Aislar y inmunoticción Los linfocitos y las células dendríticas de las placas de Peyer murinas de

Immunology and Infection

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Summary

Existe un creciente interés en la comprensión de las funciones inmunológicas de subpoblaciones específicas de células en las placas de Peyer (PP), los sitios primarios de inducción de los tejidos linfoides asociados al intestino. Aquí resumimos los protocolos paralelos para preparar PP preparativos de célula única para el análisis de citometría de flujo y cryosections PP para inmunoticción.

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De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches. J. Vis. Exp. (73), e50167, doi:10.3791/50167 (2013).

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Abstract

Placas de Peyer (PP) son componentes integrales de los tejidos linfoides asociados al intestino (GALT) y desempeñan un papel central en la vigilancia inmunológica intestinal y la homeostasis. Antígenos particulados y los microbios en el lumen intestinal son continuamente muestreados por células M del PP en el epitelio del folículo asociado (FAE) y se transporta a una red subyacente de células dendríticas (DCs), macrófagos, y linfocitos. En este artículo, se describen protocolos en la que PP murinos son (i) disociaron en suspensiones de células individuales y se sometieron a citometría de flujo y (ii) preparado para crioseccionamiento y inmunotinción. Para citometría de flujo, los PP son disociaron mecánicamente y después se filtró a través de membranas de 70 micras para generar suspensiones de células individuales libres de células epiteliales y los desechos grandes. Comenzando con 20-25 pps (de cuatro ratones), este método rápido y reproducible permite obtener una población de> 2,5 x 10 6 células con> 90% la viabilidad celular. Para cryosectioning, frescoPPs ly aislados se sumergen en una temperatura óptima de corte (OCT) medio, snap-congelado en nitrógeno líquido, y luego seccionado utilizando un criomicrotomo. Las secciones de tejido (5-12 micras) se secan al aire, se fijaron con acetona o metanol, y después se somete a inmunomarcaje.

Introduction

Placas de Peyer (PP) son agregados macroscópicos de organizados folículos linfoides presentes en todo el intestino delgado de los seres humanos y ratones (Figura 1) y que constituyen los sitios primarios en el que respuestas inmunes mucosales son iniciadas contra antígenos de la dieta, las bacterias comensales, agentes patógenos, y vacunas orales 1-4. A diferencia de otros tejidos linfoides periféricos, tales como los ganglios linfáticos mesentéricos, PP carecen de vasos linfáticos aferentes. Como tales, las respuestas inmunes adaptativas en EPA son accionados en respuesta a antígenos derivados de la luz intestinal. La toma de muestras de antígenos luminales se lleva a cabo por el epitelio del folículo-asociado (FAE), que consta tanto de los enterocitos y células de muestreo de antígeno conocidas como células M. Debajo de la FAE, en la cúpula de sub-epitelial (SED) región, se encuentra una red de células dendríticas (DCs), entremezcladas con los macrófagos, células B, y células T CD4 + 5-9. En el núcleo de cada follicl linfoide PPe son células dendríticas foliculares (CDF) y una rica en células B del centro germinal central, flanqueado por zonas interfoliculares T rico en células. Muestreo de antígeno por los resultados de PPS en el desarrollo de IgA plasmablasts celulares + B y las células CD4 + efectoras y de memoria que la semilla de la propia lámina circundante y proporcionar inmunidad contra una amplia variedad de invasores mucosas.

