В режиме реального времени Живая съемка Т-клеточного сигнального комплекса Формирование

* These authors contributed equally
Immunology and Infection
 

Summary

Опишем живых клеток изображений методом, который дает представление динамики белков в процессе активации Т-клеток процесса. Мы демонстрируем комбинированное применение Т-клеточного анализа распространения, конфокальной микроскопии и анализа изображений для получения количественных результатов следовать сигнального комплекса формированием на протяжении активации Т-клеток.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Noy, E., Pauker, M. H., Barda-Saad, M. Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation. J. Vis. Exp. (76), e50076, doi:10.3791/50076 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Т-клеточные Трансфекцию

  1. Подготовьте активированный Amaxa Nucleofector решение путем смешивания комплекта "Приложении" решение Nucleofector решения. Активированный раствор можно хранить при 4 ° С в течение трех месяцев.
  2. Grow Jurkat Т-клеток в культуральной среде [10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 1% пенициллина-стрептомицина решение, и 2 мМ L-глутамина в среде RPMI]. Оптимально, клетки должны быть использованы через 1-2 недели после оттаивания. Использование культур клеток в логарифмической фазе роста имеет решающее значение для высокой эффективности трансфекции и выживание клеток. Кроме того, с незначительными изменениями, этот протокол может быть использован с первичным Т-клеток, как описано выше 8. Следует подчеркнуть, что, как продолжительность процесса активации первичных Т-клеток больше, чем у Jurkat Т-клеток (~ 30 мин), предметный столик микроскопа установлен инкубации система должна быть использована для поддержания CO 2, уровень влажности и температуры в течение Процесс активации.
  3. Соберите 5× 10 6 лог-фазы Т-клеток в трансфекции в 15-мл пробирку.
  4. Центрифуга клетки в течение 7 минут при 400 х г при комнатной температуре.
  5. Во время центрифугирования, готовят 6-луночный планшет. Заполните одну скважину для каждой трансфекции с 5 мл культуральной среды и предварительно инкубируют при 37 ° С.
  6. Собирать трубы из центрифуги и отбросить супернатант. Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл среды RPMI.
  7. Центрифуга клетки в течение 7 минут при 400 х г при комнатной температуре.
  8. Во время центрифугирования, готовить раствор для трансфекции. В одну лунку 96-луночного планшета, смешивать активированный 100 мкл Amaxa Nucleofector раствор, полученный на стадии 1, с 5 мкг ДНК плазмиды интерес кодирующую флуоресцентно меченого белка. Оптимально концентрации ДНК должна быть больше, чем 1 мкг / мл, чтобы избежать разбавлением раствор для трансфекции.
  9. Хорошо перемешайте, осторожно пипеткой.
  10. После центрифугирования клеток, осторожно удалить все супернатанта а не гisturbing гранул.
  11. Внесите ДНК / трансфекции раствор дважды.
  12. Добавить ДНК / трансфекции решение гранул.
  13. Передача клетки Amaxa кюветы.
  14. Вставьте кювету в устройстве Amaxa Nucleofector.
  15. Используйте H-10 Amaxa трансфекции настройки для электропорации (для Jurkat) или Т-23 (для первичных Т-клеток).
  16. Удалить 6-луночный планшет из инкубатора.
  17. После электропорации, тщательно передачи супернатанта клеточной суспензии в 6-луночный планшет помощью пипетки Пастера. Осадок, состоящий из остатков клеток могут образовывать. Избегать передачи гранул.
  18. Клетки инкубируют в течение 24 ч при 37 ° С.
  19. Передача 2,5 мл суспензии клеток из каждой лунки в новой скважины. Добавить 2,5 мл теплой культуральной средой (описан на стадии 2) в каждую лунку.
  20. После 72 ч, перенос клеток в стерильную пробирку и центрифугировали 7 мин при 400 х г при комнатной температуре. Удалите супернатант и заменить его Wiй культуральной среде, содержащей антибиотик млекопитающих выбора ячейки подходит для плазмиды, использованной (применить концентрации, пригодной для антибиотиков, используемых, мы использовали G418 и / или гигромицину в концентрации 1,3 мг / мл и / или 0,2 мг / мл, соответственно). Культуры суспензию клеток в свежей хорошо. Кроме того, клетки могут быть трансфицированы временно и отображаемого 48 часов после трансфекции. Для подготовки временной трансфекции клетки, со-трансфекции клеток с двух плазмид одновременно на этапе 8, продолжается обычно на шаг 20, а затем перейдите непосредственно к шагу 23. Обратите внимание, что при таком сценарии, клетки следует использовать сразу, да и вообще их интенсивность флуоресценции гетерогенных и не обязательно высокой.
  21. Рост клеток в культуральной среде, содержащей соответствующий антибиотик выбора. Сплит клетки и дополнить их антибиотикам дополнен культуральной среде по мере необходимости.
  22. Через 2 недели проверки успешной трансфекции с использованием FACS (гриппценции активированный сортировки клеток) следующим образом:
  23. Собирают 10 6 трансфицированных клетках, 10 6 макет трансфицированных клеток (отрицательный контроль) и 10 6 клеток, которые, как известно, стабильно экспрессируют флуоресцентно меченого белка. Если клетки трансфицируют с более чем одним флуоресцентный белок (см. шаг 27), используют несколько, однократно помеченный клеточных линий в качестве положительного контроля.
  24. Центрифуга клетки в течение 7 минут при 400 х г при комнатной температуре.
  25. Удалите супернатант. Ресуспендируют клеток в 500 мкл буфера FACS (PBS без Са 2 + и Mg 2 +, 5% FCS, 0,05% азида натрия).
  26. Использование аналитических FACS для проверки сотовые флуоресценции. Сравнение флуоресценции трансфицированных клеток, что и отрицательный и положительный контроли.
  27. Для трансфекции клеток с дополнительным флуоресцентно меченого белка, повторите шаги 3-26 использовании трансфецированных клеток.
  28. Клетки отображения высокие уровни флуоресценции должны быть использованы. Оптимально, по крайней мере, 50%клеток в культуре должны быть очень флуоресцентные. Сотовые флуоресценции может быть увеличена путем сортировки клеток с помощью FACS.

