seringue de calibre 26 ½ 5-6 fois pour aider à la lyse mécanique, en faisant attention de ne pas faire des bulles dans la solution. On peut, au lieu sonication pendant 15 secondes sur la glace, si le matériel est disponible. Nutation lysat cellulaire pour ≥ 30 min à 4 ° C.
  6. Clarifier la cellule lysate par centrifugation à 16.000 xg / 30 min, afin de granulés cellules non lysées et les détergents matériau insoluble.
  7. Recueillir effacé lysat cellulaire (surnageant) dans une nouvelle pré-refroidi tube de 1,5 ml sur glace. Répétez protocole de récolte pour tous les groupes de cellules. Mesure la concentration de protéines dans tous les échantillons de lysat en utilisant BCA et normaliser le volume de tous les échantillons de lysat de groupes de cellules d'avoir exactement la même protéine totale, avec un minimum recommandée de 500 mg. Compléter tous les échantillons avec LB + NEM 50 mM à 500 ul volume total.
  8. Ajouter 1-5 ug d'anticorps primaire dirigé contre la protéine cible pour chaque échantillon de lysat. Nutation les échantillons d'anticorps lysat mixtes nuit à 4 ° C.

Neurones hippocampiques primaires de rat * doivent être cultivées à une densité d'environ 250.000 cellules / puits dans un plat à 6 puits, dans un milieu sans sérum contenant un supplément B27 neuronale, comme décrit précédemment 5 et cultivé pour le désirlongueur d de temps, généralement 14-16 jours-in-vitro (DIV) pour atteindre la maturité. Un minimum de 500 ug de protéine totale est recommandé de succès immunoprécipiter et biotinyler une protéine cible neuronale, ce qui nécessite généralement 2-3 puits d'un plat à 6 puits.

2. La précipitation de protéine cible de l'anticorps lié

  1. Avant la précipitation et l'immobilisation d'une protéine cible, préparer une suspension à 50% de protéine A, ou des billes de protéine G sépharose revêtues. Plus précisément, ajouter ≥ 60 ul de billes de sépharose par échantillon pour tubes de 1,5 ml, veiller à ce que tous les échantillons contiennent des quantités égales de perles. Les billes magnétiques sont également appropriés si le matériel est disponible.
  2. Ajouter un volume égal de bouillie à 50% à chaque échantillon d'anticorps lysat, et nutation pour ≥ 1 h à 4 ° C.

3. Acyl-biotine change: Hydroxylamine (HAM) Clivage

  1. En effectuant l'étape 2.2, préparer un certain nombre de tubes avec un tampon de lyse (LB) de dipH fférents. Le pH est très important pour ces étapes et devrait toujours être réglé à l'aide d'un pH-mètre. Préparer 2 ml de LB 7,2 pH par échantillon, et 0,5 ml de tampon rigoureux par échantillon (tableau 1). Également préparer 0,5 ml de LB + 10 mM NEM par échantillon, comme dans les étapes 01.01 à 01.03. Ajouter PMSF et comprimés inhibiteurs de la protéase à tous les tampons de lyse, comme à l'étape 1.1.
    1. Hydroxylamine (HAM) est un agent réducteur puissant, dont le clivage de palmitate de cystéines est nécessaire pour biotinylation (Figure 1), et l'omission du clivage HAM sert de témoin négatif. Diviser chaque échantillon de billes dans deux échantillons, l'un en omettant l'étape de clivage HAM (-HAM), et une étape comprenant la HAM (+ HAM). Pour normaliser la dégradation des protéines provoquée par le traitement HAM, il faut diviser chaque échantillon en trois, avec 1/3 de billes utilisées pour le contrôle de la-HAM, et les 2/3 pour le traitement HAM +.
    2. Préparez 1 supplémentaire.Tubes de 5 ml sur la glace, étiquetés comme contrôle de la HAM-pour chaque échantillon. Suite à l'étape 2.2, doucement centrifuger perles tous les échantillons 'à 0,5 ug / 1 min à 4 ° C (centrifugeuse à cette vitesse, la durée et la température pour toutes les étapes restantes, sauf indication contraire), placer les tubes sur la glace, enlever le surnageant et remettre en suspension les billes dans 600 ul de LB + NEM 10 mM.
  2. Après remise en suspension des échantillons perles »dans un tampon de lyse + NEM 10 mM, immédiatement recueillir 200 pl de lysat de perles de l'échantillon en suspension, et du rejet dans l'échantillon de-HAM tube sur la glace. Ajouter un supplément de 300 pi de LB + NEM 10 mM à l'échantillon de l'HAM-, et un supplément de 100 ul de l'échantillon HAM + pour un total de 500 ul de chaque échantillon. Incuber les tubes pendant 10 min sur la glace.
  3. Remettre en suspension (laver) la-HAM HAM et des échantillons + délicatement avec un tampon strictes 0,5 ml par échantillon. Effectuez cette étape rapidement, comme une incubation plus longue SDS se traduira par la suppression de l'anticorps lié duperles.
  4. Lavez délicatement tous les échantillons à trois reprises dans 0,5 ml / échantillon de 7,2 pH LB, et centrifuger entre les lavages comme dans 3.2b étape.
  5. En effectuant l'étape 3.5, préparer un tampon HAM (tableau 1). Ajouter le volume approprié de solution d'hydroxylamine dans un nouveau tube, pour atteindre une concentration finale de 1M dans un volume de 0,5 ml pH 7,2 LB, par exemple de + HAM. Toujours préparer le tampon HAM frais pour le jour de l'expérience. Ajouter 0,5 ml / échantillon de 7,2 pH LB à tous-HAM échantillons, et 0,5 ml / échantillon de tampon de HAM à tous les échantillons HAM +.
  6. Nutation tous les échantillons pendant 1 heure à température ambiante (RT). Ne pas dépasser 1 heure.