Disección de los eventos inmunológicos complejos asociados con el muestreo de antígeno, la elaboración y presentación de los PP es una tarea de enormes proporciones, considerando que las células PP constituyen sólo una pequeña fracción del total de células linfoides en la mucosa intestinal. Para ayudar en la caracterización in vitro de las células en este medio, se proporciona un protocolo para la preparación total de células de ratón PP para el análisis de citometría de flujo y funcionales, así como un protocolo para la preparación de PP criosecciones para microscopía de inmunofluorescencia y inmunohistología. Nuestro protocolo para el aislamiento, caracterización y inmunotinción de mouse las células del PP no es nueva en sí misma, como lo demuestra el hecho de que hay numerosas referencias datan de hace más de 25 años que citan estas técnicas 5,6,9-11. Más bien, el protocolo proporciona un aerodinámico (y visual) método para investigadores recogida PPs por primera vez. Las técnicas descritas se domina fácilmente y producir fácilmente grandes cantidades de células con> 90% la viabilidad celular. El protocolo cryosectioning produce secciones en serie altamente reproducibles idealmente adecuados para la tinción de inmunofluorescencia y la imagen confocal. Por otra parte, el protocolo complementa otros dos artículos recientes Jove. El primero, por Fukuda et al, describe el uso de ensayos de ligadura del asa ileal para evaluar la absorción de las bacterias patógenas por células M del PP 12. La otra, por Geem y colegas, describe el aislamiento y caracterización de las DCs y macrófagos de la mucosa intestinal del ratón, pero excluye explícitamente PPs de su análisis 13.

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Protocol

Los animales fueron alojados en virtud convencionales, libres de patógenos específicos condiciones y fueron tratados en el pleno cumplimiento de Cuidado de Animales institucional del Centro Wadsworth y el empleo directrices del Comité (IACUC).

1. Sonda oral

  1. (Opcional) Gavage cepa de ratón de elección con el antígeno o los microbios de interés utilizando un G-22 en x1.5. extremo romo alimentación aguja (Popper Scientific, New Hyde Park, NY). Volúmenes de entrega no debe superar los 400 l por ratón.

2. Aislamiento de células de PP para Citometría de Flujo

  1. Eutanasiar ratones por asfixia de CO 2, según el Cuidado de Animales institucional y el empleo directrices del Comité (IACUC).
  2. Limpiar el abdomen con 70% de etanol o betadine antes de la cirugía. Realizar una laparotomía estándar que implica una única (1 cm) incisión utilizando tijeras quirúrgicas de grado a lo largo de la línea media principio sobre 1,5 cm de la base de la caja torácica. Exponer al porcavidad itoneal e identificar el ciego. Corta el intestino delgado terminal en la unión ileal-cecal y retire con cuidado el intestino en su totalidad. Tener cuidado de no extender demasiado el tejido intestinal a medida que se retira de la cavidad peritoneal.
  3. Coloque el intestino delgado en una cama de toallas de papel húmedas o Kimwipes. Mojar el intestino delgado suavemente con solución salina para evitar la deshidratación del tejido. Identificar visualmente PPs individuales situados en el lado anti-mesentérico del intestino (Figura 1). Típicamente, un único ratón tiene de 5 a 10 pps visibles que están distribuidas de manera uniforme desde el duodeno (proximal) de íleon (distal). En promedio, los ratones cuatro producirá 23 PP.
  4. Uso de curvas tijeras quirúrgicas, PPS individuales suavemente sobre el consumo y los coloca en solución salina equilibrada de Hank enfriada (HBSS). Nota, las tijeras se debe colocar curva hacia arriba justo por encima del PP y luego suavemente aplicada al tejido. Impuestos Especiales únicamente el PP (no surrounding tejido) y la transferencia de HBSS fría.
    Nota: Todas las incubaciones y etapas de centrifugación de este punto en adelante en la Sección 2 se realizó a 4 º C para preservar la viabilidad celular.
  5. Transferir PP en 5 ml de medio de disociación del bazo y se incuba durante 15-20 min a 37 ° C mientras vigorosamente con agitación a 250 rpm. Un mayor tiempo de incubación afectará negativamente a la viabilidad celular.
  6. Para generar una suspensión de células individuales, los PP en un lugar estéril (esterilizado en autoclave) 70 tamiz de malla de nylon micras celular y la fuerza moler el tejido en la malla utilizando la base de un émbolo de una jeringa de 1 cc. Alternativamente, los PP sándwich entre dos helados estériles portaobjetos de vidrio de microscopio (en autoclave en sobres) y moler suavemente los tejidos con un movimiento de ida y vuelta. Utilizar una pipeta de transferencia estéril para transferir la suspensión de células en un tubo de 5 ml Falcon.
  7. Añadir EDTA a una concentración final de 1 mM a la suspensión celular. Incubar en un agitador para5 min a temperatura ambiente.
  8. Decantar suspensión celular a través de un segundo filtro de células 70 micras para eliminar cualquier agregado restantes celulares o restos de tejidos. Recoger las células en un tubo de 15 o 50 ml cónico.
  9. Células sujeto a centrifugación suave (5 min a 500 xg). Decantar el sobrenadante y resuspender las células en tampón de flujo, que es solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 1% de suero fetal de ternera (FCS).
  10. Para determinar el número de células y la viabilidad, se diluye 1:10 en células con azul de tripano y una inspección visual de las células utilizando un microscopio de luz y un hemocitómetro. Alternativamente, un contador de células condesa (Invitrogen) o instrumento similar se puede utilizar para enumerar automáticamente el número de células y la viabilidad.
    A partir de 20-25 PP, este protocolo debe ceder> 2,5 x 10 6 células totales. Esto equivale a ~ 0.8-1.2 × 10 6 células por ratón.

