Conditionnement tactile et d'analyse des mouvements des stratégies d'échantillonnage antennaires chez les abeilles (

Neuroscience

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Summary

Dans ce protocole, nous montrons comment les abeilles état attelé à des stimuli tactiles et mettre en place une technique de capture de mouvement 2D pour analyser la cinématique de fin échelle modèle d'échantillonnage antennaire.

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Mujagić, S., Würth, S. M., Hellbach, S., Dürr, V. Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.). J. Vis. Exp. (70), e50179, doi:10.3791/50179 (2012).

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Abstract

Les abeilles (Apis mellifera L.) sont insectes sociaux et bien connus pour leur division complexe du travail et de la capacité d'apprentissage associatif 1, 2. Les abeilles ouvrières passer la première moitié de leur vie à l'intérieur de la ruche obscure, où ils sont soigner les larves ou le renforcement des peignes régulière hexagonale pour la nourriture (pollen ou de nectar par exemple) et du couvain 3. Les antennes sont extraordinaires palpeurs multisensorielles et jouent un rôle crucial dans divers tactiles tâches induites par 4, y compris bâtiment de 5 et 6 ruche reconnaissance des formes. Plus tard dans la vie, chaque abeille quitte la ruche à la recherche de nourriture. Puis, une abeille doit apprendre à distinguer les sources alimentaires rentables, mémoriser leur emplacement, et les communiquer à ses compagnons de nidification 7. Les abeilles utilisent différents signaux floraux comme les couleurs ou les odeurs 7, 8, mais aussi les indices tactiles de la surface des pétales de 9 à former des souvenirs multisensoriels de la source de nourriture. En vertu de coopération entre laboratoiresnditions, les abeilles peuvent être formés dans un paradigme d'apprentissage appétitive de discriminer les caractéristiques des objets tactiles, tels que des bords ou des rainures avec leurs antennes 10, 11, 12, 13. Ce paradigme d'apprentissage est étroitement lié au conditionnement classique de la réponse olfactive extension du proboscis (PER) dans les abeilles harnachés 14. L'avantage du paradigme de l'apprentissage tactile en laboratoire est la possibilité de combiner des expériences comportementales sur l'apprentissage de diverses mesures physiologiques, y compris l'analyse de la forme du mouvement antennaire.

Protocol

1. Préparation des abeilles

  1. Butineuses de nectar ou de pollen sont pris dans le domaine soit à partir d'un chargeur de saccharose ou directement à partir de l'entrée de la ruche, alors qu'il rentrait d'un voyage de recherche de nourriture. Chaque abeille est capturée dans un flacon en verre qui est fermé par un bouchon de mousse et pris immédiatement dans le laboratoire pour une manipulation ultérieure.
  2. Dans le laboratoire, les abeilles capturées sont brièvement refroidi au réfrigérateur à 4 ° C jusqu'à ce qu'ils montrent les premiers signes de l'immobilité.
  3. Chaque abeille immobilisée est monté dans un petit tube de métal avec du ruban adhésif entre la tête et le thorax et l'abdomen. Des précautions doivent être prises pour que la trompe et les antennes peuvent se déplacer librement.
  4. Peindre les yeux composés et des ocelles de l'abeille fixe avec de la peinture blanche (par exemple, sans solvant, Tipp-Ex) pour occlure vision.
  5. Ajouter une petite goutte de cire fondue derrière la tête de l'abeille pour le fixer à la bande entre la tête et le thorax pour éviter les mouvements de la tête lors des enregistrements.
  6. Marquez chaque abeille avec un certain nombre sur la bande pour une meilleure identification et placer le tube avec l'abeille fixe dans une atmosphère humide pour éviter la déshydratation.
  7. Nourrir chaque abeille pendant 5 sec avec des gouttelettes d'une solution de saccharose à 30% présentaient une seringue et laisser toutes les abeilles de récupérer pendant 30 min avant de commencer avec le protocole de conditionnement tactile.