4. Acyl-biotine Bourse: Biotin-CCMB étiquetage

  1. Alors que d'effectuer l'étape 3.6, préparer 2 ml de LB pH 6,2 pour l'échantillon (tableau 1), à l'étape 3.1. Placez le pH de 6,2 LB sur la glace jusqu'à ce que nécessaire. Également préparer une solution mère de biotine-BMCC (tableau 1) immédiatement avant son utilisation. Peser exactly 2,1 mg de biotine-BMCC, recueillir dans un tube de 1,5 ml, et doucement se dissoudre dans 0,5 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) en le plaçant sur une plate-forme à bascule à la température ambiante, pour obtenir une concentration de 8 mm (ne pas utiliser de pipette pour briser la poudre ).
  2. Une fois l'étape 3.6 est terminée, lavez doucement les perles une fois dans un tampon de lyse pH 6,2, pour éliminer le tampon HAM résiduelle. Enlever le surnageant et placer les échantillons sur la glace.
  3. Biotine-BMCC est une molécule de biotine conjugué maliemide qui a une grande affinité pour les groupes thiol libres de cystéines (figure 1). En effectuant l'étape 4.2, préparer 0,5 ml de biotine-BMCC tampon (tableau 1) par échantillon, à une concentration de travail entre 0,5 pm à 5 pm. Des concentrations supérieures à 5 uM probablement saturer la protéine cible 6 et, généralement, ne doit pas être dépassée, mais cela peut varier en fonction de la protéine cible souhaitée. Ajouter 0,5 ml de biotine-BMCC tampon pour chaque échantillon, et nutation pendant exactement 1 heure à 4 ° C. Ne pas dépasser 1 heure.

5. Élution de la protéine cible conjugué à la biotine et SDS-PAGE

  1. Une fois l'étape 4.3 est terminé, lavez doucement tous les échantillons une fois en pH 6,2 LB. Gardez tous les échantillons sur la glace entre les lavages. Retirer tampon d'échantillon SDS 2x sans agents réducteurs (tableau 1) de -20 ° C pour le stockage et lentement fondre la glace.
  2. Lavez délicatement les échantillons à trois reprises dans 7,5 pH LB + PMSF / inhibiteurs, et conserver des échantillons sur la glace entre les lavages.
  3. Retirer le surnageant du troisième lavage, en laissant les perles enrobées dans une pâte avec du tampon restant dans le fond du tube. Trempez une pipette avec une pointe de petit diamètre (une pointe de chargement de gel ou P2 pointe de pipette suffisent) dans le fond même du tube à travers la boue, et recueillir rapidement toute tampon restant, en faisant attention de ne pas prendre toutes les billes.
  4. Compléter le tampon d'échantillon SDS 2x avec DL-dithiothréitol (DTT) pour obtenir une concentration finale de 5 mM. Ajouter40-50 ul de tampon d'échantillon 2x + 5 mM DTT à chaque échantillon. Le cas échéant, les billes de vortex pour mélanger complètement avec le tampon d'échantillons, et immédiatement centrifuger à haute vitesse pour collecter toutes les billes dans une pastille, immergés dans un tampon d'échantillon.
  5. Faire bouillir tous les échantillons pendant 10 min à 75-80 ° C. Laissez refroidir les échantillons à température ambiante pendant ≥ 10 min sur paillasse, et centrifuger à 16000 xg / 3 min à granulés complètement les perles.
  6. Ajouter le volume complet de la protéine éluée (surnageant) de chaque échantillon à une seule voie dans un gel de polyacrylamide approprié pour western blot, SDS-PAGE 7. Organiser les échantillons de telle sorte que le contrôle de l'éluant et-HAM HAM éluant + pour un seul échantillon sont exécutées immédiatement adjacente à une autre au cours de SDS-PAGE (figure 2). Après SDS-PAGE, transfert à un PVDF ou membrane de nitrocellulose.

6. Western Blot et détection de la palmitoylation de la protéine cible

  1. Une fois 5,6 étape est terminée, laver la membranedeux fois dans du tampon Tris salin (TBS 1x) pendant 10 min sur un agitateur oscillant, à température ambiante.
  2. Préparer un tampon de blocage pour bloquer non spécifique d'étiquetage en pesant albumine bovine sérique (BSA), pour atteindre 3% en poids dans un volume de TBS 1x + Tween-20 0,05% (TBS-T) qui est suffisant pour submerger totalement la membrane . Pour streptavidine buvard, toujours bloquer avec de la BSA et non du lait en poudre. Bloquer la membrane pendant 1 heure à température ambiante sur un agitateur oscillant.
  3. Préparer une solution d'anticorps de TBS-T BSA + 0,3%. Ajouter streptavidine-HRP reconstitué à 1 mg / ml dans l'eau distillée, dilué à 1:5,000-1:10,000. Une fois l'étape 6.2 est terminée, laver la membrane une fois dans du TBS-T pendant 10 min, puis incuber la membrane dans une solution d'anticorps streptavidine sur une plate-forme à bascule pour soit pendant 1 heure à température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
  4. Laver la membrane trois fois dans du TBS-T pendant 10 min sur un agitateur oscillant. Afin de détecter le signal palmitoylation, exposer la luminescence HRP en utilisant un chemKit substrat iluminescent.
  5. Afin de normaliser les taux de palmitoylation de la quantité de la protéine d'intérêt qui a été immunoprécipitée, enlever la membrane en utilisant un tampon d'extraction western blot pour 5-10 minutes sur un agitateur oscillant à TA. Répétez les étapes 6,1 à 6,4 à l'aide de l'anticorps primaire dirigé contre la protéine d'intérêt qui a été initialement utilisé pour l'immunoprécipitation.
  6. Quantifier palmitoylation de la protéine d'intérêt en utilisant un logiciel d'analyse d'image, et normaliser les taux de palmitoylation de la quantité de protéine immunoprécipitée.

Representative Results

Le dosage IP-ABE détecte spécifiquement thiol-palmitoylation des résidus cystéine long de protéines de substrat, et peut être utilisé pour détecter la palmitoylation des protéines neuronales immunoprécipitées d'une manière représentée sur la figure 1. Traitement de la protéine immunoprécipitée avec neuronale HAM (figure 1) clive la liaison thioester entre le palmitate et le groupe thiol de la cystéine, ce qui permet l'incorporation spécifique de la biotine-BMCC sur le nouveau groupe thiol disponible, qui peut être ensuite détecté à l'aide Western blot. L'omission de la HAM (moins-HAM) clivage empêche l'incorporation de biotine-BMCC et fonctionne comme un contrôle négatif pour spécifique de la palmitoyl-biotinylation de l'échantillon plus-HAM, et doit donc toujours être exécuté à côté de l'échantillon plus-HAM pour l'Ouest buvard par SDS-PAGE (figure 2).

Dans une expérience optimisée (Figure 2A), la palmitoylationsignal de la protéine neuronale δ-caténine 2 peut être facilement détecté par transfert de biotine-BMCC à une concentration de 1 nM, en utilisant la streptavidine conjuguée à la HRP, contre parallèles échantillons minus-plus-et HAM. Le signal spécifique de palmitoylation δ-caténine apparaît à sa taille prédite de 160kD, que dans l'échantillon de plus-HAM. La spécificité de ce signal a été confirmée par reprobing de δ-caténine avec l'anticorps spécifique qui a été initialement utilisé pour l'immunoprécipitation, résultant en un signal dans les deux traitements de jambon à la même taille prédite. Optimisation de l'essai IP-ABE (figure 2A) se traduira par un profil de western blot d'un échantillon moins-HAM qui se distingue facilement de l'échantillon plus-HAM, et présente peu ou pas de signal de palmitoylation.

La concentration de biotine-BMCC utilisé pour étiqueter cystéines palmitoylées nécessite une optimisation soignée, et si une concentration saturante de super-biOtin-CCMB est utilisé lors des étapes de la chimie ABE (figure 2B), fond excessif et non spécifiques signaux seront visibles. Une courbe de réponse linéaire pour la biotinylation d'une protéine neuronale palmitoylé, le récepteur nicotinique de l'acétylcholine α7, en utilisant la biotine-BMCC a été préalablement déterminée 6, et présente près de la saturation complète en une concentration de 5-10 pM. Bien que la concentration optimale de biotine-BMCC dévie légèrement en fonction de la protéine cible neuronale, le traitement avec de la biotine-BMCC à une concentration supérieure à 5 uM probablement super-saturer la protéine cible, et aboutir à un profil de western blot avec arrière-plan visible et des signaux non-spécifiques. Une concentration de 0,5 pM pour la biotine-BMCC a déjà été utilisé pour détecter la palmitoylation des autres protéines neuronales comprenant SNAP-25, la huntingtine, les sous-unités des récepteurs AMPA et GluA1 GluA2, et paralemmin 8, et la détermination de la concentration optimale pour un nouvelprotéine cible peut être accompli par essais et erreurs de manière linéaire, en commençant dans la plage de 0,5-5 uM que nous décrivons ici. Les profils issus de streptavidine western blot dans les échantillons moins-et plus-HAM pour δ-caténine palmitoylation ressembler lorsqu'ils sont traités avec 4 pM de biotine CCMB (figure 2B), avec un bruit de fond supplémentaires en différentes tailles, ce qui indique que la biotinylation inappropriée eu lieu.

Hydroxylamine est un puissant agent réducteur qui entraîne une dégradation limitée de la protéine cible, en plus de son efficacité de clivage de la liaison thioester. Par conséquent, l'optimisation de l'ABE chimie nécessite un à normaliser la quantité de la protéine immunoprécipitée utilisé pour les échantillons moins-et plus-HAM (étapes 3.2 à 3.3). La normalisation nécessite l'utilisation du double de la quantité de protéine cible immobilisée dans la plus-vs l'échantillon moins-HAM, ce qui correspond en réalité au wester indiscernablesn buvard profils pour la protéine cible, comme indiqué par δ-caténine (figure 2A, B). Toutefois, si la quantité de protéine cible immobilisé n'est pas normalisée entre les échantillons moins-et plus-HAM, le signal de tache résultante de l'Ouest pour la protéine cible dans l'échantillon plus-HAM peuvent être perdus, comme le montre par δ-caténine lorsque des quantités égales de protéines ont été utilisés dans les deux traitements HAM (figure 2C).

La spécificité de l'ABE chimie pour l'étiquetage des protéines palmitoylées est très sensible et nécessite une optimisation. Les pièges les plus courants rencontrés lors de l'essai IP-ABE inclure les résultats sous-optimaux présentés dans les figures 2B et 2C, et la dégradation de la protéine cible, indépendamment du traitement HAM, qui sont généralement causées par plus réactifs et tampons, et le pH incorrect. Afin d'éviter ces écueils et corriger les sous-optimale chimie ABE, la fraîcheur et la concentration des réactifs nécessaires à latampons énumérées dans le tableau 1 doivent toujours être examinés, et les ajustements du pH de tous les tampons doivent toujours être vérifiées avant l'exécution de l'expérience.

Tampon Concentration de travail Commentaires
Tampon de lyse (LB) Dans de l'eau distillée 2 O: 1% d'IGEPAL CA-630 50 mM Tris-HCl pH 7,5 150 mM NaCl 10% de glycérol N / A Préparer avant l'expérience et conserver à 4 ° C
Solution NEM Dans EtOH à 100%: NEM poudre lyophilisée M 2 Préparer une solution fraîche, juste avant l'utilisation.
Tampon strictes En LB: 10 mM MEM SDS à 0,1% N / A Préparer juste avant l'utilisation, garder sur la glace.
7,2 pH LB En LB: Ajuster le pH à 7,2 exactement N / A Utiliser un appareil de mesure de pH pour ajuster le pH immédiatement avant l'emploi.
Tampon HAM Dans 7,2 pH LB: solution HAM Stock 1 M (concentration finale HAM) Préparer immédiatement avant l'utilisation.
PH 6,2 LB En LB: Ajuster le pH à 6,2 exactement N / A Même que pour 7,2 pH LB
Stock biotine-BMCC Solution Dans le DMSO: 2,1 mg Biotine-CCMB solution 8 mM Préparer immédiatement avant l'utilisation.
Biotine-BMCC tampon Dans pH 6,2 LB: Ajouter biotine-BMCC solution 1 à 5 uM (biotine-BMCC finale de concentration) Préparer immédiatement avant l'utilisation.
2tampon d'échantillon SDS x, aucun des agents réducteurs En distillée H 2 O: 5% de SDS à 5% de glycérol 125mm Tris-HCl pH 6,8 à 0,01% bleu de bromophénol N / A Préparer avant l'expérience, et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation. Supplément de 5 mM de DTT avant utilisation.

Tableau 1. Tampons et réactifs nécessaires pour le dosage IP-ABE. Beaucoup des tampons de lyse peut être préparé avant de commencer l'expérience, cependant, le pH doit être contrôlé et réglé immédiatement avant utilisation avec un pH-mètre, pour assurer le succès de la chimie ABE. La majorité des solutions mères doivent être préparées pour chaque expérience, immédiatement avant utilisation. Beaucoup de tampons, les réactifs communs à la plupart des laboratoires équipés pour la biochimie et réactifs spécialisés avec informations sur les fournisseurs sont énumérés dans le tableau des réactifs et du matériel.


Figure 1. Schéma de l'immunoprécipitation et Acyl-biotine Exchange (IP-ABE) test pour purifier et détecter palmitoylation des protéines neuronales. Neurones de l'hippocampe en culture sont lysées, (1) une protéine cible est ensuite purifié en utilisant un anticorps spécifique de la cible, et immobilisé sur sépharose perles revêtues d'une protéine G ou A. La protéine cible purifiée est ensuite (2) avec de la N-ethylmaliemide (NEM) de manière irréversible et se lier bloc libre thiols (-SH) le long de cystéines non modifié (C). La protéine cible est alors (3) soumis à un traitement avec de l'hydroxylamine (HAM), ce qui entraîne un clivage spécifique des liaisons thioester à cystéines palmitoylées et le démasquage d'un groupe thiol libre palmitoylée (-SH). Ensuite, la protéine cible est (4) treated avec une molécule de biotine thiol-réactive, la biotine-BMCC, résultant en la biotinylation spécifique de la cystéine palmitoylé. Enfin, (5) la protéine est éluée cible biotinylé et retiré de l'anticorps et de talon. La protéine cible avec son cystéine palmitoylée (s) marqué à la biotine est maintenant adapté pour électrophorèse SDS-gel de poly-acrylamide (SDS-PAGE) et Western blot avec de la streptavidine à détecter pour palmitoylation de la protéine purifiée neuronale. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2
Figure 2. Détection de la palmitoylation de la protéine neuronale δ-caténine en utilisant le test IP-ABE. Neurones hippocampiques primaires de rat ont été cultivées comme préprécédemment décrit 5, à une densité de 130 cellules / mm 2 jusqu'à l'échéance de 14DIV, ont ensuite été lysées, et on le soumet à l'analyse IP-ABE pour détecter palmitoylation d'un substrat récemment identifié neuronale palmitoylée, δ-caténine 2. Purifiée immunoprécipités (IP) de δ-caténine (protéine cible) ont été isolés en utilisant 5 ug d'anticorps δ-caténine par échantillon (Transduction Laboratories BD), et ont ensuite été soumis à un SDS-PAGE en parallèle moins-et plus-hydroxylamine (HAM) échantillons. Palmitoylation a été détectée par western blot (WB) avec de la streptavidine-HRP (palmitoylation), et la membrane a été déshabillé et soumis à un WB reprobe pour δ-caténine. (A) Un représentant optimisé IP-ABE résultat pour palmitoylée δ-caténine (tête de flèche) traité avec 1 pM de biotine-BMCC, illustrant la spécificité de l'ABE chimie pour détecter thiol-palmitoylées protéines à partir d'échantillons propriété intellectuelle. (B) Un représentant sous-optimalesentant IP-ABE résultat pour δ-caténine, où une concentration de plus de 4 uM biotine-CCMB a été utilisé, ce qui entraîne signaux non spécifiques et de fond dans les deux échantillons moins-et plus-HAM (flèches). (C) Un autre représentant sous-optimale IP-ABE BM pour δ-caténine, où une excessive concentration de 4 pM de biotine-BMCC a été utilisé et la quantité de protéine utilisée pour l'échantillon IP plus-HAM n'a pas été normalisées en fonction de HAM à médiation la dégradation des protéines, ce qui entraîne une perte de signal dans le WB reprobe pour δ-caténine. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Discussion

Le test IP-ABE présenté ici est une méthode simple et très sensible pour la détection de protéines dans des cultures primaires palmitoylées neurones de l'hippocampe, en utilisant principalement des techniques biochimiques standards. Cela rend le test facilement adaptable pour les laboratoires déjà équipés de matériaux occidentaux buvard. Le test IP-ABE associe un protocole d'immunoprécipitation norme pour isoler et immobiliser une protéine cible, suivie par la chimie décrite précédemment ABE 2-4 pour détecter rapidement les niveaux de palmitate sur une protéine substrat. La technique ABE dispose d'un large éventail d'applications pour l'examen des protéines palmitoylées dans divers tissus et des lignées cellulaires, y compris à grande échelle palmitoyl-protéomique dépistage des profils palmitoylation mondiaux, et la détection rapide des niveaux de palmitoylation d'une protéine cible unique.

Descriptions précédentes de l'ABE chimie ont utilisé différentes méthodes de lyse cellulaire et extraction par détergent de prot neuronaleeins 2, 9, thiol libre-blocage 10, 11, biotinylation, et la purification de la protéine cible 4 en fonction de la demande de l'expérience. L'addition de palmitate de neuronales résultats protéines dans leur ciblage vers la membrane cellulaire, et la détection de la fraction palmitoylé d'une protéine cible, il faudra son extraction à partir de ces membranes. Méthodologies décrites précédemment FBA ont utilisé une variété de 9 ioniques et des détergents non ioniques 8 à extraire des protéines cibles souhaitées, ainsi que l'utilisation d'un détergent particulier dépend de la protéine cible et son trafic membranaire connue. Ici, nous utilisons la non dénaturant et un détergent non ionique IGEPAL CA-630 pour extraire les protéines palmitoylées, que nous avons validées pour l'extraction et la détection de la protéine neuronale palmitoylée δ-caténine (figure 2). La structure de IGEPAL CA-630 comprend un groupe de tête volumineux et rigides non polaire qui n'est pasperturber la conformation des protéines d'origine ou interactions, mais qui permet à son association avec les régions hydrophobes des protéines associées à la membrane, ce qui confère à leur miscibilité et de permettre leur extraction. Beaucoup de protéines neuronales localisées à la membrane synaptique ou post-synaptique densité des synapses doit être extraite à l'aide IGEPAL CA-630, mais certains peuvent ne pas solubiliser complètement, et peut nécessiter l'utilisation d'un autre détergent non dénaturant comme le Triton X-100, qui a déjà été utilisé pour ABE chimie 2, 8.

Plusieurs descriptions de l'ABE chimie ont également utilisé un réactif de biotinylation différente thiol-réactive de la molécule que nous décrivons ici, appelée biotine-PSPM (Thermo Scientific), ce qui nécessite également un autre moyen de 4 purification des protéines. Biotine-HPDP est un autre thiol-réactive, molécule de biotine conjugué à maliemide qui contient une liaison disulfure dans le bras de liaison maliemide, structurellement dil ifferentiating de biotine-BMCC, qui ne contient pas cette liaison disulfure. À la suite de thiol biotinylation de la cystéine libre ou palmitoylé d'une protéine par la biotine-HPDP, la liaison disulfure qui en résulte entre la protéine cible et le groupe de la biotine peut être clivé par des réactifs réducteurs pour libérer le groupe de la biotine et la régénération de la protéine dans sa forme non modifiée, ce qui biotinylation par la biotine-PSPM transitoire et réversible. Par conséquent, l'utilisation de ce réactif de biotinylation exige la purification d'une protéine cible par des réactifs avidine immobilisés, tels que des billes revêtues de streptavidine. Toutefois, thiol-biotinylation d'une protéine cible par la biotine-BMCC, comme nous décrivons ici, est relativement stable et permanente, et nécessite une purification de la protéine cible par un anticorps dirigé contre la cible, et immobilisé sur des billes de sépharose. Les deux techniques de FBA ont déjà été utilisés à grande échelle, écrans et la détection de la palmitoylation des protéines individuelles 2, 8-10, 12, et leIP-ABE test que nous décrivons ici est optimale pour la détection rapide de la palmitoylation de simples protéines cibles neuronales.

Une majorité écrasante de palmitoylation cellulaire implique l'addition réversible d'palmitate au groupe thiol des cystéines (appelé S-palmitoylation, qui nous généralisons comme «palmitoylation» dans ce protocole), mais un groupe très limité de protéines sont soumises à palmitoylation irréversible à la glycine et les résidus de cystéine par la formation de liaisons amide stables, appelée N-palmitoylation 13. Une limitation de l'ABE chimie est son incapacité à détecter les N-palmitoylation en raison de la stabilité de la liaison amide, et c'est pourquoi le dépistage d'une protéine nouvelle cible pour palmitoylation doivent être confirmés par 3H-palmitate marquage métabolique 1.

Comme mentionné précédemment, le test IP-ABE peut être facilement adapté pour examiner palmitoylation dans des extraits protéiques provenant de sources multiples, y compris les transfected lignées cellulaires hétérologues, les tissus primaires et des cultures neuronales primaires de plusieurs régions du cerveau. Le dosage IP-ABE a été utilisée pour examiner la suffisance de palmitoylation mutées cystéine-à-sérine protéines pour identifier l'emplacement d'une cystéine palmitoylé le long d'une protéine cible 8, pour l'examen de roulement dynamique palmitate de protéines synaptiques des neurones en culture dans des conditions basales 10, et les changements dans les niveaux de palmitoylation de protéines neuronales suite à l'induction de l'activité neuronale 9. La sensibilité et la capacité d'adaptation de l'essai IP-ABE rendent parfaitement adapté pour l'examen des profils de palmitoylation de protéines neuronales, et optimale pour la détection des changements dynamiques dans palmitoylation.

Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par des subventions des Instituts de recherche en santé du MOP-81158.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IGEPAL CA-630 Sigma I8896
PMSF Fluka 93482
Protease Inhibitor Cocktail Roche Complete Mini 11 836 153 001
NEM Sigma E3876
HAM solution Sigma 46780-4
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 Ensure compatibility with chosen detergent
Protein G/A-coated sepharose beads GE Healthcare 17-6002-35
Biotin-BMCC Thermo Scientific 21900
Streptavidin-HRP Thermo Scientific 21126 Reconstitute at 1 mg/ml in water
Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 21059

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References

  1. Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 161-175 (2010).
  2. Kang, R., et al. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation. Nature. 456, 904-909 (2008).
  3. Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 36, 276-285 (2004).
  4. Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nat. Protoc. 2, 1573-1584 (2007).
  5. Xie, C., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Survival of hippocampal and cortical neurons in a mixture of MEM+ and B27-supplemented neurobasal medium. Free Radic. Biol. Med. 28, 665-672 (2000).
  6. Drisdel, R. C., Alexander, J. K., Sayeed, A., Green, W. N. Assays of protein palmitoylation. Methods. 40, 127-134 (2006).
  7. Eslami, A., Lujan, J. W. estern Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
  8. Huang, K., et al. Neuronal palmitoyl acyl transferases exhibit distinct substrate specificity. FASEB J. 23, 2605-2615 (2009).
  9. Noritake, J., et al. Mobile DHHC palmitoylating enzyme mediates activity-sensitive synaptic targeting of PSD-95. J. Cell Biol. 186, 147-160 (2009).
  10. Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 Targets GRIP1 to Dendritic Endosomes to Regulate AMPA-R Trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
  11. Hayashi, T., Thomas, G. M., Huganir, R. L. Dual palmitoylation of NR2 subunits regulates NMDA receptor trafficking. Neuron. 64, 213-226 (2009).
  12. Ho, G. P., et al. S-Nitrosylation and S-Palmitoylation Reciprocally Regulate Synaptic Targeting of PSD-95. Neuron. 71, 131-141 (2011).
  13. Iwanaga, T., Tsutsumi, R., Noritake, J., Fukata, Y., Fukata, M. Dynamic protein palmitoylation in cellular signaling. Prog. Lipid Res. 48, 117-127 (2009).

Comments

7 Comments

  1. please ,what is the stringent buffer ? What reagents should I prepare?

    Reply
    Posted by: 李 î
    August 28, 2013 - 3:09 AM
  2. Hello,
    The stringent buffer is described in Table 1, 3rd buffer from the top. The description reads "In LB: 10 mM MEM 0.1% SDS," however there is typo and should read "In LB: 10mM NEM + 0.1% SDS." NEM refers to N-ethymaliemide, which we describe in the protocol. SDS refers to sodium dodecyl sulfate, a common laboratory reagent, and powerful ionic detergent. Add SDS to LB containing 10mM NEM to achieve a final concentration of 0.1% of the total volume. Perform the wash step (step 3.4) quickly, as we describe above, as the SDS could result in the removal of the target protein from the antibody-bead immunocomplex if incubated to long. Thank you for your interest in the our protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    August 28, 2013 - 6:04 PM
  3. please,I want to kown that if my cell is suspended cells,what can I do about the Extraction of Target Protein ? especially,the amount of the LB+50mM NEM. THANK YOU!

    Reply
    Posted by: 李 î
    September 2, 2013 - 2:22 AM
  4. Hello,
    The IP-ABE assay should work fine for a suspended cell culture. The section of the protocol pertaining to the harvesting and extraction (steps 1.1-1.8) of the target protein works in a manner similar to the extraction of any target protein for the purposes of immunoprecipitation. Begin by growing your cells to the confluence and density in suspension that you desire, and then simply spin down (e.g. 3000 x g/ 5 minutes) to collect the cells in a pellet. Next, simply re-suspend the cells in lysis buffer supplemented with 50mM NEM, and proceed with the remainder of the protocol as we describe. Some important considerations should be paid to your choice of detergent for extracting the target protein. We recommend the use of IGEPAL-CA 630, a non-ionic detergent suitable for the extraction of membrane-associated proteins, and which can extract palmitoylated fractions of neuronal proteins localized to synapses of cultured hippocampal neurons. Triton X-100 is a similar detergent, and is also highly utilized to extract palmitoylated proteins. We would not recommend using an ionic detergent (e.g. SDS), as this will denature the protein and may hinder the immunoprecipitation efficiency of your chosen antibody, and may degrade the palmitoylation signal. You will also want to choose an antibody suitable for immunoprecipitation of your target protein. We recommend that you refer to your lab's standard protocol for immunoprecipitating a target protein from suspended cell culture, and simply supplement your lysis buffer with 50mM NEM and proceed with the ABE assay as we describe. Please refer to the discussion section of our protocol for more information regarding choice of detergents. Thank you again for your interest in our protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    September 2, 2013 - 4:32 PM
  5. sorry ,I also confused about the Extraction of Target Protein of suspended cells, a problem is how do I control the amount of the LB+50mM NEM ? whether should I determine its amount based on the amount of my cells or refer your protocol to add 300μl ?

    Reply
    Posted by: 李 î
    September 3, 2013 - 3:14 AM
  6. Hello,
    I recommend that you determine the total volume of lysis buffer to use for harvesting according to the amount of cells you use as a starting point. As long as you maintain the concentration of 50mM NEM within your lysis buffer, the total volume can change depending upon your needs. The volume we used in the protocol was based upon harvesting protein from at least 3 wells of a standard 6-well dish containing hippocampal neurons, however I imagine you will want to adjust the volume you use for harvesting from suspended cells. In general, it is best to obtain a high total protein concentration within the lysis buffer, and so I recommend that you use the minimal volume of lysis buffer necessary to sufficiently extract your target protein. In my past experience working with adherent cell cultures and the IP-ABE assay, approximately 50-100uL of lysis buffer / 1.0 x 10^6 cells was sufficient for adequate protein extraction and achieving a high protein concentration. I suggest that you begin by determining the number of cells required for at least 500ug total protein / IP sample, and start with a smaller volume of lysis buffer (up to 500uL total, per sample). Once you spin down and pellet your suspended cells in a conical tube, you should be able to visualize an approximate volume that will suffice. We wish you the best of luck with the protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    September 3, 2013 - 2:11 PM
  7. Hello,
    I tried the protocol with your protein as a positive control but I can't see any signal for palmitoylation. I noticed I used Protease Inhibitor Cocktail ultra which not contain EDTA compare to your. I used the 2x Laemmli Sample Buffer from Biorad (glycerol 20-35%, SDS 1-2.5%, water 50-100%) and I add DTT. Is this may be the reason it didn't work ?

    Reply
    Posted by: Nicolas P.
    September 25, 2016 - 12:34 AM

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