Etiquetado Anticuerpos de las células para citometría de flujo

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  • Dispensar células (10 5 por pocillo) en pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo redondo.
  • Sujeto a la placa de centrifugación suave (5 min a 1.000 xg), y el sobrenadante se decanta, invirtiendo suavemente la placa.
  • Resuspender las células en tampón de bloqueo Fc e incubar en hielo durante 15 min. Mientras que hay un número de buffers de bloque disponibles comercialmente Fc (por ejemplo de rata anti-ratón CD16/CD32, BD Biosciences), simplemente usamos medio gastado de una rata B de células de hibridoma (ATCC 2.4.G2) que secreta un anticuerpo monoclonal murino IgG 1 contra Fc gamma receptores para este paso.
  • Sujeto a la placa de centrifugación suave (5 min a 1.000 xg) como anteriormente, y el sobrenadante se decanta, invirtiendo suavemente la placa.
  • Añadir fluoróforo anticuerpos conjugados directamente a las suspensiones de células a dilución deseada, e incubar en hielo durante 30 min con agitación continua.
  • Sujeto a la placa de centrifugación suave (5 min a 1.000 xg), y decantarsobrenadante invirtiendo suavemente la placa.
  • Lavar las células con 100 l de tampón de flujo.
  • Centrifugar la placa a 1.000 xg durante 5 min, y el sobrenadante se decanta, invirtiendo suavemente la placa.
  • Resuspender las células 400 l Tampón de fijación, que consiste en 300 l de tampón de flujo y 100 l de 1% de paraformaldehído en tampón PHEM (60 mM TUBOS, HEPES 25 mM, EGTA 10 mM, 4 mM de MgCl 2 a pH 6).
  • Células sometidas a citometría de flujo utilizando un FACSCalibur o equivalente. Analizar los resultados utilizando Cell Quest Pro versión de software 5.2.
  • 3. Preparación de criosecciones PP