Любые дополнительные меченных белков должна быть слита с разными флуорофорами и быть закодированы на плазмиды, кодирующие различные антибиотики для выбора. Выбор среды для клеток, трансфицированных более одного плазмида должна быть дополнена все соответствующие антибиотики.

2. Т-клеточного анализа Подготовка Распространение

  1. Используйте Lab-Tek II немецкой системы покровного стекла 4 слайдов камеры. Убедитесь, что не случайно поцарапать внутреннюю поверхность камеры, например, с кончика пипетки, во время подготовки или использования.
  2. Подготовка 50 мл раствора препарата слайд: Возьмите 4,6 мл 12 м (37%) HCl, добавляют 38,5 мл 100% этанола и 6,9 мл дважды дистиллированной воды.
  3. Заполните каждую палату слайд с 500 мкл раствора подготовке слайдов.
  4. Инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
  5. Аспирируйте камерыс, сушки их полностью.
  6. Выдержите непокрытый слайды в течение 1 часа при 45 ° С до полного высыхания.
  7. Подготовьте 0,01% поли-L-лизина путем разбавления 0,1% поли-L-лизина (Sigma-Aldrich) в дважды дистиллированной воде.
  8. Применить 500 мкл в каждую камеру.
  9. Инкубируйте слайдов в течение 15 мин при комнатной температуре.
  10. Аспирируйте камер, сушки их полностью.
  11. Выдержите в течение 3 ч при 45 ° С до полного высыхания.
  12. Покрытием слайды можно хранить сухими в течение нескольких месяцев при комнатной температуре.
  13. Подготовьте решение активирующих антител. Используйте антитела против CD3: либо HIT3a (BD Pharmingen, # 555337) или UCHT1 (BD Pharmingen, # 555330), 10 мкг / мл в 400 мкл PBS, на камеру. Это решение должно быть подготовлено незадолго до слайд подготовки.
  14. Заполните каждую камеру с 400 мкл активирующий раствор антител.
  15. Инкубируйте слайдов в течение 2 часов при температуре 37 ° C или, предпочтительно, в течение ночи при 4 ° С.
  16. Снимите активирующих антител Solution и немедленно промойте камеру дважды 300 мкл PBS. С этой точки, убедитесь, что камера остается заполненным буфером.
  17. Храните PBS заполненный слайд при 4 ° C. Мы предлагаем использовать подготовленных камер слайд в течение 1 недели.

