Rilevamento di palmitoilazione proteina in colture di neuroni ippocampali di immunoprecipitazione e di acil-Biotina Exchange (ABE)

Neuroscience
 

Summary

L'aggiunta di palmitato reversibile alle proteine ​​è un importante regolatore del traffico intracellulare delle proteine. Questo è di particolare interesse in neuroni dove sono palmitoilato molte proteine ​​sinaptiche. Utilizziamo un metodo semplice biochimico per rilevare le proteine ​​palmitoilato in neuroni in coltura, che possono essere adattati per più tipi di cellule e tessuti.

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Brigidi, G. S., Bamji, S. X. Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE). J. Vis. Exp. (72), e50031, doi:10.3791/50031 (2013).

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Abstract

Palmitoilazione è una modificazione post-traduzionale di lipidi che coinvolge l'apposizione di 16 atomi di carbonio acido grasso saturo, palmitato, di residui di cisteina delle proteine ​​substrato attraverso un labile legame tioestere [recensione in 1]. Palmitoilazione di una proteina substrato aumenta la sua idrofobicità, e facilita tipicamente suo traffico verso membrane cellulari. Recenti studi hanno dimostrato palmitoilazione essere una delle modifiche lipidici più comuni in neuroni 1, 2, suggerendo che turnover palmitato è un importante meccanismo attraverso cui queste cellule regolano la destinazione e traffico di proteine. L'identificazione e rilevazione di substrati palmitoilato può pertanto migliorare la nostra comprensione della tratta proteina nei neuroni.

Rilevamento di proteine ​​palmitoilazione in passato è stata tecnicamente ostacolato a causa della mancanza di una sequenza consenso tra proteine ​​substrato, e la dipendenza metabolica labeling di palmitoil-proteine ​​con 3 H-palmitato, un tempo saggio biochimico con bassa sensibilità. Sviluppo della acil-Biotina Exchange (ABE) test consente di rilevare la sensibilità più rapido ed elevato di proteine ​​palmitoylated 2-4, ed è ottimale per misurare la dinamica del fatturato palmitato sulle proteine ​​neuronali. Il dosaggio ABE comprende tre passi biochimici (figura 1): 1) blocco irreversibile di gruppi non modificati tiolo della cisteina con N-ethylmaliemide (NEM), 2) clivaggio specifico e smascheramento del gruppo tiolo della cisteina palmitoilato da parte idrossilammina (HAM), e 3) l'etichettatura selettiva della cisteina palmitoylated con un tiolo reattivo reattivo biotinilazione, biotina-BMCC. Purificazione delle tiolo-biotinilati proteine ​​secondo le fasi ABE è stato diverso, a seconda l'obiettivo generale di questo esperimento.

Qui, si descrive un metodo per purificare una proteina di interesse in palmitoilato ippocampo primarianeuroni AL di una immunoprecipitazione iniziale (IP) utilizzando un anticorpo diretto contro la proteina, seguita dal dosaggio ABE e western blotting per misurare direttamente palmitoilazione livelli di tale proteina, che è definito il IP-ABE saggio. A bassa densità colture di neuroni ippocampali embrionali di ratto sono stati ampiamente utilizzati per studiare la localizzazione, la funzione, e il traffico di proteine ​​neuronali, che li rende la soluzione ideale per lo studio delle proteine ​​palmitoilazione neuronale utilizzando l'IP-ABE saggio. L'IP-ABE test richiede principalmente IP standard e reagenti occidentali blotting, ed è solo limitata dalla disponibilità di anticorpi contro il substrato bersaglio. Questo dosaggio può essere facilmente adattato per la purificazione e la rilevazione di proteine ​​palmitoilato trasfettati in colture cellulari eterologhi, colture neuronali primarie derivate da vari tessuti cerebrali di entrambi topo e ratto, e tessuto cerebrale anche primario stesso.