    1. Antes de la recogida de tejidos, añada una temperatura óptima de corte (OCT) compuesto a base de moldes 7x7x5 mm de plástico. También preparar una piscina de nitrógeno líquido (> 750 ml) en un cubo dewar o hielo.
    2. La eutanasia del ratón y realizar un laparotamy, como se describió anteriormente. Retire intestino y el lugar en toallas de papel húmedas.
    3. Aaislar PPs para cyrosectioning, cortar segmentos de 0,5 cm transversales del intestino delgado que contienen un único PP y transferencia de tejido a una placa de Petri que contiene PBS. Enjuague suavemente el lumen de estos segmentos con PBS para eliminar los desechos fecales no deseado.
    4. Coloque los segmentos intestinales tejido verticalmente dentro de moldes de base que contienen octubre Sumergir los moldes en nitrógeno líquido y permitir que el tejido para congelar completamente (1-2 min). El color de la OCT cambia de transparente a blanco cuando el tejido está completamente congelado. . Para un enfriamiento más gradual (por ejemplo, para reducir el agrietamiento de la OCT), sumergir el molde en un baño de isopentano enfriado con vapores de nitrógeno líquido Nota: Utilizar gafas de seguridad apropiadas cuando se trabaja con nitrógeno líquido.
    5. Retirar los moldes congelados de base del nitrógeno líquido utilizando fórceps y permitir que el molde se caliente a temperatura ambiente el tiempo suficiente (~ 10-15 segundos) para permitir que los bordes del bloque de octubre a ablandarse. Para eliminar entonces el bloque congelado de octubre deel molde, invierta el molde y presionar suavemente en la parte posterior para expulsar del bloque a un paño limpio 4 x 4 cm pedazo de papel de aluminio. Inmediatamente envolver el tejido en el papel de aluminio y colocarlo en una bolsa espécimen etiquetado se almacenó en nitrógeno líquido o en hielo seco. Alternativamente, la transferencia del tejido en un congelador (<-20 ° C). Usa el tejido dentro de una semana, de lo contrario los bloques se vuelven frágiles con la edad.

    Cryosectioning

    1. Criosección el tejido utilizando una Leica CM3050S cryomicrotome o equivalente. La temperatura de la cámara en el criostato se debe establecer a -21 ° C.
    2. Luchar por secciones que son 12-14 micras de espesor.
    3. Recoger secciones en Fisher SuperFrost Plus (o equivalente) portaobjetos de vidrio para microscopio e inspeccionar visualmente usando un microscopio de bajo nivel luminoso de alimentación. Si hay varias secciones se están recogiendo en una diapositiva, asegúrese de que están agrupados para aplicaciones de tinción aguas abajo.
    4. Tienda tse desliza a temperatura ambiente en una caja de diapositivas y, a ser posible, para ser utilizados dentro de unos días.

    Anticuerpo Etiquetado de criosecciones y análisis de microscopía confocal

    1. Sumerja los portaobjetos en acetona (o metanol) en el vaso de tejido teñido o bastidores durante 2 min. Incubación prolongada puede hacer que los tejidos se desprenda de la diapositiva.
    2. Transferir diapositivas para tinción frasco nuevo y se lava 3 veces con PBS-T (1X PBS con 0,05% de Tween-20) durante 3 min cada uno.
    3. Rodear las secciones con un lápiz hidrofóbico ImmEdge. Esto asegurará que los reactivos y anticuerpos permanecen confinados a esa área durante las incubaciones.
    4. Incubar los portaobjetos en tampón de bloqueo (2% de suero de cabra en PBS) durante 30 min a 37 ° C en una cámara humidificada, protegido de la luz.
    5. Incubar los portaobjetos con tampón de bloqueo Fc (véase más arriba) durante 10 min a 37 ° C.
    6. Dip diapositivas en PBS-T y la zona seca alrededor de las secciones usando Kimwipes o tejido absorbente.Tenga cuidado de no tocar las secciones de tejidos reales.
    7. Superposición secciones de tejido con solución de anticuerpo primario y se incuba durante 30 min a 37 ° C en una cámara humidificada. El anticuerpo primario se diluye típicamente en tampón de bloqueo hasta una concentración final de 20 mg / ml. El uso de anticuerpos marcados directamente primarios es deseable, porque tanto como tres anticuerpos se pueden combinar directamente en este paso. Anticuerpos directamente marcados también eliminar la necesidad de pasos adicionales de incubación de anticuerpos.
    8. Lavado de los portaobjetos 3 veces (5 min cada uno) por inmersión en PBS.
    9. Si los portaobjetos necesarios, incube con los correspondientes anticuerpos secundarios durante 30 minutos a 37 ° C en una cámara de humedad.
    10. Lavado de los portaobjetos 3 veces (5 min cada uno) por inmersión en PBS.
    11. Incubar los portaobjetos durante 4 min en 1% de paraformaldehído en tampón de PHEM, como se describió anteriormente.
    12. Lavar los portaobjetos con PBS durante 1 min.
    13. Área seca alrededor de las secciones usando Kimwipes u otro absorberent tejido. Tenga cuidado de no tocar las secciones de tejidos reales. Con una pipeta o cuentagotas, coloque suavemente una gota de oro Prolongar medio de montaje directamente en la sección. Aplicar un cubreobjetos de vidrio sobre el medio de montaje teniendo cuidado de evitar burbujas. Utilice papel secante para absorber el exceso de medio de montaje.
    14. Seal cubreobjetos para portaobjetos de microscopio con esmalte de uñas comercial y dejar secar al aire.
    15. Ver diapositivas con una Leica TCS SP5 o un microscopio confocal equivalente.