2. Conditionnement tactile

  1. Avant le conditionnement, chaque abeille doit être testé pour la réponse extension du proboscis (PER) à un stimulus de saccharose à 30% appliqué aux antennes. Ainsi le bout de la trompe doit traverser une ligne virtuelle entre les mandibules ouvertes. Jeter toutes les abeilles qui ne répondent pas à un PER à la relance du saccharose.
  2. Pour le conditionnement tactile utiliser un cube en laiton (par exemple 3 x 5 mm) avec une surface lisse ou un motif gravé, par exemple, horizontale ou rainures verticales formant une grille de 150 um de longueur d'onde, comme le stimulus conditionné (CS). Faou le stimulus inconditionnel (États-Unis) utilisent une solution de saccharose à 30% (sucre de ménage, dilué dans de l'eau).
  3. Le cube en laiton (SM) est placé dans un support sur ​​un micromanipulateur (par exemple, Märzhäuser MM33) afin d'assurer un positionnement précis pendant la procédure de conditionnement. Aux Etats-Unis est présenté à l'abeille avec une seringue remplie d'une solution de saccharose à 30%.
  4. La procédure de conditionnement se compose de cinq paires de stimulus tactile (CS) et une solution de saccharose (États-Unis), avec un intervalle inter-essai (IIT) de 5 min. Placez une abeille devant le micromanipulateur avec le stimulus tactile monté (CS). Placez le CS lentement, de sorte que la surface de la stimulation tactile est parallèle à la tête de l'abeille (figure 1 A et B). La distance entre l'animal et l'objet tactile devrait être de l'ordre du rayon antennaire de travail de l'abeille testée, à savoir l'abeille doit être capable d'analyser le stimulus tactile dans une position confortable wvec les deux antennes. Dans l'exemple illustré à la figure 1, la distance était de 3 mm. Laissez l'abeille analyser le stimulus tactile (CS) pendant 5 sec. Après la première section 3, présenter une gouttelette du saccharose 30% (US) avec une solution de la seringue sous la trompe. Utilisez le bout de la seringue pour soulevez doucement la trompe. La stimulation du saccharose dans la trompe suscitera l'inconditionné PAR 15. Laissez l'abeille à lécher la récompense du saccharose. Utiliser un chronomètre avec un signal d'alarme pour maintenir des intervalles de temps précis au cours du conditionnement.
  5. Le PER conditionné est utilisé comme mesure pour la réussite de l'apprentissage d'une abeille. Après les appariements premier récompensés, les abeilles commencent à réagir à la présentation CS, par extension, de leur trompe, ce qui indique qu'ils attendent la récompense à venir. A trompe complètement étendus observés à tout moment pendant la fenêtre 3 sec Temps de présentation des stimuli tactiles et avant la présentation du saccharose est marqué comme une réponse positive. Aucune réponse négative est compté. Le occurrence du PER est à noter par l'expérimentateur. Le pourcentage des abeilles montrant le PER lors de la présentation CS est tracée pour chaque procès.

3. Les enregistrements cinématiques

  1. Mouvements antennaires d'une seule abeille exploitées sont enregistrées avec une caméra vidéo numérique avec une lentille macro approprié (par exemple Basler A602f-2 équipé d'TechSpec VZM 200, fonctionnant à 50 images par seconde via une connexion fire wire). La caméra est positionnée au-dessus de l'animal dans une vue de haut en bas (Figure 1). Dans la figure 1, la résolution spatiale des enregistrements est de 0,02 mm / pixel.
  2. Calibrer l'appareil par l'enregistrement d'images individuelles d'un damier de 10 x 10 mm avec une longueur d'arête de 1 mm à partir des orientations différentes dans le cadre du but caméra. Le calibrage peut être fait avec la boîte à outils Matlab appareil de calibrage 16.
  3. Placez une seule abeille fixe en dessous de la lentille de la caméra. Présenter le stimulus tactile, fixé à un micromanipulateur, À l'animal. Procéder de la même manière que décrit pour le conditionnement tactile, et d'enregistrer le mouvement antennaire tandis que l'abeille est la numérisation de l'objet. Il est important que la gamme complète antennaire de travail et le stimulus tactile sont visibles. Les choix de configurations de stimulus testé et numéros d'essai dépendent de la conception expérimentale.