3. Активацию Т-клеток и обработка изображений

  1. Подготовка изображений буфер [1,25 HEPES мл (1 М), 10 мл FCS, 38,75 мл RPMI без фенола красного]. Изображений буфера можно хранить при температуре 4 ° С после фильтрации.
  2. Активируйте Zeiss LSM 510 Мета микроскопом. Теплый микроскопом обогреваемый монтажной рамы до 37 ° C. Выберите "Режим эксперта".
  3. Нажмите кнопку "Получить" на вкладке и открыть следующие вкладки: лазеров, микроскопия; конфигурации; сканирование; временных рядов.
  4. Активируйте необходимы лазеры. Для возбуждения и MCFP mYFP, установите аргон / 2-лазера на "ожидания" в течение 5 мин, затем в положение "ON".
  5. Если вы выполнили эту живых клеток до анализа изображений, используя те же флуорофорам, откройте полученный файл LSM, нажмите кнопку "повторное использование" яCon, и перейдите к шагу 9. В противном случае перейдите к шагу 6.
  6. Определение каналов с использованием фильтров подходящей для возбуждения и излучения флуоресцентного белка использовали.
  7. В "Scan управления", выберите опцию Z стека.
  8. Введите следующие параметры сканирования: Количество слоев: 5; Интервал: 0,5 мкм; текущий разрез: 3.
  9. Подготовка Твердотелый термостат AccuBlock (Labnet) при 37 ° С около микроскопом.
  10. Теплый изображений буфера до 37 ° C.
  11. Подготовьте хранятся слайды путем аспирации PBS, заменив ее 600 мкл буфера теплой изображений.
  12. Выдержите слайд при 37 ° С. Держите слайд в инкубаторе до шага 13, в течение 15 мин.
  13. Собирают 5 × 10 5 трансфицированных Т-клеток.
  14. Центрифуга клетки в течение 2 мин при 400 х г.
  15. Удалите супернатант.
  16. Ресуспендируют клеток в 1 мл теплой буфер изображений, и передавать их в 1,5 мл трубки Эппендорф.
  17. Поместите тПредполагаемое трубку на Твердотелый термостат AccuBlock.
  18. Возьмите нагретый слайд из инкубатора, и установите его на утепленной микроскопом монтажной раме.
  19. Нажмите кнопку "VIS" икону.
  20. Смешать клеточной суспензии и удалить 1-2 мкл.
  21. Вставьте кончик пипетки в буфер визуализации выше нижней части слайда. Избегайте царапин слайде.
  22. Семенной клеток в течение Диафрагма цель автора.
  23. Немедленно начать визуального отслеживания флуоресцентных клеток, как они спускаются. Выделите ячейку, которая отображает высокую флуоресценцию в обоих каналах.
  24. Перед клетка достигает поверхности ползуна, активируют LSM режиме.
  25. Переключить только один лазерного возбуждения. Выберите лазер для которого у вас есть DIC канала.
  26. Задайте зум до 1. Нажмите кнопку "Быстрая XY" икону. Нажмите кнопку "Стоп" икону. С помощью инструмента обрезки, выберите ROI по центру ячейки.
  27. Задайте зум до 3. Нажмите кнопку "Быстрая XY" значок, а затем вручную установить фокус для оптимального просмотра клетке. Нажмите кнопку "Стоп" ICON.
  28. Переключите все необходимые лазеров возбуждения.
  29. Начните запись, нажав кнопку "StartT" икону. Изображение ячейки для полноты распространение процесса (обычно 5 мин). Когда закончите, нажмите кнопку "Стоп" икону.
  30. Сохраните файл.
  31. Для приобретения дополнительных ячеек, нажмите кнопку "VIS" икону. Если есть клетки, которые еще не вступили в контакт с нижней слайда, перейдите к шагу 23. Избегайте изображений клеток, которые уже начали процесс распределения. В противном случае перейдите к шагу 32.
  32. Если наблюдаемая область слайда в основном без клеток, добавьте еще аликвоты клеток (далее с шагом 20). В противном случае перейдите к шагу 33.
  33. Для получения дополнительных ячеек, перемещение слайдов таким образом, что область над отверстием целью является лишенной клеток.
  34. Добавить другой аликвоты клеток (и перейдите к шагу 20).
  35. После выполнения всех нужных изображений, открыть сохраненный файл LSM.
  36. Нажмите кнопку "Галерея", "Время + Z" и "подмножество".
  37. Выберите relevanT диапазона времени и Z стека.
  38. Сохраните новый файл.
  39. Выполните шаги 35-38 для всех файлов изображений.