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    Representative Results

    Análisis de citometría de flujo de suspensiones monodispersas de total de células PP revela una clara distinción entre las preparaciones de células buenas y malas. En preparaciones de células buenas relaciones con más del 80% de viabilidad, la gran mayoría de las células demostrar alta dispersión hacia adelante (FSC), un indicador de volumen celular alta, y baja dispersión lateral (SSC), un indicador de granularidad celular baja (Figura 2A). En este experimento, se preparó también intencionalmente una "preparación de células pobre" mediante la incubación de células PP durante las etapas de aislamiento a la temperatura ambiente (en lugar de en hielo) y, en el último paso, la incubación de las células con PBS más FCS al 1% (en lugar de PHEM buffer). En estas preparaciones celulares pobres, la mayoría de las células presentan bajo FSC y SSC alta y están fuera del indicado R1 puerta (Figura 2B). Estas células son probablemente experimentar apoptosis y / o necrosis.

    La Figura 3 muestra el uso de un cóctel de hasta cuatro diferentes fluoróforo conjugado con anticuerpos monoclonales para discriminar entre una variedad de tipos de células en suspensiones celulares únicas de PP. Etiquetado con grupo de diferenciación (CD) marcadores CD19 y B220 revelan que las células B constituyen ~ 60% de la población celular cerrada PP (Figura 3A). Específicos subconjuntos de células T puede ser fácilmente separado por un doble marcaje con anticuerpos contra CD3 y CD4 (Figura 3B) o CD3 y CD8 (Figura 3C). CD4 + y CD8 + células T constituyen ~ 23% y ~ 9%, respectivamente, de las células PP totales. DCs subconjuntos etiquetados CD11c + (Figura 3D) y CD103 + (no se muestra) se pueden enumerar también por este método. CD11c + DCs aportan alrededor del 8% de la población total cerrada, lo que equivale aproximadamente a 10.000 controladores de dominio por PP. Esto concuerda exactamente con el número de centros de datos observados por otros 14.

    Entre la población de CD11c + + B220. Se obtienen resultados similares cuando las células se recogen de PP C57B / 6 ratones (Figura 3E).

    "Pobre" preparaciones de células puede conducir a resultados muy engañosas, en gran parte porque las células muertas o moribundas tienden a unirse anticuerpos no específicamente. Como se muestra en la Figura 4, la población de células que se tiñen positivo tanto para el marcador de células B (B220) y los marcadores de células T (CD3, panel A; CD4, panel B) puede variar por más de 3-pliegue entre una buena y preparación de células malo. Figura 4 muestra una sobre representación de B220 + y CD3 + células doble positivas (Panel A), así como de células B B220 + y células T CD4 + células doble positivas (Panel B) en preparaciones celulares pobres. Como se mencionó anteriormente, la disparidad en B relativo y los números de células T en el bien contra el pobre es probable debido a la unión no específica de anticuerpos células moribundas.