4. Analyse des données

  1. Le calcul du fond de l'image se fait en Matlab. Tout d'abord, la valeur médiane niveaux de gris au fil du temps doit être calculé pour chaque pixel. Les objets statiques, comme la tête fixe de l'abeille et le stimulus tactile, constituera le fond de l'image. Les objets en mouvement, comme les deux antennes, ne fera pas partie de l'arrière-plan.
  2. Chaque trame de la vidéo enregistrée doit être chargé de manière séquentielle, et la différence entre l'image courante et l'image de fond doit être calculée. Le résultat de cette soustraction souligne les parties de l'image qui sont en mouvement de trame en trame. Ideally, les antennes de l'abeille sont les seuls domaines de valeurs non nulles (figure 1C).
  3. Pour un traitement ultérieur, les deux plus grandes zones avec des valeurs de pixels non nuls sont supposés être des antennes. Pour les deux antennes d'un masque binaire doit être généré pour chaque pixel contenant une valeur 1, si le pixel appartient à l'antenne et 0 sinon valeur. Ce masque sert de base pour localiser les conseils des antennes plus tard. Pour obtenir un masque préliminaire pour l'image entière de la valeur de gris de chaque pixel de l'image de différence est comparée à un seuil prédéfini. Depuis nous nous occupons de bruit tard ce seuil est choisi pour être assez faible. Le masque préliminaire puis porte toujours deux types d'erreurs: Premièrement, en raison de bruit de l'image régions petits font encore partie du masque. Deuxièmement, les zones qui appartiennent à l'antenne ne sont pas forcément être totalement connecté. Celle-ci survient surtout si le fond est à peu près la même luminescence que l'antenne. Pour éliminer ces artefacts, standardopération de traitement d'image morphologique sont appliquées, c'est à dire une combinaison de l'érosion et la dilatation d'image, en s'appuyant sur ​​les fonctions standard Matlab imerode et imdilate respectivement (voir 17 pp 158-205 pour plus d'explications). Après le processus de débruitage des hypothèses antennes sont encore contenus dans le même masque. Par conséquent, comme prochaine étape du masque binaire est concentrée dans les zones disjointes utilisant la norme Matlab fonction bwlabel (voir 17 pp 40-48 pour plus de détails sur l'algorithme de segmentation d'image).
  4. Le nombre de pixels par grappe est compté et les deux plus grandes grappes sont sélectionnées. Le centre de gravité est calculée de distinguer entre l'antenne gauche et droit (figure 1D).
  5. La pointe antennaire pour chaque antenne peut être définie comme étant le pixel dans un groupe avec la valeur la plus élevée dans la direction proximale-distale pour-(voir la figure 1D).

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Representative Results

Dans l'expérience suivante, nous avons étudié la façon dont l'apprentissage tactile affecte le comportement d'échantillonnage antennaire chez les abeilles. Pour cela, nous avons suivi le mouvement de la pointe antennaire chez les abeilles naïfs et conditionné avant et pendant la présentation d'un stimulus tactile.

Tout d'abord, le mouvement spontané antennaire d'un groupe de butineuses de pollen (N = 42) a été enregistré pendant 1 min. La moitié des abeilles (N = 21) a ensuite été conditionnée par appariement cinq fois un stimulus tactile avec une récompense de saccharose à 30%. Ce fut le groupe de climatisation. Le stimulus tactile a la surface de 30 x 50 mm d'un cube en laiton gravé avec une grille horizontale (λ = 150 um). L'autre moitié des abeilles (N = 21) n'a pas été conditionnée et utilisée comme un groupe naïf. Figure 2 montre la courbe moyenne apprentissage du groupe conditionné des abeilles. Le pourcentage de climatisation PAR après la première récompense est significativement différent du comportement spontané (figure 2 ème récompense.

Ensuite, le mouvement de la pointe antennaire à la fois dans le conditionné et le groupe naïf a été enregistré à nouveau pendant 1 min en présence du stimulus tactile Figure 3 A 1 -. B 2 montre la répartition des emplacements des antennes de pointe dans les deux groupes, avant et pendant la présentation de l'objet tactile. Les deux, le naïf et le groupe climatisé changé leur modèle de mouvement antennaire en présence d'un stimulus tactile par rapport au comportement spontané. La probabilité de la pointe antennaire à la recherche et / ou de l'échantillon de la zone du plan de relance est significativement augmentée si le stimulus était présent, montrant que l'échantillonnage tactile implique un changement marqué dans le modèle de mouvement antennaire par rapport à un mouvement spontané antennaire. Cela est vrai pour les deux groupes d'abeilles (figure 3 C 1 et C (figure 3 C 1 et C 2, Mann-Whitney U test, P <0,05, il n'y avait pas de différence significative entre les deux périodes de référence A sur la figure 3C). Ainsi, le conditionnement tactile entraîne une augmentation de la circulation antennaire connexion près de l'objet et d'échantillonnage tactile de la surface de l'objet, comme expliqué précédemment en Erber (2012) 18. Par rapport au groupe naïve, la distribution spatiale au cours de la présentation du stimulus était beaucoup plus lisse après conditionnement (Comparer Figure 3 B 1 et B 2).

En résumé, les résultats de cette expérience montrent que les abeilles peuvent être formés de manière très efficace de répondre à un stimulus tactile, et que l'apprentissage tactile est accompagnée d'une augmentation active recherche et échantillonnage du comportement.

Figure 1
Enregistrement vidéo Figure 1 et à la procédure de suivi antennaire A:.. Top-down vue d'une abeille fixe et le stimulus tactile. Le stimulus tactile est positionné à l'avant de la tête de l'abeille fixe avec des yeux occlus. Il est situé à l'intérieur de la plage de travail antennaire. d et p indiquent les emplacements distale et proximale par rapport à l'animal B:. Vue de côté de la même abeille et le stimulus tactile. La surface du stimulus tactile et la tête de l'abeille (pointillés bleus) sont parallèles les uns aux autres C:. Distinguer les pixels en mouvement à partir des pixels statiques dans une séquence vidéo. Soustrayant chaque image d'un modèle d'arrière-plan permet d'identifier les pièces mobiles, à savoir l'unntennae. La tête fixe de l'abeille et le stimulus tactile (indiqué ici en tant pointillés rouges) sont statiques et non visible après la soustraction D:. Définition de gauche et de droite et la pointe antennaire. Les deux groupes plus importants après soustraction de pixels sont identifiés comme des antennes. Le calcul du centre de gravité permet de distinguer entre la gauche (rouge) et la droite (vert) d'antenne. La pointe antennaire pour chaque antenne (croix noire) peut être défini comme étant le pixel dans un groupe avec la plus grande valeur dans la direction distale.

Figure 2
Figure 2. Courbe d'apprentissage du conditionnement PAR tactile. Butineuses de pollen ont été formés en utilisant cinq paires de la CS (stimulus tactile) et américains (solution de saccharose) avec un intervalle inter-essai de 5 min. Le pourcentage de réponses positives de 21 animaux est tracée pour le comportement spontané (spont) et duremise des bagues du CS après chaque essai de conditionnement. Le pourcentage de PER observée après la première et toutes les récompenses suivantes est significativement différent du comportement spontané (test de Fisher probabilité exacte, p <0,001).

Figure 3
Figure 3. Normalisés distributions moyennes de l'emplacement de la pointe antennaire pendant une période de 1 min. La répartition pointe antennaire de chaque abeille a été normalisée au nombre total de points de données par animal. Les panneaux montrent les résultats de naïf (à gauche, N = 21) et les abeilles climatisées (à droite, N = 21) avant (A) et lors de la présentation du stimulus (B) A 1 et A 2:.. Antennaire mouvement spontané avant la présentation du stimulus L'axe des abscisses représente la position latérale de la pointe par rapport à antennaire ee centre de la tête (comparer avec la figure 1C et D). L'ordonnée indique la position distale de la pointe antennaire. L'échelle de couleur indique le pourcentage de temps que la pointe antennaire passé à un endroit donné. La période d'enregistrement de 1 min est équivalent à 3.000 images vidéo B 1 et B 2:. Identique à 1,2 A, mais au cours de la présentation du stimulus C 1 et C 2:. Nombre moyen de trames dont la pointe a été antennaire situés à l'intérieur la zone de l'objet, c'est-à ± 3 bacs distale ou proximale par rapport à la surface de stimulus. C1: Groupe naïve; C2: groupe climatisé. Les parcelles boîte à moustaches montrent la médiane, la moyenne, quartiles et percentiles 5-95% du nombre d'images par minute. Dans les deux groupes d'abeilles, il ya une différence significative entre «aucune incitation» (A) et «avec mesures de relance» (B, C; Wilcoxon test, C 1: P = 5,39 * 10 -4 C 2 -5). Le nombre moyen de cadres au cours de la présentation du stimulus tactile est nettement plus importante chez les abeilles climatisées de l'abeille naïfs (Mann-Whitney U test, C 1 - C 2: P = 0,007). Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Discussion

Préparation des abeilles: Collecte et fixant les abeilles doit être fait rapidement, afin de maintenir le niveau de stress de la dépression animal. Le stress a un effet sur ​​la réactivité PER-et, par conséquent, pourrait avoir un effet indirect sur ​​les performances d'apprentissage des abeilles 19, 20. Le niveau de stress peut être diminué en plaçant les flacons de verre avec les abeilles directement sur la glace immédiatement après le prélèvement pour les immobiliser rapidement. Il doit être pris en compte que les abeilles ont besoin de plus de temps pour récupérer plus la période avant l'anesthésie est.

Vision a un effet négatif sur l'apprentissage tactile chez les abeilles 18. Par conséquent, il est important de boucher la vision en peignant les yeux de l'animal. Afin d'augmenter le contraste visuel des enregistrements vidéo, il est recommandé d'utiliser de la peinture blanche (par exemple, Tipp-Ex). Il faut prendre soin de ne pas obtenir les antennes en contact avec la peinture.

Apprendretion des performances: Des études antérieures en laboratoire et sur ​​le terrain ont montré que la sensibilité de saccharose dans abeilles butineuses affecter leur capacité d'apprentissage associatif 21, 22. Sensibilité élevée de saccharose est positivement corrélée avec l'acquisition tactile de meilleure qualité et performances de discrimination. Butineuses de pollen d'une colonie d'abeilles sont en moyenne plus sensibles aux butineuses de nectar de saccharose dans la plupart des semaines de la saison de recherche de nourriture 23. Ils peuvent être facilement identifiés par les pelotes de pollen sur leurs pattes de derrière et a pris à l'entrée de la ruche. Butineuses de nectar avec une sensibilité élevée de saccharose peut être capturé à la fin de la saison de butinage, entre Septembre et Octobre. Ils peuvent être sélectionnés sur les départs artificiels remplis d'eau faible teneur en sucre concentré situées à environ 20 m de la ruche 23.

Les performances d'apprentissage et de formation de la mémoire dépend fortement de l'état de satiété d'une abeille pendant le conditionnement 25. Un péri plus faimod avant le conditionnement, par exemple la nuit, peut améliorer le comportement et l'apprentissage associatif augmenter le niveau de motivation de l'animal.

Conditionnement tactile: Le PAR est utilisé en tant que réponse non conditionnée dans un protocole d'apprentissage appétitive 14. Par conséquent, il est crucial que toutes les abeilles testées montrent une extension complète PAR le stimulus inconditionnel (stimulus sucre) avant conditionnement. Les abeilles qui ne répondent pas à la stimulation du sucre doit être mis au rebut ainsi que les abeilles qui répondent avec un PER lors d'un contact antennaire avec le stimulus tactile avant le conditionnement. Dans le cas contraire, la réactivité très faible ou très élevée de ces animaux confondre la courbe d'apprentissage.

Le stimulus tactile utilisé dans ce protocole (cube en laiton avec grilles horizontales) a été choisie au hasard. Les abeilles domestiques peuvent également être conditionnée à différents stimuli tactiles avec différentes formes et textures (voir 10).

Pour comparer l'acquisition de différents groupes d'abeilles butineuses (par exemple Nectar Pollen-contre), un score d'acquisition peut être calculé 21. Ce score est le nombre total de réponses conditionnées à la CS et il a une plage comprise entre 0 (pas conditionnée PER) et 5 (PAR conditionnée après chaque essai de conditionnement).

Analyse vidéo: Différentes analyses vidéo méthodes ont été utilisées dans le passé pour quantifier les changements dans le comportement de mouvement antennaire dans 26 abeilles, 27. Notre méthode a l'avantage d'analyser les mouvements des antennes sans nécessiter marqueurs réfléchissants sur les antennes et les avantages de la diversité des outils de traitement d'images sous Matlab. A titre d'exemple, on peut également analyser le calendrier de antenncontacts al envers un objet, déterminer la vitesse de déplacement antennaire, calculer les positions angulaires des antennes en référence aux axes du corps ou de discriminer entre le mouvement antennaire gauche et à droite.

Un PER qui se produit pendant l'enregistrement de la réponse à l'objet antennaire chez les abeilles climatisation pourrait interférer avec le côté de détection automatique de l'antenne. Dans ce cas, il est nécessaire de modifier le film, par exemple dans VirtualDub, et de masquer l'objet qui interfère avec le processus de détection, par exemple en couvrant la section où la trompe apparaît avec une couche grise de la même forme.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Joachim Erber pour nous introduire dans le paradigme de l'apprentissage tactile chez les abeilles. Ce travail a été soutenu par le Pôle d'excellence de 277 CITEC, financé dans le cadre de l'Initiative d'excellence allemande.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pollen foragers, Apis mellifera L. Private hives
Glass vials (22 x 45 mm) Carl Roth GmbH Co X655.1
Brass tubes, 10 x 30 mm Self-produced
Brass cube, 3 x 5 mm Self-produced
Tipp-Ex (solvent-free) Tipp-Ex GmbH Co KG
Sucrose solution (30%) Household suger diluted in water
Ethanol (70%) Carl Roth GmbH Co 9065.3
Syringe (1 ml) and needle (0.6 x 25) Carl Roth GmbH Co 59.1
Stop Watch Carl Roth GmbH Co L423.1
Micromanipulator Märzhäuser MM33 00-42-101-0000
Digital video camera Basler A602f-2
Macro lens for camera TechSpec VZM 200
Matlab R2009b The MathWorks

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References

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Comments

1 Comment

  1. can this protocol apply in other kinds of stimulus,such as vision cues or sound?

    Reply
    Posted by: Hong en T.
    April 26, 2014 - 12:54 AM

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