4. Анализ данных изображений

  1. Откройте файлы с помощью LSM Imaris программное обеспечение (Bitplane AG, Цюрих Швейцария).
  2. Нажмите кнопку "превзойти". Нажмите кнопку "Обработка изображений" меню и выберите "Поменять Время и Z". Это поможет в правильной обрезки изображения.
  3. Нажмите кнопку "Изменить" на панели инструментов и выберите "Урожай 3D" вариант в раскрывающемся меню. Обрезать изображение, чтобы включать только области, окружающей клетку. Мы предлагаем обрезки 300 × 300 пикселов сосредоточены на квадратные клетки. Обратите внимание, что форма и расположение клетке может меняться с течением времени. Наблюдая оси Т, убедитесь, что ячейка находится в обрезанную область во всех временных точках.
  4. Нажмите кнопку "Обработка изображений" меню и выберите "Поменять Время и Z", чтобы восстановить оригинальное временное разделение изображения.
  5. Нажмите кнопку "Coloc" кнопки на главной панели инструментов. Выберите "Разработка Deр. Coloc ". Imaris автоматически вычисляет интенсивность пороговые значения для каждого канала в каждый момент времени.
  6. Просмотр результатов анализа колокализации, выбрав "Channel Statistics". Экспорт данных, нажав кнопку "Экспорт".
  7. Повторите шаги с 1 по 6 для каждой отображаемой ячейки. Мы рекомендуем, чтобы по крайней мере 50 клеток быть проанализированы таким же образом.
  8. Вычислить средний коэффициент колокализации Пирсона и его стандартная ошибка или отклонения.

Representative Results

Приведем пример живой Т-клеточной визуализации и анализа. До изображений эксперимент, SLP76 дефицитный Т-клеток (J14) анализировали с помощью FACS для определения экспрессии флуоресцентного белка (Рис. 1). Т-клетки трансфицировали отмеченных сигнальных белков MCFP-Nck и SLP76-mYFP наносились по активации слайдов и отображаемого во время Т-клеток с расширением спектра (рис. 2). Собранные изображения показывают динамику локализации белков в течение активации и распространения (рис. 3). Компьютерная обработка изображений обеспечивает новые проницательности и количественную информацию от визуализированных клетки, при сведении к минимуму человеческие ошибки. Чтобы исследовать колокализации двух белков по всей сотовой процесс активации, мы использовали колокализации инструмент Imaris программное обеспечение (Bitplane AG, Цюрих Швейцария). При сравнении колокализации коэффициентов между различные моменты времени через отображаемого клетки, мы возможность убедиться, что колокализации Nck SLP76 и существенно не изменяется в течение активации Т-клеток (р> 0,3) (рис. 4).