    El protocolo también demuestra que el ratón cryosections PP son susceptibles de análisis histopatológico, así como inmunomarcaje. Figura 5 compara la tinción H & E de ratón parafina PP (paneles A, B) y las secciones congeladas (panel C). Si bien los cortes de parafina proporcionar más resolución a nivel celular cuando se tiñen con H & E, las zonas claras y oscuras del PP centros germinales son más fácilmente en las secciones delimitadas criosección (Figuras 5A-C). Cryosections H & E-manchado son útiles para comparación lado a lado con criosecciones inmunomarcadas. Un típico criosección PP se tiñeron con anticuerpos anti-CD3 para identificar a las células T, los anticuerpos anti-CD11c para resaltar DCs y los anticuerpos anti-B220 para resaltar las células B se muestra en la Figura 6.

    Figura 1
    Figura 1. Ratón de Peyer patches. Imagen de un intestino de ratón recién extirpado pequeña con tres PPs visibles (flechas blancas). Los PP aparecen como estructuras en forma de ampollas (5 x 5 mm) en el lado anti-mesentérica de la serosa intestinal.

    Figura 2
    Figura 2. Total de células PP analizadas por citometría de flujo. Una suspensión monodispersa del total de células PP se sometió a citometría de flujo utilizando un FACSCallibur BD. (A) Ejemplo de una preparación de células buena. La gran mayoría de las células demostrar alta dispersión hacia adelante (FSC), un indicador de volumen celular alta, y baja dispersión lateral (SSC), un indicador de granularidad celular bajo. Estas células están en caja en R1. Las células con bajo FSC y SSC alta, situado fuera de R1 puerta, se consideran células muertas o moribundas. (B) Ejemplo de una preparación de células pobre, en el que la mayoría de las células están fuera de la puertaR1 debido a la baja FSC y SSC alto.

    Figura 3
    Figura 3. Análisis de citometría de flujo representativo de los linfocitos PP. Suspensiones monodispersas del total de células PP incubaron con fluoróforo conjugados con anticuerpos primarios y después se sometió a citometría de flujo. (A) CD19 y B220 etiquetado de las células B de PP. (BC) de doble etiquetado de las poblaciones de células totales con CD3 y CD4 (B) o CD8 (C) para enumerar subconjuntos de células T específicas. (D) de doble etiquetado de las poblaciones de células totales para B220 (marcador de células B) y CD11c (marcador DC). (E) Comparación B220, CD3 , CD4, y la tinción CD11c en células PP de ratones BALB / c y ratones C57B / 6.

    Figura 4
    Figura 4. Engañosas datos de citometría de flujo como resultado de la pobre preparaciones de células PP. Bueno (paneles izquierdos) y pobres (paneles de la derecha) preparaciones de células se tiñeron con PP (A) anticuerpos B220 y CD3 para diferenciar las poblaciones de células B y T o anticuerpos (B) a B220 y CD4 para diferenciar las células B a partir de un subconjunto de células T. En general, existen muy pocas células de las células que se tiñen positivos para CD4 B220 y CD3 o, como se muestra en los paneles de la izquierda. En contraste, en preparaciones de células deficientes células doble positivas constituyen casi el 20% de las células totales. Ver texto para más detalles acerca de lo que constituye un "pobre" preparación de células.

    Figura 5
    Figura 5. Representante H & E-manchado secciones PP. Embebidos en parafina secciones (A, B) o criosecciones (C) de ileal PPs se tiñeron con H & E y se visualizaron por microscopía de luz. Tenga en cuenta que las zonas claras y oscuras de los folículos linfoides son fácilmente demarcada en las secciones criogénicas, en comparación con las secciones de parafina. Abreviaturas: V, vellosos, FAE, folículo asociada al epitelio; SED, sub-epitelial cúpula; folículo LF, linfoide.