Protocol

1. Estrazione di proteine ​​target da colture di neuroni primari ippocampali

  1. Prima raccolta proteina endogena da cellule primarie ippocampali, preparare un tampone di lisi (LB, Tabella 1) con inibitori della proteasi. A 10 ml di tampone di lisi, aggiungere 0,1 ml di soluzione phenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF) ad una concentrazione finale di 10 mM, e aggiungere 1 inibitore della proteasi cocktail compressa.
  2. Preparare N-etilmaleimmide (NEM) soluzione (Tabella 1) dalla polvere liofilizzata. Sciogliere delicatamente in EtOH al 100% a temperatura ambiente (RT). Sempre preparare soluzione NEM fresco per il giorno dell'esperimento.
  3. Successivo combinare il tampone di lisi e NEM. Aggiungere 0,5 ml di soluzione 2M NEM in una nuova tubo da 50 ml. Aggiungere 20 ml di LB più alto, e rapidamente luogo LB + NEM (concentrazione finale di 50 mM) su una piattaforma oscillante a 4 ° C per mescolare completamente per 5 min. Aggiungere sempre NEM / EtOH secondi prima soluzione e LB, così da miscelare correttamente i due.
  4. Rimuovere neuroni in coltura da incubatore e posto su ghiaccio *. Delicatamente rimuovere i supporti cellulari, e delicatamente lavare due volte con fosfato freddo soluzione salina tamponata (PBS) 1x. Aggiungere 300 ml di LB + NEM 50 mM al primo pozzo di neuroni ippocampali e cellule, raschiare con un sollevatore usa e getta cella. Raccogliere il lisato cellulare, quindi scaricare il lisato nel pozzo successivo di quel gruppo. Raschiare le cellule all'interno del secondo pozzo di azionare il sollevatore cella, raccogliere, e ripetere con un pozzo terzo, se necessario, per concentrare ulteriormente il lisato.
  5. Raccogliere lisato cellulare in un pre-raffreddata (su ghiaccio), 1,5 ml microprovetta. Ripetere il passaggio 1,4 con 100 ml di LB + NEM 50mM a raccogliere tutte le rimanenti lisato cellulare. Passare lisato totale della cella attraverso una siringa da 26 ½ calibro 5-6 volte per facilitare la lisi meccanica, facendo attenzione a non soffiare bolle nella soluzione. Si può invece ultrasuoni per 15 secondi su ghiaccio, se l'apparecchiatura è disponibile. Nutate lisato cellulare per ≥ 30 min a 4 ° C.
  6. Chiarire il Lysa cellate per centrifugazione a 16.000 xg / 30 min, in modo da pellet un-cellule lisate e detergente-insolubili materiale.
  7. Raccogliere azzerato lisato cellulare (surnatante) in una nuova pre-raffreddato 1,5 ml tubetto sul ghiaccio. Ripetere il protocollo di raccolta per tutti i gruppi di cellule. Misura la concentrazione di proteine ​​in tutti i campioni lisati mediante saggio BCA, e normalizzare il volume di tutti i campioni del lisato da gruppi di cellule di avere esattamente uguale proteine ​​totali, con una minima raccomandata di 500 mg. Riempire tutti i campioni con LB + NEM 50 mM a 500 microlitri di volume totale.
  8. Aggiungere 1-5 pg di anticorpo primario diretto contro la proteina bersaglio per ciascun campione di lisato. Nutate anticorpo-lisato campioni misti notte a 4 ° C.

Neuroni ippocampali di ratto primari * devono essere coltivate ad una densità di circa 250.000 cellule / pozzetto in un 6-ben piatto, in un siero mezzi privi contenenti un integratore B27 neuronale, come precedentemente descritto 5, e coltivate per il desideriolunghezza d di tempo, tipicamente 14-16 giorni in vitro (DIV) per raggiungere la maturità. Un minimo di 500 pg di proteina totale è consigliabile successo immunoprecipitare e biotinylate una proteina bersaglio neuronale, che richiede in genere 2-3 pozzetti di una 6-ben piatto.

2. Precipitazione di anticorpo legato proteina bersaglio

  1. Prima di precipitare e immobilizzare una proteina bersaglio, preparare un impasto al 50% di proteina A o proteina G-sefarosio perle rivestite. In particolare, aggiungere ≥ 60 ml di perline sefarosio per campione in provette da 1,5 ml, assicurando che tutti i campioni hanno la stessa quantità di perline. Branelli magnetici sono adatti anche se l'apparecchiatura è disponibile.
  2. Aggiungere un volume uguale del 50% slurry per ciascun anticorpo-lisato campione, e nutate ≥ per 1 ora a 4 ° C.

3. Acil-Biotina Exchange: Hydroxylamine (HAM) Cleavage

  1. Durante l'esecuzione passo 2.2, preparare un certo numero di tubi con tampone di lisi (LB) di dipH fferent. Il pH è molto importante per i passaggi e deve sempre essere regolata usando un pH-metro. Preparare 2 ml di LB pH 7,2 per campione, e 0,5 ml di tampone per campione Stringente (Tabella 1). Anche preparare 0,5 ml di LB + NEM 10mM per campione, come nei passi 1,1-1,3. Aggiungi PMSF e compresse con inibitori della proteasi per tutti i buffer di lisi, come al punto 1.1.
    1. Idrossilammina (HAM) è un potente agente riducente, quale clivaggio di palmitato di cisteine ​​è richiesto per biotinilazione (Figura 1), e l'omissione del clivaggio HAM serve come controllo negativo. Dividere ogni campione di perline in due campioni, uno omettendo la fase HAM clivaggio (-HAM), e uno comprendente la fase HAM (+ HAM). Per normalizzare per la degradazione delle proteine ​​causata dal trattamento HAM, si dovrebbe dividere ogni campione in terzi, con 1/3 delle sfere usate per il controllo del-HAM, ed i restanti 2/3 utilizzato per il trattamento HAM +.
    2. Preparare ulteriore 1.Provette da 5 ml su ghiaccio, etichettati come controllo della HAM-per ogni campione. Seguendo passo 2.2, centrifugare delicatamente perle tutti i campioni "a 0.5 xg / 1 min a 4 ° C (centrifuga a questa velocità, la durata e la temperatura per tutti i passaggi rimanenti salvo diversa indicazione), posizionare i tubi in ghiaccio, rimuovere il supernatante e risospendere le sfere in 600 ml di LB + NEM 10mM.
  2. Dopo la ri-sospensione i campioni "perle in tampone di lisi + NEM 10mM, immediatamente raccogliere 200 ml di del campione lisato-tallone liquami, e scarico in quel campione-HAM provetta in ghiaccio. Aggiungere un ulteriore 300 ml di LB + NEM 10mM a campione-HAM, e un ulteriore 100 pl di campione HAM + per un totale di 500 microlitri in ciascun campione. Incubare per 10 min in ghiaccio.
  3. Risospendere (lavaggio) il-HAM e campioni di prosciutto + delicatamente con 0,5 ml di tampone rigorose, per campione. Eseguire questo passaggio velocemente, come incubazione più SDS comporterà la rimozione di anticorpo legato dalperline.
  4. Lavare delicatamente tutti i campioni per tre volte in 0,5 ml / campione di pH LB 7.2, e spin down tra un lavaggio e come in 3.2b passo.
  5. Durante l'esecuzione passo 3.5, preparare un buffer HAM (Tabella 1). Aggiungere volume appropriato di soluzione di idrossilammina in una nuova provetta, per ottenere una concentrazione finale di 1 M in un volume di 0,5 ml LB pH 7,2, per esempio + HAM. Sempre preparare il buffer HAM fresco per il giorno dell'esperimento. Aggiungere 0,5 ml / campione di pH 7,2 a LB-HAM tutti i campioni, e 0,5 ml / campione di tampone a campioni HAM HAM tutti +.
  6. Nutate tutti i campioni per 1 ora a temperatura ambiente (RT). Non superare 1 ora.

4. Acil-Biotina Exchange: Biotina-BMCC Etichettatura

  1. Durante l'esecuzione di passo 3,6, preparare 2 ml di LB pH 6,2 per campione (Tabella 1), come nel passo 3,1. Posizionare il pH LB 6.2 su ghiaccio fino al momento dell'uso. Anche preparare una soluzione stock di Biotina-BMCC (Tabella 1) immediatamente prima dell'uso. Pesare exacTLY 2,1 mg di biotina-BMCC, raccogliere in una provetta da 1,5 ml, e delicatamente sciogliere in 0,5 ml di dimetil solfossido (DMSO), mettendo su una piattaforma oscillante a temperatura ambiente, per raggiungere la concentrazione 8mm (non usare una pipetta per rompere la polvere ).
  2. Una volta che passo 3.6 è terminato, lavare delicatamente le perle una volta in pH 6,2 tampone di lisi, per rimuovere i residui di tampone HAM. Rimuovere il surnatante e mettere i campioni in ghiaccio.
  3. Biotina-BMCC è una molecola maliemide biotina coniugata che ha una elevata affinità per i gruppi tiolici liberi di cisteine ​​(Figura 1). Durante l'esecuzione di passo 4,2, preparare 0,5 ml di Biotina-BMCC Buffer (Tabella 1) per campione, a concentrazione di lavoro tra 0,5 pM a 5 micron. Concentrazioni superiori a 5 pM probabilmente saturare la proteina bersaglio 6, e in genere non deve essere superato, tuttavia questo può variare a seconda della proteina bersaglio desiderato. Aggiungere 0,5 ml di Biotina-BMCC tampone a ciascun campione, e nutate esattamente per 1 ora a 4 ° C. Non superare 1 ora.

5. Eluizione di biotina-coniugato proteina bersaglio e SDS-PAGE

  1. Una volta che passo 4.3 è terminato, lavare delicatamente tutti i campioni una volta in LB pH 6.2. Tenere tutti i campioni in ghiaccio tra lavaggi. Rimuovere 2x Sample Buffer SDS senza agenti riducenti (Tabella 1) da -20 ° C di stoccaggio e lentamente sciogliere il ghiaccio.
  2. Lavare delicatamente i campioni per tre volte di pH 7.5 + LB PMSF / Inibitori, e mantenere i campioni in ghiaccio tra lavaggi.
  3. Rimuovere il surnatante del terzo risciacquo, lasciando le sferette pellet in un impasto liquido con buffer residuo sul fondo della provetta. Immergere una pipetta con un piccolo diametro di punta (una punta di carico gel o P2 puntale sono sufficienti) nella parte inferiore del tubo attraverso il liquame, e rapidamente raccogliere qualsiasi buffer residuo, facendo attenzione a non prendere le perline.
  4. Supplemento il 2x soluzione tampone SDS con DL-Dithiothreitol (DTT) per ottenere una concentrazione finale di 5 mM. Aggiungere40-50 ml di soluzione tampone 2x + DTT 5 mM per ogni campione. Se necessario, le perline vortice per mescolare completamente con il tampone del campione, e subito centrifugare ad alta velocità per raccogliere tutti perline in un pellet, immersi in tampone campione.
  5. Tutti i campioni bollire per 10 minuti a 75-80 ° C. Lasciate raffreddare i campioni a temperatura ambiente per ≥ 10 minuti sul banco, e centrifugare a 16000 xg / 3 min a pellet completamente le perline.
  6. Aggiungere il volume totale di proteine ​​eluite (supernatante) da ciascun campione di una sola corsia di un gel di poliacrilammide adatto per western blotting, usando SDS-PAGE 7. Organizza tutti i campioni in modo che la HAM-eluente controllo e HAM eluente + per un solo campione vengono eseguiti immediatamente adiacenti l'uno all'altro durante la SDS-PAGE (Fig. 2). Seguendo SDS-PAGE, si trasferiscono in PVDF o membrana di nitrocellulosa.

6. Western Blotting e rilevamento della palmitoilazione della proteina bersaglio

  1. Dopo 5,6 passo è completato, lavare la membranadue volte in soluzione salina tamponata Tris (TBS 1x) per 10 min su una piattaforma oscillante a RT.
  2. Preparare un tampone di bloccaggio per bloccare non specifica etichettatura pesando sieroalbumina bovina (BSA), per raggiungere il 3% in peso di un volume di 1x TBS + Tween-20 0,05% (TBS-T), che è sufficiente per sommergere completamente la membrana . Per streptavidina blotting, bloccare sempre con BSA e non il latte in polvere. Bloccare la membrana per 1 ora a RT su una piattaforma oscillante.
  3. Preparare una soluzione di anticorpo TBS-T + 0,3% BSA. Aggiungere streptavidina-HRP anticorpo ricostituito a 1 mg / ml in acqua distillata, diluito al 1:5,000-1:10,000. Una volta completata passo 6.2, lavare la membrana volta in TBS-T per 10 minuti, poi incubare la membrana in soluzione di anticorpi Streptavidina su una piattaforma oscillante per entrambi per 1 ora a RT, o per una notte a 4 ° C.
  4. Lavare la membrana per tre volte in TBS-T per 10 min su una piattaforma oscillante. Al fine di rilevare il segnale palmitoilazione, esporre la luminescenza HRP utilizzando un chemsubstrato kit iluminescent.
  5. Al fine di normalizzare i livelli palmitoilazione alla quantità della proteina di interesse che è stato immunoprecipitato, togliere la membrana utilizzando tampone western blot strippaggio per 5-10 minuti su una piattaforma oscillante a RT. Ripetere i passaggi 6,1-6,4 usando l'anticorpo primario contro la proteina di interesse che è stato originariamente utilizzato per l'immunoprecipitazione.
  6. Quantificare palmitoilazione della proteina di interesse utilizzando software di analisi di immagini, e normalizzare i livelli palmitoilazione alla quantità di proteine ​​immunoprecipitato.

Representative Results

L'IP-ABE saggio rileva specificamente tiolo-palmitoilazione di residui di cisteina lungo proteine ​​substrato, e può essere utilizzato per rilevare palmitoilazione di immunoprecipitate proteine ​​neuronali in modo rappresentato nella figura 1. Trattamento della proteina neuronale immunoprecipitato con HAM (Figura 1) scinde il legame tioestere tra palmitato e gruppo tiolo una cisteina, permettendo per incorporazione specifica di biotina-BMCC sul gruppo appena disponibile tiolo, che può essere successivamente rilevata tramite western blotting. L'omissione di HAM (meno-HAM) scissione impedisce l'incorporazione di biotina-BMCC e funziona come un controllo negativo per specifici palmitoil-biotinilazione del plus-HAM campione e deve quindi sempre essere eseguito vicino al plus-HAM campione per occidentale blotting mediante SDS-PAGE (Figura 2).

In un esperimento ottimizzato (Figura 2A), il palmitoilazionesegnale della proteina neuronale δ-catenina 2 può essere facilmente rilevato da blotting per biotina-BMCC ad una concentrazione di 1 mM, utilizzando streptavidina coniugata con HRP, contro i campioni meno parallele e-plus-HAM. Il segnale palmitoilazione specifico per δ-catenina appare nella sua dimensione prevista di 160kD, solo nel plus-HAM campione. La specificità di questo segnale è stato confermato da reprobing per δ-catenina con l'anticorpo specifico che è stato inizialmente utilizzato per immunoprecipitare esso, risultando in un segnale in entrambi i trattamenti prosciutto al predetto stessa dimensione. Ottimizzazione del IP-ABE test (Figura 2A) si tradurrà in un profilo western blotting di un minus-HAM campione che è facilmente distinguibile dal plus-HAM campione, e mostra una minima di alcun segnale palmitoilazione.

La concentrazione di biotina-BMCC utilizzato per etichettare cisteine ​​palmitoilato richiede un'attenta ottimizzazione, e se una super-saturante concentrazione di biOtín-BMCC viene utilizzato durante le fasi chimica Abe (Figura 2B), fondo eccessiva e non specifici segnali sarà visibile. Una curva di risposta lineare per biotinilazione di una proteina palmitoilato neuronale, la α7 recettore nicotinico, utilizzando biotina-BMCC è stata preventivamente fissata 6, e mostra vicino completa saturazione ad una concentrazione di 5-10 uM. Sebbene la concentrazione ottimale di biotina-BMCC sarà deviare leggermente a seconda della proteina bersaglio neuronale, il trattamento con biotina-BMCC ad una concentrazione superiore a 5 pM probabilmente super-saturare la proteina bersaglio, e il risultato in un profilo western blot con sfondo visibile e non specifici segnali. Una concentrazione di 0,5 pM di biotina-BMCC è stato precedentemente utilizzato per rilevare palmitoilazione di altre proteine ​​neuronali compresi SNAP-25, huntingtina, subunità dei recettori AMPA GluA1 e GluA2, paralemmin e 8, e la determinazione della concentrazione ottimale per un romanzoproteina bersaglio può essere effettuata per tentativi in ​​modo lineare, partendo nell'intervallo di 0,5-5 pM che descriviamo qui. I risultanti streptavidina profili western blot tra i campioni meno-e plus-HAM per δ-catenina palmitoilazione essere simile se trattati con 4 mM biotina-BMCC (Figura 2B), con segnali di fondo aggiuntivi in diverse dimensioni, il che indica che si è verificato biotinilazione inappropriato.

Idrossilammina è un potente agente riducente che provoca la degradazione limitata della proteina bersaglio in aggiunta alla sua scissione efficiente di tioestere linkage. Di conseguenza, l'ottimizzazione delle ABE chimica richiede uno per normalizzare la quantità di proteine ​​immunoprecipitato utilizzato per campioni e meno-più-HAM (passi 3,2-3,3). Normalizzazione richiede l'uso del doppio della quantità di proteina bersaglio immobilizzata nel plus-vs-minus HAM campione, che si traduce in realtà in Wester indistinguibilin blotting profili per la proteina bersaglio, come mostrato per δ-catenina (Figura 2A, B). Tuttavia, se la quantità di proteina bersaglio immobilizzato non viene normalizzato tra campioni e meno-più-HAM, il segnale risultante western blot per la proteina bersaglio in plus-HAM campione può essere perso, come mostrato per δ-catenina quando la stessa quantità di proteina sono stati utilizzati in entrambi i trattamenti HAM (Figura 2C).

La specificità di ABE chimica per l'etichettatura di proteine ​​palmitoylated è molto sensibile e richiede l'ottimizzazione. Gli errori più comuni riscontrati durante il PI-ABE test includono i risultati non ottimali illustrati nelle figure 2B e 2C, e la degradazione della proteina bersaglio, indipendentemente dal trattamento HAM, che sono generalmente causati da vecchi reagenti e tamponi, e il pH corretto. Per evitare questi inconvenienti e per correggere sub-ottimale chimica ABE, la freschezza e la concentrazione dei reagenti necessari per l'buffer di cui alla tabella 1 deve sempre essere esaminato, e le regolazioni del pH di tutti i buffer deve essere sempre controllato prima di eseguire l'esperimento.

Buffer Concentrazione di lavoro Commenti
Lysis Buffer (LB) In distillata H 2 O: 1% IGEPAL CA-630 50 mM Tris-HCl 150 mM pH7.5 Glycerol NaCl 10% N / A Preparare prima di sperimentare e conservare a 4 ° C
NEM Soluzione In% EtOH 100: NEM polvere liofilizzata 2 M Preparare fresco, immediatamente prima dell'uso.
Buffer stringente In LB: 10 mM MEM 0.1% SDS N / A Preparare poco prima dell'uso, tenerla in ghiaccio.
LB pH 7.2 In LB: Portare il pH esattamente a 7,2 N / A Utilizzare un misuratore di pH per regolare il pH immediatamente prima dell'uso.
HAM Buffer In LB pH 7.2: soluzione HAM Fotografico 1 M (concentrazione finale HAM) Preparare al momento dell'uso.
LB pH 6,2 In LB: Regolare il pH esattamente a 6,2 N / A Come per pH 7,2 LB
Foto biotina-BMCC Solution In DMSO: 2,1 mg Biotina-BMCC soluzione 8 mM Preparare al momento dell'uso.
Biotina-BMCC Buffer In LB pH 6.2: Aggiungi biotina-BMCC soluzione 1-5 mM (finali biotina-BMCC concentrazione) Preparare al momento dell'uso.
2x SDS Sample Buffer, non agenti riducenti In distillata H 2 O: 5% SDS 5% glicerolo 125mm Tris-HCl pH 6,8 0,01% blu di bromofenolo N / A Preparare prima dell'esperimento, e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso. Supplemento con 5 mM DTT prima dell'uso.

Tabella 1. Tamponi e reagenti necessari per l'IP-ABE dosaggio. Molti dei buffer di lisi può essere preparato prima di iniziare l'esperimento, tuttavia il pH deve essere controllato e regolato immediatamente prima dell'uso con un misuratore di pH, per assicurare il successo della chimica ABE. La maggior parte delle soluzioni madre deve essere preparato per ogni esperimento, immediatamente prima dell'uso. Molti dei buffer richiede reagenti comuni alla maggior parte dei laboratori attrezzati per biochimica, e reagenti speciali con informazioni venditore sono elencati nella tabella dei reagenti e apparecchiature.


Figura 1. Schematica della immunoprecipitazione e acil-Biotin Exchange (IP-ABE) saggio per purificare e rilevare palmitoilazione di proteine ​​neuronali. Colture di neuroni ippocampali vengono lisate, (1) una proteina bersaglio viene quindi purificato utilizzando un anticorpo specifico bersaglio e immobilizzato su sefarosio perline rivestite con proteina G o A. La proteina purificata è poi destinazione (2) trattata con N-ethylmaliemide (NEM) di legarsi irreversibilmente e bloccare liberi tiolo (-SH) gruppi lungo cisteine ​​non modificati (C). La proteina bersaglio viene poi (3) sottoposti a trattamento con idrossilammina (HAM), con conseguente scissione specifico di legami tioestere in cisteine ​​palmitoylated e lo smascheramento di un libero gruppo palmitoylated tiolo (-SH). Successivamente, la proteina bersaglio è (4) treated con un tiolo reattivo molecola di biotina, biotina-BMCC, con conseguente biotinilazione specifico della cisteina palmitoilato. Infine, (5) la proteina bersaglio biotinilato viene eluito e rimosso dal anticorpo e tallone. La proteina bersaglio con la sua cisteina palmitoylated (s) codificata con biotina ora è adatto per SDS poliacrilammide gel elettroforesi (SDS-PAGE) e western blotting con streptavidina per rilevare per palmitoilazione della proteina purificata neuronale. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2
Figura 2. Rilevamento palmitoilazione della proteina neuronale δ-catenina utilizzando l'IP-ABE saggio. Neuroni dell'ippocampo di ratto primarie sono state coltivate come preprecedentemente descritto 5, ad una densità di 130 cellule / mm 2 fino a maturità 14DIV, sono state poi lisate, e sottoposto al IP-ABE test di rilevare palmitoilazione di un substrato recentemente identificato palmitoilato neuronale, δ-catenina 2. Purificato immunoprecipitati (IP) di δ-catenina (proteina bersaglio) sono stati isolati con 5 mg di δ-catenina anticorpo per campione (Transduction Laboratories BD), e sono stati sottoposti a SDS-PAGE in parallelo meno-e plus-idrossilammina (HAM) campioni. Palmitoilazione stato rilevato mediante western blotting (WB) con streptavidina-HRP (palmitoilazione), e la membrana è stata spogliato e sottoposto ad un WB reprobe per δ-catenina. (A) Un rappresentante ottimizzata IP-ABE risultato palmitoylated δ-catenina (punta di freccia) trattati con 1 pM biotina-BMCC, illustrando la specificità di ABE chimica per rilevare tiolo palmitoylated proteine ​​da campioni IP. (B) Un sub-ottimale rappresensentante IP-ABE risultato δ-catenina, in cui è stato utilizzato un eccessiva concentrazione di 4 mM biotina-BMCC, con conseguente non specifici segnali e priorità bassa in entrambi i campioni meno-e plus-HAM (frecce). (C) Un altro sub-ottimale rappresentante IP ABE-WB per δ-catenina, dove è stata utilizzata una eccessiva concentrazione 4 pM di biotina-BMCC, e la quantità di proteina utilizzata per il plus-HAM campione IP non è stata normalizzata per HAM-mediata degradazione delle proteine, con un conseguente segnale perso nel WB reprobe per δ-catenina. Clicca qui per ingrandire la figura .

Discussion

L'IP-ABE saggio qui presentato è un metodo semplice e molto sensibile per la rilevazione di proteine ​​palmitoylated in una coltura di neuroni primari ippocampali, utilizzando tecniche biochimiche per lo più standard. Questo rende il test facilmente adattabile per i laboratori già equipaggiati con materiali occidentali blotting. L'IP-ABE test combina un protocollo standard per isolare immunoprecipitazione e immobilizzare la propria proteina bersaglio, seguito da precedentemente descritto ABE chimica 2-4 per rilevare rapidamente livelli di palmitato su un substrato proteico. La tecnica ABE ha una vasta gamma di applicazioni per l'esame di proteine ​​palmitoilato in vari tessuti e linee cellulari, inclusi i grandi palmitoil-proteomica screening di profili palmitoilazione globali e rilevamento rapido di palmitoilazione livelli di una proteina bersaglio singolo.

Descrizioni precedenti di ABE chimica hanno utilizzato diversi metodi di lisi cellulare ed estrazione detergente di prot neuronaleEins 2, 9, tiolo libero-blocco 10, 11, biotinilazione, e purificazione della proteina bersaglio 4, a seconda dell'applicazione dell'esperimento. L'aggiunta di palmitato di proteine ​​neuronali risultati nel proprio targeting verso membrane cellulari, e la rilevazione della frazione palmitoilato di una proteina bersaglio richiederà la sua estrazione da tali membrane. Precedentemente descritte metodologie ABE hanno utilizzato una varietà di 9 ionici e non-ionici detergenti 8 per estrarre proteine ​​bersaglio desiderate, e l'uso di un particolare detersivo dipende la proteina bersaglio e il suo traffico di membrana nota. Qui, utilizziamo la non denaturante e detergente non ionico IGEPAL CA-630 per estrarre proteine ​​palmitoilato, che abbiamo convalidato per l'estrazione e la rilevazione della proteina neuronale palmitoilato δ-catenina (Figura 2). La struttura di IGEPAL CA-630 comprende un ingombrante e rigido non polare gruppo di testa che nonperturbare conformazione nativa o interazioni proteina, ma che permette la sua associazione con le regioni idrofobiche di proteine ​​associate alla membrana, conferendo in tal modo miscibilità a loro e permettendo loro estrazione. Molte proteine ​​neuronali localizzate alla membrana sinaptica o post-sinaptica densità di sinapsi deve essere estratto usando IGEPAL CA-630, tuttavia alcuni possono non solubilizzare completamente, e può richiedere l'uso di un diverso non denaturante detergente come Triton X-100, che ha stati precedentemente utilizzati per ABE chimica 2, 8.

Descrizioni Diversi ABE chimica hanno anche utilizzato un diverso tiolo reattivo reattivo biotinilazione dalla molecola che descriviamo qui, chiamato biotina-HPDP (Thermo Scientific), che richiede anche un modo diverso di purificazione della proteina 4. Biotin-HPDP è un'altra tiolo reattivo, maliemide-coniugato biotina molecola che contiene un legame disolfuro nel braccio linker maliemide, strutturalmente differentiating da biotina-BMCC, che non contiene tale legame disolfuro. Seguendo tiolo-biotinilazione di cisteina libera o palmitoilato una proteina da Biotin-HPDP, il legame disolfuro risultante tra la proteina bersaglio e il gruppo biotina può essere scisso riducendo reagenti per rilasciare il gruppo biotina e rigenerare la proteina nella sua forma originale, rendendo biotinilazione di Biotina-HPDP transitorie e reversibili. Pertanto, l'uso di questo reagente biotinilazione richiede purificazione di una proteina bersaglio con reagenti immobilizzati avidina, streptavidina come perle rivestite. Tuttavia, tiolo-biotinilazione di una proteina bersaglio con biotina-BMCC, come descritto qui, è stabile e relativamente permanente, e richiede la purificazione della proteina bersaglio con un anticorpo diretto contro il bersaglio, e immobilizzato su perline sefarosio. Entrambe le tecniche ABE sono stati precedentemente utilizzati per grandi schermi, e il rilevamento di palmitoilazione di proteine ​​singole 2, 8-10, 12, e laIP-ABE test che descriviamo qui è ottimale per la rilevazione rapida di palmitoilazione di singole proteine ​​bersaglio neuronali.

La stragrande maggioranza dei palmitoilazione cellulare comporta l'aggiunta reversibile palmitato al gruppo tiolo di cisteine ​​(chiamato S-palmitoilazione, che generalizziamo come 'palmitoilazione' in questo protocollo), ma un gruppo molto limitato di proteine ​​sono soggette a palmitoilazione irreversibile a glicina residui di cisteina e attraverso la formazione di legami ammidici stabili, chiamato N-palmitoilazione 13. Una limitazione di ABE chimica è la sua incapacità di rilevare N-palmitoilazione causa della stabilità del legame ammidico, e così lo screening di una proteina nuovo bersaglio per palmitoilazione dovrebbe essere confermata usando 3H-palmitato marcatura metabolica 1.

Come precedentemente accennato, il IP-ABE dosaggio può essere facilmente adattato per l'esame palmitoilazione in estratti proteici da molteplici fonti, comprese transfected linee di cellule eterologhe, il tessuto primario e colture primarie neuronali provenienti dalle regioni cerebrali multiple. L'IP-ABE test è stato utilizzato per l'esame della sufficienza palmitoilazione mutati cisteina-to-serina proteine ​​per identificare la posizione di una cisteina palmitoilato lungo una proteina bersaglio 8, per l'esame fatturato dinamica palmitato sulle proteine ​​sinaptiche in neuroni in coltura in condizioni basali 10, e cambiamenti nei livelli di proteine ​​neuronali palmitoilazione dopo induzione dell'attività neuronale 9. La sensibilità e l'adattabilità della IP-ABE test rendono ideale per l'esame di profili palmitoilazione di proteine ​​neuronali, e ottimale per la rilevazione di cambiamenti dinamici in palmitoilazione.

Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal Canadian Institutes of Health Research MOP-81158.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IGEPAL CA-630 Sigma I8896
PMSF Fluka 93482
Protease Inhibitor Cocktail Roche Complete Mini 11 836 153 001
NEM Sigma E3876
HAM solution Sigma 46780-4
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 Ensure compatibility with chosen detergent
Protein G/A-coated sepharose beads GE Healthcare 17-6002-35
Biotin-BMCC Thermo Scientific 21900
Streptavidin-HRP Thermo Scientific 21126 Reconstitute at 1 mg/ml in water
Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 21059

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 161-175 (2010).
  2. Kang, R., et al. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation. Nature. 456, 904-909 (2008).
  3. Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 36, 276-285 (2004).
  4. Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nat. Protoc. 2, 1573-1584 (2007).
  5. Xie, C., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Survival of hippocampal and cortical neurons in a mixture of MEM+ and B27-supplemented neurobasal medium. Free Radic. Biol. Med. 28, 665-672 (2000).
  6. Drisdel, R. C., Alexander, J. K., Sayeed, A., Green, W. N. Assays of protein palmitoylation. Methods. 40, 127-134 (2006).
  7. Eslami, A., Lujan, J. W. estern Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
  8. Huang, K., et al. Neuronal palmitoyl acyl transferases exhibit distinct substrate specificity. FASEB J. 23, 2605-2615 (2009).
  9. Noritake, J., et al. Mobile DHHC palmitoylating enzyme mediates activity-sensitive synaptic targeting of PSD-95. J. Cell Biol. 186, 147-160 (2009).
  10. Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 Targets GRIP1 to Dendritic Endosomes to Regulate AMPA-R Trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
  11. Hayashi, T., Thomas, G. M., Huganir, R. L. Dual palmitoylation of NR2 subunits regulates NMDA receptor trafficking. Neuron. 64, 213-226 (2009).
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  13. Iwanaga, T., Tsutsumi, R., Noritake, J., Fukata, Y., Fukata, M. Dynamic protein palmitoylation in cellular signaling. Prog. Lipid Res. 48, 117-127 (2009).

Comments

7 Comments

  1. please ,what is the stringent buffer ? What reagents should I prepare?

    Reply
    Posted by: 李 î
    August 28, 2013 - 3:09 AM
  2. Hello,
    The stringent buffer is described in Table 1, 3rd buffer from the top. The description reads "In LB: 10 mM MEM 0.1% SDS," however there is typo and should read "In LB: 10mM NEM + 0.1% SDS." NEM refers to N-ethymaliemide, which we describe in the protocol. SDS refers to sodium dodecyl sulfate, a common laboratory reagent, and powerful ionic detergent. Add SDS to LB containing 10mM NEM to achieve a final concentration of 0.1% of the total volume. Perform the wash step (step 3.4) quickly, as we describe above, as the SDS could result in the removal of the target protein from the antibody-bead immunocomplex if incubated to long. Thank you for your interest in the our protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    August 28, 2013 - 6:04 PM
  3. please,I want to kown that if my cell is suspended cells,what can I do about the Extraction of Target Protein ? especially,the amount of the LB+50mM NEM. THANK YOU!

    Reply
    Posted by: 李 î
    September 2, 2013 - 2:22 AM
  4. Hello,
    The IP-ABE assay should work fine for a suspended cell culture. The section of the protocol pertaining to the harvesting and extraction (steps 1.1-1.8) of the target protein works in a manner similar to the extraction of any target protein for the purposes of immunoprecipitation. Begin by growing your cells to the confluence and density in suspension that you desire, and then simply spin down (e.g. 3000 x g/ 5 minutes) to collect the cells in a pellet. Next, simply re-suspend the cells in lysis buffer supplemented with 50mM NEM, and proceed with the remainder of the protocol as we describe. Some important considerations should be paid to your choice of detergent for extracting the target protein. We recommend the use of IGEPAL-CA 630, a non-ionic detergent suitable for the extraction of membrane-associated proteins, and which can extract palmitoylated fractions of neuronal proteins localized to synapses of cultured hippocampal neurons. Triton X-100 is a similar detergent, and is also highly utilized to extract palmitoylated proteins. We would not recommend using an ionic detergent (e.g. SDS), as this will denature the protein and may hinder the immunoprecipitation efficiency of your chosen antibody, and may degrade the palmitoylation signal. You will also want to choose an antibody suitable for immunoprecipitation of your target protein. We recommend that you refer to your lab's standard protocol for immunoprecipitating a target protein from suspended cell culture, and simply supplement your lysis buffer with 50mM NEM and proceed with the ABE assay as we describe. Please refer to the discussion section of our protocol for more information regarding choice of detergents. Thank you again for your interest in our protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    September 2, 2013 - 4:32 PM
  5. sorry ,I also confused about the Extraction of Target Protein of suspended cells, a problem is how do I control the amount of the LB+50mM NEM ? whether should I determine its amount based on the amount of my cells or refer your protocol to add 300μl ?

    Reply
    Posted by: 李 î
    September 3, 2013 - 3:14 AM
  6. Hello,
    I recommend that you determine the total volume of lysis buffer to use for harvesting according to the amount of cells you use as a starting point. As long as you maintain the concentration of 50mM NEM within your lysis buffer, the total volume can change depending upon your needs. The volume we used in the protocol was based upon harvesting protein from at least 3 wells of a standard 6-well dish containing hippocampal neurons, however I imagine you will want to adjust the volume you use for harvesting from suspended cells. In general, it is best to obtain a high total protein concentration within the lysis buffer, and so I recommend that you use the minimal volume of lysis buffer necessary to sufficiently extract your target protein. In my past experience working with adherent cell cultures and the IP-ABE assay, approximately 50-100uL of lysis buffer / 1.0 x 10^6 cells was sufficient for adequate protein extraction and achieving a high protein concentration. I suggest that you begin by determining the number of cells required for at least 500ug total protein / IP sample, and start with a smaller volume of lysis buffer (up to 500uL total, per sample). Once you spin down and pellet your suspended cells in a conical tube, you should be able to visualize an approximate volume that will suffice. We wish you the best of luck with the protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    September 3, 2013 - 2:11 PM
  7. Hello,
    I tried the protocol with your protein as a positive control but I can't see any signal for palmitoylation. I noticed I used Protease Inhibitor Cocktail ultra which not contain EDTA compare to your. I used the 2x Laemmli Sample Buffer from Biorad (glycerol 20-35%, SDS 1-2.5%, water 50-100%) and I add DTT. Is this may be the reason it didn't work ?

    Reply
    Posted by: Nicolas P.
    September 25, 2016 - 12:34 AM

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