Рисунок 1
Рисунок 1. FACS-анализ клеток, трансфицированных двойной флуоресцентно меченых белков Данные представлены в виде гистограмм интенсивности флуоресценции для (А) MCFP;. (B) mYFP, и (С), как участок точкой. Интенсивность флуоресценции J14 клетках, трансфицированных MCFP-Nck и SLP76-mYFP представлены в голубой и желтый соответственно. Нетрансфецированной J14 отрицательные контрольные клетки, обозначены черными линиями.

/ Files/ftp_upload/50076/50076fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Схематическое изображение живых Т-клеточного анализа распространения (A) подготовка Т-клеточного слайды активация;. (B) живут Т-клеточного анализа распространения и анализа;. (C) микроскопии настройки Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 3
Рисунок 3. Распределение Nck и SLP76 во время Т-клеточной активации. Клетки, экспрессирующие MCFP-Nck и SLP76-mYFP были сняты на анти-CD3 антитело, стимулирующее предварительно покрытых покровные и постоянно отображаемого в течение 7 мин. MCFP-Nck представлена ​​голубого, в то время как SLP76-mYFP показано на желтый.


Рисунок 4. Количественный анализ белка колокализации. Обработки изображений клеток проводили с использованием программного обеспечения Imaris (Bitplane AG, Цюрих, Швейцари). Колокализации рассчитывается как коэффициент корреляции Пирсона между интенсивностями канала MCFP и mYFP канал для каждого пикселя. Пирсона колокализации коэффициенты, вычисленные из различных точках времени сравниваются. Тридцать секунд в процессе активации, колокализации коэффициент MCFP-Nck и SLP76-mYFP значительно увеличилась (р <0,05). Эти результаты были рассчитаны на основе анализа> 50 независимых клеток. Среднее ± стандартная ошибка показаны.

Discussion

Регулирование и функции нескольких клеточных процессов зависит от формирования и прекращения белок-белковых взаимодействий. Микроскопические изображения позволяет в реальном времени отслеживать флуоресцентно меченных белков в живых клетках. Колокализации меченных белков можно предположить прямое или косвенное взаимодействие между белками и могут быть использованы для укрепления данные, полученные биохимическими методами, такими как иммунопреципитации. В отличие от биохимических методов, живых клеток изображения позволяет эти взаимодействия белковых взаимодействий, которые должны соблюдаться в пространстве и во времени, для облегчения контроля физиологических процессов, как они происходят и обнаружение клеточное распределение белков. Различные инструменты для количественного анализа колокализации были разработаны; коэффициент корреляции Пирсона остается очень привлекательным и широко доступным методом количественной оценки степени колокализации двух белков 12. В то время как флуоресценция электронной резонансNergy переводом (лад) эксперименты позволяют обнаруживать меж-белковых взаимодействий характеризуется непосредственной близости (10 нм), этот метод требует специальной настройки (оборудование и совместимость люминесцентные оснащения используются) и комплексной обработки данных. Для большинства применений, колокализации анализа, в сопряжении с биохимическими методами, представляет собой простую в использовании и простой метод наблюдения белок-белковых взаимодействий с течением времени.

Создание флуоресценции порог по интенсивности для анализируемых пикселей, игнорируя пикселей ниже пороговой интенсивности для любого канала, имеет решающее значение для точного и чувствительного колокализации анализа. Широко используемым алгоритмом для объективного и автоматизированного определения этих порогов был разработан Costes соавт. 13 и осуществляется обработка изображения программ, таких как Imaris и Volocity.