    La figura 6
    Figura 6. Etiquetado inmunofluorescencia de secciones criogénicas murinos PP. Recién cortado secciones de tejido de un solo ratón PP fueron secadas al aire, acetona fijo, y teñidas con (A) conjugado con FITC anti-CD3 para identificar a las células T en las regiones inter-foliculares y lámina propia; (B) PE-conjugadas anti-CD11c anticuerpos para resaltar los DC del SED, y (C) APC-conjugadas anti-B220 anticuerpos para resaltar las células B (D) Un compuesto o.f imágenes en los grupos AC generados mediante software Fiji. Barra de escala es de ~ 100 m.

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    Discussion

    En este artículo, hemos proporcionado protocolos paralelos para preparar PP preparaciones de células individuales para el análisis de citometría de flujo y funcional y cryosections para inmunotinción. Ambos métodos son altamente reproducible y fácilmente accesible, siempre un citómetro de flujo y el criostato están disponibles. Para los investigadores por primera vez hay que señalar que, en comparación con el bazo, los rendimientos totales de células de PP son relativamente escasos. Sin embargo, el protocolo esbozamos en general los rendimientos entre 0.8-1.2 × 10 6 células totales del PP de un ratón. Scale-up es posible, a pesar de que normalmente no más de 20-25 piscina PP, porque, según nuestra experiencia, la agregación se produce y los rendimientos celulares (y viabilidad) disminuyen en gran medida. Por otro lado, no se recomienda el uso de menos de 15 PPs para este protocolo, como una masa crítica es necesaria para realizar con éxito las células a través del procedimiento de aislamiento completo. Si la viabilidad celular máxima es una prioridad para abajo funcionalensayos, se recomienda que una pequeña muestra de células aisladas se sometieron a tinción de yoduro de propidio para permitir la activación periódica más exacta de la piscina viable de células de la población total de células PP. Por último, hay que señalar que nuestro método es susceptible de aplicaciones de clasificación de células si un subconjunto específico de células que se desea para la transferencia adoptiva o en análisis in vitro, por ejemplo.

    La colección de PP para crioseccionamiento es relativamente simple, aunque el seccionamiento real de los tejidos de PP puede ser un reto. Es imperativo, por ejemplo, que los tejidos de PP son debidamente orientado en moldes (es decir, perpendicular a la base del molde) para asegurar que las secciones transversales reales se obtienen. Proponemos complemento de congelación tejidos de PP y sometiendo luego las secciones criogénicas para precipitar fijadores como acetona o metanol, para preservar la reactividad de anticuerpos ("antigenicidad"), aunque precipitando fijadores resultado en una disminución general en resol celular y subcelularlución. Si la preservación de antigenicidad no es una preocupación particular, le recomendamos el uso de enlaces cruzados fijadores como paraformaldehído (PFA), que se traducen en una mejor conservación de las estructuras celulares y subcelulares. En efecto, PFA se puede utilizar para reparar tejidos antes de cryosectioning. Simplemente sumerja recién extirpados PP en cantidades copiosas de PFA al 4% durante> 2 horas, lavar el tejido con PBS para eliminar el exceso de fijador, mezclar tejido en sacarosa (15%) si se desea, y luego insertarlo en octubre, como se describió anteriormente. El tejido puede ser cryosectioned, pero debe ser bloqueada con glicina solución (0,1 M en PBS durante 15 min) para extinguir residual reactiva PFA antes de la inmunotinción.

    Finalmente, mientras que hemos descrito protocolos para el etiquetado de inmunofluorescencia de secciones criogénicas PP, estas mismas secciones son susceptibles de inmunohistoquímica (IHC) utilizando kits disponibles en el mercado de IHC (por ejemplo, Vector Labs, Burlingame, CA). Para IHC, es esencial incluir una peroxidasa de bloqueo o QuEnching paso en el protocolo, como las peroxidasas endógenas son muy frecuentes en la mucosa intestinal. Otros han observado que para la IHC, la perfusión cardiaca de los ratones con 4% de paraformaldehído en PBS mejora la conservación de tejidos.

    En resumen, hemos proporcionado protocolos paralelos y complementarios para el análisis cuantitativo y funcional de las células murinas PP, entre ellos los linfocitos y los países en desarrollo. La preparación de suspensiones de células individuales permite cuantitativo y funcional en el análisis in vitro de los tipos celulares principales en los PP, mientras que immunolabeling de secciones criogénicas proporciona información relativa a la localización de tipos de células específicas, así como interacciones célula-célula que existen in situ. La principal limitación de estos dos enfoques es que no representa el "tiempo real" la visualización del PP interacciones célula-célula. Por el momento, por lo menos, los PP han demostrado ser impermeable a intravital de imágenes, una técnica que ha revolucionado la comprensión de linfocitos dinámicamentecs en los ganglios linfáticos periféricos. Hasta que las barreras técnicas para limitar la formación de imágenes intravital de PP se superan, los protocolos descritos en este artículo para la preparación de PP preparaciones de células individuales para el análisis de citometría de flujo y funcional y criosecciones de PP para la inmunotinción siguen siendo el medio primario de la investigación y la comprensión de las funciones inmunológicas del sub específicos -poblaciones de células en PPs, los sitios primarios de inducción de intestino asociada a los tejidos linfoides.

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    Disclosures

    No hay conflictos de interés declarado.

    Acknowledgements

    Damos las gracias a la canción Renjie (Wadsworth Center Flow Core Citometría) para la asistencia en el análisis celular y Helen Johnson (Wadsworth Center Animal Histopatología Core) para la preparación de secciones de parafina. Agradecemos al Dr. Richard A. Cole (Wadsworth Center Light Microscopy Core) para obtener ayuda con la microscopía confocal y la colección de imágenes. Nos gustaría reconocer Andy Bentley (Wadsworth Photo Center y la Ilustración) para obtener ayuda con animaciones.

    MDJ con el apoyo de la Fundación para la Investigación Ciencias de la Vida, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship. SA se apoya en un Wadsworth Center-Health Research Fellowship Inc. postdoctoral intramural. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del NIH y HD061916 GM082978.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    OCT Compound Tissue-Tek 4583
    7x7x5 mm Base Molds Fisherbrand 22-363-552
    ImmEdge Pen Vector Labs H-4000
    Superfrost Plus Slides Thermo Scientific 4951
    Edge Rite Blade Thermo Scientific 4280L
    Anti-Mouse CD11c-PE eBioscience 17-0114-82
    Anti-Mouse CD45R/B220-APC BD Pharmigen 553092
    Anti-Mouse CD3-FITC BD Pharmigen 561798
    Anti-Mouse CD4-PE BD Pharmigen 553652
    Anti- Mouse CD8-PE BD Pharmigen 553032
    Anti-Mouse CD19-PercP BioLegend 115531
    Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red Fisher Scientific 14175-079
    70 μm cell strainer BD Falcon 352350
    Spleen Dissociation Medium Stem Cell Technologies 7915
    Goat serum Invitrogen 16210-072
    Fc Block ATCC 2.4.G2 HB-197 Supes obtained from cell line 2.4.G2
    Curved Scissor F.S.T 14061-09
    Cryostat Leica 3050S
    FACS Calibur BD
    Countess Cell Counter Invitrogen
    Hematoxylin Richard Allan 7211
    Eosin Richard Allan 71304
    Formalin Starplex Scientific 3661

    Table 1. Reagents and equipment used in this study.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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