Здесь показано использование живых Т-клеток мнимойIng метод анализа динамики SLP76, ключевой эшафоте в Т-клетках, и Nck, адаптер белка, оба из которых имеют важное значение для активации Т-клеток 14,15. Изображения Т-клеток, собранных в ходе активации предполагают, что два белка локализуется по всей сотовой процесса активации (рис. 3). Это количественно подтверждается выполнением колокализации тест Пирсона изображений собранных на протяжении процесса активации. Колокализации Пирсона коэффициенты диапазоне от -1 до 1, где счет -1 означает анти-корреляция, 1 балл означает идеальное колокализации и 0 означает отсутствие корреляции между этими двумя каналами изображения. Сравнение колокализации коэффициенты Пирсона рассчитаны для различных моментов времени и для разных клетках показывает, что колокализации Nck и SLP76 существенно не изменится во время клеточной активации, но остается постоянной (р> 0,3, рисунок 4). Хотя в целом сотрудничество колокализацииэффективным из этих белков не меняется на протяжении процесса активации, это не исключает возможности динамического процесса ассоциации и диссоциации, происходящих между этими белками 18.

Протокол мы представили также может быть адаптирован для других гемопоэтических клеточных линий, регулируя роста клеток условиях, необходимо, выбора трансфекции установка для клеточной линии в вопросе и модификации клеточной активации процесса, если это применимо. Обратите внимание, что в то время как мы использовали LSM 510 Мета конфокальной микроскопии, с соответствующими корректировками и использование параметров, другими конфокальной микроскопии системы могут быть успешно использованы также.

Использование живых Т-клеточного изображения позволяет нормативных и активации процессов, которые будут непосредственно контролироваться, позволяя сигнальных событий быть изучены с временным и пространственным разрешением недоступности с помощью биохимических и молекулярных методов. Мы представляем простой метОД для проведения живых Т-клеток распространение анализ, мониторинг соответствующих белков в режиме реального времени и анализа данных для получения количественных результатов. В результате данные микроскопии, также могут быть использованы для других последующих применений, таких как сотовые формы индексного анализа 16 и FRET анализ 17,18, в зависимости от конкретной экспериментальной установки и исследовательских целей.

Disclosures

У нас нет конфликта интересов раскрывать.

Acknowledgments

Авторы выражают благодарность Софии Жареные за техническую помощь. MBS благодарит за учреждениям за их поддержку исследования: научный фонд Израиля на гранты no.1659/08, 971/08, 1503/08 и 491/10, Министерства здравоохранения и науки на гранты нет. 3-4114 и 3-6540, Израиль ассоциации рака через усадьбу покойного Александра Smidoda и Фонда Taubenblatt Семья для био-медицины совершенству гранта.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Amaxa human T Cell nucleofector kit Lonza VCA-1002
Anti CD3 (UCHT1 clone) BioLegend 300432
Falcon FACS Tubes Becton Dickinson 352058
FCS HyClone SV30160.03
G418 Calbiochem 345810
German coverglass system 4 chamber slides Lab-Tek II 155382
HCl Bio Lab 8410501
Hepes Biological Industries 03-025-1B
Hygomycin Enzo ALX-380-306
L-glutamine Sigma G7513
PBS (10X) Sigma D1408
Penicillin-Streptomycin Sigma P0781
Poly-L-lysine 0.1 % (w/v) in H2O Sigma P8920
RPMI Sigma R87589
Sodium azide Sigma S2002
Equipment
Accublock digital dry bath Labnet D1105A
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810 R
Confocal microscope Zeiss LSM 510 Meta
Heatable mounting frame - Heating Insert P S PeCon 130-800-031
TempModule S (required for the heatable mounting frame) Zeiss 411860-9010-000
Electroporation device Amaxa Nucleofector I
Fluorescence activated cell sorter Becton Dickinson FACSVantage SE
Image analysis software Bitplane 7.0.0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Viret, C., Janeway, C. A. MHC and T cell development. Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).
  2. Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity. J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).
  3. Doherty, P. C. Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity. Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).
  4. Jager, D., Jager, E., Knuth, A. Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer. J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).
  5. Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
  6. Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. The actin cytoskeleton in T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).
  7. Reicher, B., Barda-Saad, M. Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network. FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).
  8. Barda-Saad, M., et al. Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton. Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).
  9. Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
  10. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
  11. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
  12. Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient. Cytometry A. 77, 733-742 (2010).
  13. Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).
  14. Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity. J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).
  15. Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).
  16. Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization. Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).
  17. Barda-Saad, M., et al. Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization. EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).
  18. Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics