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Immunology and Infection

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Summary

Citrobacter infezione rodentium fornisce un valido modello per studiare le infezioni batteriche intestinali così come la risposta immunitaria e colite nei topi. Questo protocollo descrive la misura di integrità della barriera, il carico patogeno e danno istologico che permette per la caratterizzazione completa dei contributi patogeni e di accoglienza per murino colite infettiva.

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Bhinder, G., Sham, H. P., Chan, J. M., Morampudi, V., Jacobson, K., Vallance, B. A. The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis. J. Vis. Exp. (72), e50222, doi:10.3791/50222 (2013).

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Abstract

Questo protocollo descrive i passi necessari per produrre un modello robusto di malattie infettive e colite, così come i metodi utilizzati per caratterizzare Citrobacter rodentium infezione nei topi. C. rodentium è un batterio gram negativo, murino specifico patogeno batterico che è strettamente legata alla clinicamente importante enteropatogeno E. umana patogeni coli e E. enteroemorragica coli. Dopo infezione con C. rodentium, topi immunocompetenti soffrono di perdita di peso modesto e transitorio e diarrea. Istologicamente, allungamento cripta intestinale, infiltrazione di cellule immunitarie, e la deplezione delle cellule calice si osservano. Liquidazione di infezione è raggiunto dopo 3 o 4 settimane. Misurazione della barriera epiteliale intestinale integrità, carica batterica, e danno istologico a tempi diversi dopo l'infezione, consentono la caratterizzazione dei ceppi di topi suscettibili all'infezione.

Il meccanismo di virulenzas con il quale batteri patogeni colonizzano il tratto intestinale dei loro ospiti, così come le risposte di accoglienza specifici che difendono contro le infezioni siano poco conosciuti. Pertanto l'C. rodentium modello di infezione batterica enterica è uno strumento prezioso per aiutare la nostra comprensione di questi processi. Batteri enterici sono stati collegati a malattie infiammatorie intestinali (malattie infiammatorie dell'intestino). È stato ipotizzato che le risposte infiammatorie croniche disadattivi visti in pazienti IBD sviluppano in individui geneticamente predisposti dopo esposizione anormale del sistema immunitario della mucosa intestinale di batteri enterici. Pertanto, lo studio di modelli di colite infettiva offre un notevole potenziale per la definizione di risposta dell'ospite potenzialmente patogeni per i batteri enterici. C. rodentium colite indotta da uno di questi modelli è raro che permette l'analisi delle risposte di accoglienza per i batteri enterici, la nostra comprensione dei potenziali meccanismi di patogenesi IBD;essenziale nello sviluppo di nuovi trattamenti preventivi e terapeutici.

Introduction

Infezione da batteri patogeni enterici innesca gastrointestinale (GI) infiammazione, nonché intestinale patologia e fisiopatologia, incluse diarrea e disfunzione barriera epiteliale intestinale. I meccanismi di virulenza di batteri patogeni che colonizzano il tratto gastrointestinale dei loro ospiti, così come le risposte di accoglienza specifici per difendersi contro tali infezioni sono poco conosciuti, ma recenti progressi nella modellazione di enterici infezioni batteriche hanno iniziato ad aiutare la nostra comprensione di questi processi. Batteri enterici sono stati collegati a malattie infiammatorie intestinali (malattie infiammatorie dell'intestino). La malattia di Crohn malattie infiammatorie dell'intestino (CD) e UC sono malattie complesse di eziologia sconosciuta, caratterizzata da infiammazione cronica intestinale e danni ai tessuti. Molti modelli murini di infiammazione intestinale esistono, da infiammazione spontanea in ceppi geneticamente modificati, come IL10 - / - topi, alle sfide con composti chimici, come destrano solfato sodico (DSS) e dinitrobenzene solfonico (DNBS) 1. È stato ipotizzato che le risposte infiammatorie croniche disadattivi presenti nei pazienti IBD sviluppano in individui geneticamente predisposti dopo esposizione anormale del sistema immunitario della mucosa intestinale di batteri enterici 2, quindi lo studio dei modelli di colite infettiva offre anche notevoli potenzialità per definire potenzialmente patogeni ospitante . risposte a batteri enterici Citrobacter rodentium colite indotta è uno dei pochi modelli di colite infettiva che è stata ben caratterizzata 1,3, consentendo l'analisi delle risposte dell'ospite ai batteri enterici e ulteriore comprensione dei potenziali meccanismi di patogenesi IBD; un passo essenziale per lo sviluppo di nuovi trattamenti preventivi e terapeutici.

C. rodentium è un gram negativo fissaggio e effacing (A / E), murino specifico patogeno batterico che è strettamente legata alla umana importantepatogeni enteropatogeno E. coli (EPEC) e enteroemorragica E. coli (EHEC) 3-8. La famiglia di una patogeni / E intimamente collegare alla membrana apicale della cellula ospite dell'epitelio cecale e colon, formando un non-invasiva piedistallo struttura simile sulla cellula ospite. Sfida orale con C. rodentium di 10 8 -10 9 organismi produce un robusto modello di colite infettiva caratterizzata da iperplasia del colon o allungamento delle cripte, infiltrazione di cellule mononucleate immunitario e deplezione delle cellule calice 3,4. Il sito iniziale di colonizzazione, poche ore dopo la sfida, è la patch cieco, seguita dalla progressione verso il colon distale 2 o 3 giorni dopo l'infezione 3. In ceppi di topi immunocompetenti, la clearance del patogeno viene raggiunto 3 a 4 settimane dopo l'infezione 1,3,4. Tuttavia, molti ceppi geneticamente modificati, cioè gene carente o knockout (- / -) topi, sono stati trovati per visualizzare Increased suscettibilità alle infezioni con conseguenti danni esagerato e / o infezione e infiammazione cronica 9-14. L'utilizzo di questo modello di colite infettiva in questi ceppi ad eliminazione diretta, molti mancano innate proteine ​​di segnalazione, è stato indispensabile nel rivelare proteine ​​ospite diverse integrali alla risoluzione di infezione intestinale e l'infiammazione.

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Protocol

1. Preparazione di Citrobacter rodentium inoculo e sonda gastrica di topi

  1. Preparare e sterilizzare in autoclave Luria Bertani brodo (LB).
  2. Ottenere vitale C. rodentium da uno stock di glicerolo congelata e striscia sulla piastra LB agar con un'ansa sterile da inoculo o punta della pipetta. Incubare a 37 ° C per una notte. Inoculare 3 ml di brodo LB sterile in una provetta di coltura falcon con colonie dalla piastra LB utilizzando una ansa o punta della pipetta. Preparazione dell'inoculo deve essere fatto utilizzando tecniche asettiche.
  3. Incubare la C. cultura rodentium aerobiosi a 37 ° C per una notte in una incubazione banco agitatore a 200 rpm. Il brodo LB inoculato dovrebbe apparire torbida dopo la coltura durante la notte.
  4. Usare una lampadina punta dell'ago gastrica gavage attaccato ad una siringa da 1 ml per gavage ciascun topo con 100 microlitri della overnight C. rodentium cultura. Delicatamente collottola il mouse, impugnando saldamente la pelle flaccida sul suo collo e schienacon il pollice e le dita. Tirare indietro la testa dell'animale con il dito indice per immobilizzare la testa e raddrizzare l'esofago per l'inserimento dell'ago gavage.
  5. Mantenere il mouse in posizione verticale e dirigere la punta dell'ago bulbo gavage lungo il lato della sua bocca e sulla sua lingua. Delicatamente passare l'ago lungo il tetto della bocca e farlo avanzare l'esofago. In caso di resistenza che avverte durante questa procedura, rimuovere l'ago gavage e reinserirla.
  6. Lentamente iniettare 100 ml di inoculo batterico e rimuovere delicatamente l'ago gavage. Monitorare la frequenza respiratoria e il comportamento del mouse dopo il ritorno alla sua gabbia.

Note:

  • Nelle fasi 2 e 3, anche preparare una provetta di coltura falcon utilizzando tecniche asettiche con 3 ml di brodo LB sterile per essere coltivate durante la notte per assicurare che non vi è alcuna contaminazione batterica del brodo stesso. Il brodo LB dovrebbe apparire chiaro dopo coltura durante la notte.
  • Durante la notte la cultura deve essere eliminata se è stato inoculato per oltre 24 ore.
  • Tutti C. infezioni rodentium e abitazioni di animali infetti deve essere effettuata in un impianto di livello di biosicurezza 2.

2. Misurazione del colon permeabilità epiteliale Barriera in C. rodentium topi infettati

  1. Misurare integrità della barriera in un punto temporale desiderato post-infezione.
  2. Il giorno del saggio, preparare abbastanza 4 kDa isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano dissolto in tampone fosfato (PBS) ad una concentrazione di 80 mg ml -1 per gavage ciascun topo con 150 microlitri e preparare la curva standard.
  3. Scruff il mouse e sonda gastrica con 150 ml di FITC-destrano. Estrarre il cibo dalla gabbia in questo momento.
  4. Anestetizzare topi 4 ore dopogavaging e raccogliere il sangue il più possibile (~ 450 microlitri) tramite puntura cardiaca. Aggiungere il sangue ad una concentrazione finale del 3% acido citrato destrosio in una provetta da microcentrifuga per scoraggiare coagulazione. Eutanasia i topi e raccogliere i tessuti del colon in PBS per la conta batterica (passi 3,1-3,5) e in formalina al 10% per la fissazione dei tessuti e, infine, colorazione di immunofluorescenza (passi 4,1-4,8).
  5. Centrifugare i campioni di sangue a 1000 xg per 12 min in una centrifuga a 4 ° C. Raccogliere il siero e diluire a 1/10 e 1/100 in PBS. Aggiungere 100 pl di ciascun campione a questi due diluizioni ad una piastra a 96 pozzetti in replicati.
  6. Per preparare la curva standard, diluire l'originale 80 mg ml -1 FITC-destrano usato per sonda gastrica i topi in PBS per le seguenti concentrazioni: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, e 0 mg / ml . Aggiungere 100 pl di ciascuna concentrazione di una piastra a 96 pozzetti in triplicato.
  7. Quantificare la fluorescenza di ciascun campione utilizzando un fluorimetro a una eccitazione wavelength di 485 nm e 535 nm di lunghezza d'onda di emissione.
  8. Analizzare i dati grezzi tracciando la curva standard. Inserire i dati grezzi per ciascun campione nell'equazione della linea generata dalla curva standard per determinare la concentrazione di FITC-destrano in ciascun campione.

Note:

  • Dal punto 4 in poi, tenere i campioni di sangue in ghiaccio e ridurre al minimo l'esposizione alla luce.
  • Quando si misura l'integrità della barriera epiteliale un punto di tempo, o prima, 7 giorni dopo l'infezione è ottimale, in quanto gravi danni ai tessuti avviene dopo questo punto. Misurazione integrità della barriera prima che si verificano gravi danni permette di determinare le differenze massime di permeabilità durante C. infezione rodentium tra ceppi di topi.
  • Assicurarsi che topi di controllo non infettate sono anche testati per l'integrità della barriera epiteliale.

3. Misura della carica batterica in tessuti di C. rodentium topi infettati

  1. Aggiungere 1 ml di PBS sterile unnd un metallo sterilizzato tallone ad un fondo tondo 2 tubi da centrifuga ml utilizzando una tecnica asettica. I singoli tessuti prelevati da ciascun animale sarà posto in tubi separati PBS. Pesare i tubi prima dell'aggiunta del tessuto.
  2. Rimuovere il cieco e colon dal mouse. Separare il cieco dal colon e spingere il contenuto luminale con una pinzetta. Aggiungere il contenuto in un tubo di PBS. Dopo aver separato le sezioni 0,5 centimetri dal colon distale e cieco per il 10% fissazione in formalina, aprì il colon rimanente e cieco longitudinalmente e lavare con PBS sterile prima di mettere i tessuti in tubi.
  3. Pesare i tubi PBS con il tessuto e poi omogeneizzare i campioni utilizzando un battitore tallone per 6 min a 30 Hz.
  4. Utilizzando tecniche asettiche, aggiungere 180 microlitri di PBS sterile per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 20 microlitri di ciascun campione omogeneizzato al primo pozzetto in ciascuna riga. Mescolare bene e diluire serialmente, aggiungendo 20 microlitri di ogni precedente e di ottenere diluizioni da 10 -1 (prima sill) a 10 -6. Piastra 10 microlitri di ogni diluizione di ciascun campione in triplicato su una lastra quadrata LB inferiore con una griglia. Incubare per una notte a 37 ° C.
  5. Contare le unità formanti colonie (CFU), quindi la media dei 3 punti, e registrare la diluizione alla quale è stato contato ogni campione. Moltiplicare media di 50 CFU, come 20 pl del campione originale 1 ml è stato usato, e per il fattore di diluizione alla quale è stato contato il campione risultante in CFU / ml. Infine, dividere per il peso del tessuto per determinare CFU / g.

4. La valutazione istologica e colorazione immunofluorescenza dei tessuti infetti Colon

  1. Raccogliere tessuti come nel passo 3,2. Tessuti Conservare in formalina durante la notte, poi lavare con etanolo al 70%. Incorpora tessuti in paraffina e tagliati 5 sezioni micron per la colorazione. Colorazione con ematossilina & eosina per la valutazione istologica e procedere con i seguenti passi per la colorazione di immunofluorescenza.
  2. Per Deparaffinare tessuti prima della colorazione, posto scorre inuna vaschetta di colorazione Coplin e mettere in 65 ° C bagnomaria per 10 min. Quindi, porre i vetrini in xilene per quattro lavaggi di 2 minuti ciascuna. Vetrini devono poi essere reidratato con due lavaggi di 5 minuti in etanolo al 100%, seguiti da un lavaggio 5 min in ciascuna delle seguenti: 95% di etanolo, 75% etanolo e dH 2 0. Questi lavaggi dovrebbe essere fatto in una cappa per evitare esposizione a vapori nocivi.
  3. Immergere i vetrini nella vaschetta Coplin con pre-riscaldato tampone sodio citrato e poi posto in un vapore per 30 minuti, poi lasciate riposare per 30 min. Questo processo spezza le proteine ​​legami incrociati formate da fissazione in formalina recuperando potenziali siti antigenici.
  4. Lavare con PBS azide per 5 min, tre volte. Vetrini asciutti e zona marchio intorno al tessuto con una penna PAP per creare una barriera idrofoba, mantenendo i reagenti di colorazione localizzati sul tessuto.
  5. Tessuto blocco per 1 ora a temperatura ambiente con tampone di bloccaggio (ad esempio α-siero di capra) in una camera umida immunocolorazione.
  6. Diluire primanticorpo ary alla concentrazione desiderata con tampone di diluizione anticorpo. Versare tampone bloccante ed aggiungere 50-100 ml di anticorpo primario e tessuti. Incubare a 4 ° C durante la notte oa temperatura ambiente per 2 h.
  7. Lavare con PBS azide per 5 min, tre volte. Aggiungere 50-100 microlitri di anticorpo secondario diluito in tampone di diluizione anticorpo ai tessuti e incubare a temperatura ambiente per 1 h al buio. Lavare con dH 2 O per 5 minuti, per tre volte.
  8. Disidratare diapositive, aggiungere DAPI Prolong medio oro di montaggio e applicare un vetrino coprioggetti. Visualizza vetrini al microscopio a fluorescenza.

Note:

  • PBS azide può essere sostituito con PBS preparata come alternativa per evitare la crescita batterica nel mezzo di lavaggio dal punto 4 in poi.

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Representative Results

Durante un esperimento di infezione standard, i topi sono infettati con circa 2,5 x 10 8 UFC mediante sonda gastrica di 100 pl C. overnight rodentium cultura. Infezione di topi C57BL / 6 con C. rodentium risultati in perdita di peso modesto e transitorio e diarrea. Anche se un evento raro con C57BL / 6 topi, gli animali possono ammalarsi e richiedere euthanization. Pertanto, i topi devono essere monitorati per grado di perdita di peso e sintomi di disagio come pelliccia piloerect e postura ricurva, per determinare la misura in cui sono interessate ceppi diversi dall'infezione.

I risultati presentati nelle figure da 1 a 4 sono rappresentativi di un'infezione fatto usando una coltura overnight preparato da uno stock di glicerolo congelata. A 7 giorni dopo l'infezione, i topi sono stati anestetizzati e il sangue è stato raccolto mediante puntura cardiaca. Figura 1 mostra FITC-destrano misurata nel sierodi topi C57BL / 6, così come da Toll come topi knockout recettore 2 (TLR2), che sono stati precedentemente trovati esporre compromessa l'integrità della barriera epiteliale durante l'infezione 9. In presenza di un intatto barriera epiteliale intestinale, 4 kDa FITC-destrano è scarsamente permeabile attraverso questo strato. Pertanto, aumento dei livelli di FITC-destrano nel siero suggeriscono una compromissione della integrità della barriera epiteliale intestinale in corso di infezione permettendo a questa molecola a perdere tutta. Come controllo, i livelli sierici di topi infettati con gavaged FITC-destrano sono anche presentati.

Di una settimana dopo l'infezione, carica batterica nel colon sono stati trovati a picco intorno 10 9 UFC / g 3,4. Carica batterica può essere misurata in punti di tempo desiderato dopo infezione di confermare l'infezione, nonché per valutare se i topi knockout diversi soffrono aumentato o diminuito oneri batteriche. Come C. rodentium è un patogeno che può luminale intimamente adhere a cellule epiteliali intestinali, carica batterica contenuto del lume, cieco, colon e tessuti può essere misurata. Figura 2 mostra tipici cariche batteriche misurati a 7 giorni post-infezione tessuti cecale e colon così come nel lume intestinale di C57BL / 6 topi.

La maggior parte della patologia osservata durante C. rodentium infezione nei topi C57BL / 6 avviene nelle distali 2 cm di colon11. Macroscopicamente da 7 giorni post-infezione, un ispessimento della mucosa del colon e un accorciamento della lunghezza del colon si osserva, con poco danno palese visto in topi C57BL / 6. Normalmente durante l'infezione, topi C57BL / 6 soffrono solo moderata infiammazione e patologia caratterizzata istologicamente da infiltrazione di cellule immunitarie, allungamento dei follicoli del colon e deplezione delle cellule goblet (Figura 3).

Come si è visto nelle sezioni H & E in figura 3, le risposte di accoglienza di montaggio di più duranteING infezione da C. rodentium. Per caratterizzare ulteriormente questi cambiamenti, colorazione di immunofluorescenza può essere utilizzato per esaminare i cambiamenti nelle proteine ​​di interesse, come ad esempio i marcatori di proliferazione, morte cellulare, o le risposte immunitarie innate e adattative. Colorazione per immunofluorescenza è prezioso anche in esame aspetti della risposta batterica, quali la sua localizzazione all'interno del tessuto infetto. Un esempio di questa tecnica di colorazione, esaminando un host proteina Ki67 (rosso), un marcatore per la proliferazione cellulare e l'C. rodentium proteina tir, verde, esaminare localizzazione batterica a 12 giorni post-infezione è presentato nella Figura 4.

Figura 1
Figura 1. Misurazione di siero FITC-destrano per valutare l'integrità della barriera epiteliale. Topi sono statigavaged con 4 kDa FITC-destrano in condizioni non infetti e a 7 giorni dopo l'infezione, in seguito alla quale siero FITC-destrano sono stati determinati i livelli. C57BL / 6 (WT) topi mostrano un trascurabile aumento FITC-destrano livelli sierici a 7 giorni post-infezione rispetto a condizioni non infetti. Al contrario, TLR2 - / - mice hanno notevolmente aumentato i livelli di FTIC-destrano nel siero rispetto al basale integrità suggerendo barriera gravemente compromessa in questo sforzo durante C. infezione rodentium, come è già stato dimostrato.

Figura 2
Figura 2. C. carico rodentium in lumen, cieco e del colon di C57BL infetti / 6 topi a 7 giorni dopo l'infezione. Lumen, cieco, colon e nei tessuti sono stati raccolti, omogeneizzati, e placcato in serie-diluizione in agar LB. Ogni cIrcle rappresenta un singolo campione raccolto dai singoli animali. Le linee continue indicano la media geometrica, mentre le barre di errore verticali indicano SEM.

Figura 3
Figura 3. L'analisi istologica dei danni causati da C. infezione rodentium. al 7 ° giorno post-infezione moderata infiltrazione delle cellule immunitarie, così come l'allungamento delle cripte, deplezione delle cellule goblet e lieve edema si osserva rispetto al controllo del tessuto infetto. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 4
Figura 4. Colorazione di immunofluorescenza non infetto e il giorno 12 post-infezionezione tessuti di topi C57BL / 6. distale dei tessuti del colon è macchiato per la proteina Ki67 ospitante (rosso) e il C. rodentium proteina tir (verde).

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Discussion

Citrobacter infezione rodentium fornisce un valido modello per lo studio di entrambi malattie infettive e colite nei topi. Questo modello unico consente la caratterizzazione di entrambe le risposte dell'ospite, come pure le proprietà di batteri patogeni. La procedura descritta in questo particolare protocollo il successo nell'uso di questo modello.

Ci sono diversi passaggi critici di questo protocollo da tenere a mente quando si induce la colite e l'analisi delle risposte. Primo, la preparazione di un nuovo C. overnight inoculo rodentium in brodo LB è richiesto per l'infezione di topi successo. Come una dose di 10 8 -10 9 organismi è necessaria per infettare maggior parte dei ceppi di topi, se l'inoculo viene lasciato nel shaker o sul banco a temperatura ambiente per lunghi periodi, non ci sarà sufficiente organismi vitali rimanenti nella cultura di indurre colite momento dell'infezione. E 'anche importante per agitare l'inoculo batterico primacaricamento della siringa per infezione, per garantire che ogni topo riceve una dose uguale di batteri. Quando si raccolgono su tessuti terminus dell'infezione, la completa immersione dei tessuti del colon in un ampio volume di formalina al 10% è necessario per il fissaggio del tessuto adeguata a verificarsi. Si suggerisce che i tessuti è aggiunto formalina in una fiala da 5 ml, piuttosto che in provette da microcentrifuga come un rapporto di 10:1 di fissativo al tessuto è raccomandato. La corretta fissazione è essenziale per una successiva analisi istologica, nonché colorazione per immunofluorescenza di questi tessuti. E 'anche importante tenere presente che ceppi knockout differenti avranno vari risposte dopo induzione di C. rodentium colite. Quando infettare un nuovo ceppo per la prima volta, i topi devono essere strettamente monitorati per determinare un umano end-point per l'esperimento, se necessario. Punti di tempo per l'analisi di integrità della barriera epiteliale, cariche batteriche e istologia può essere definita in base alla risposta del mouseceppo di interesse per l'infezione.

Come placcatura di omogenati di tessuto su piastre LB per determinare carica batterica non è un metodo del tutto selettivo, l'esecuzione di una PCR C. rodentium gene specifico colonie batteriche può essere fatto per differenziare C. rodentium da bacterialcolonies altri sulla piastra. Un'altra opzione è quella di omogenati di tessuto sulla piastra agar MacConkey, poiché questo mezzo è più selettivo per C. rodentium di agar LB. Un approccio alternativo è quello di utilizzare un streptomicina resistente wild-type C. ceppo instead.Substitution rodentium con un ceppo resistente streptomicina comporta l'induzione della colite stesso modello descritto in questo protocollo. Il vantaggio di utilizzare il ceppo resistente streptomicina è più facile per l'analisi delle cariche batteriche, come omogenati di tessuto da queste infezioni possono essere piastrate su LB agar integrato con streptomicina piuttosto che agar LB sola. Questo evita il potenziale di crescita del commmicrobi ensal sul piatto, rendendo il processo di conteggio CFU più facile e più accurata. Un'altra alternativa durante la misurazione cariche batteriche, è di incubare le piastre dopo placcatura diluizioni di omogenati di tessuto su agar LB sia a 37 ° C durante la notte oa temperatura ambiente per 2-3 giorni, con conseguente rallentamento della crescita batterica, prima del conteggio.

Questo protocollo descrive i passi necessari per produrre un modello robusto di colite infettiva, così come i metodi utilizzati per caratterizzare C. rodentium infezione nei topi. Oltre a utilizzare questo modello per esaminare agenti patogeni-ospiti interazioni e le risposte immunitarie, può anche essere utilizzato per studiare come una infezione batterica può aumentare il rischio di cancro al colon. Questo può essere fatto esponendo C. rodentium infettato topi al azoxymethane cancerogeno, o studiando come l'impatto delle infezioni sulla proliferazione delle cellule epiteliali, o sui geni coinvolti nella differenziazione delle cellule epiteliali o lo sviluppo del tumore 15. Noizione del modello di colite infettiva descritta in questo protocollo, i numeri di batteri può essere valutata a siti extra-intestinali, come i linfonodi mesenterici, della milza e del fegato. Numeri più alti in questi organi possono indicare che il ceppo di topo in prova è altamente suscettibile all'infezione. Utilizzando la tecnica di immunofluorescenza colorazione descritta, un numero virtualmente infinito di meccanismi in risposta alle infezioni possono essere esplorati. Una volta familiarità con le tecniche descritte qui, il protocollo può essere modificato per raccogliere tessuti per misurare altri punti finali, come per l'estrazione dell'RNA e la valutazione dei livelli di espressione genica, di caratterizzare più accuratamente risposte a C. rodentium infezione.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni di funzionamento a BAV dal morbo di Crohn e Colite Foundation of Canada (CCFC) e degli Istituti canadesi di ricerca sulla salute (CIHR). GB è stato finanziato da una borsa di studio laureato CIHR. BAV sono i bambini con disturbi intestinali e del fegato (BAMBINO) presidente della Fondazione di Ricerca Pediatrica IBD e il Canada Research Chair in Gastroenterologia Pediatrica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Luria Broth ABM G247 Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using.
Square bottom plate with grid Fisher 08-757-11A
Falcon culture tube Sarstedt 62.515.006
Bulb tipped gastric gavage needle Fine Science Tools 18060-20
1 ml syringe BD Biosciences 309659
4 kDa FITC-dextran Sigma FD-4
Citric acid Sigma C7129
Sodium citrate Fisher S279-500
Dextrose Fisher D16.1
Acid citrate dextrose 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose
Black 96-well plate Fisher 07-200-762
Metal beads (5 mm) Qiagen 69989
10% formalin Fisher 5F93-4
5 ml vial DiaMed STK3205
Hematoxylin Fisher H345-23
Eosin Fisher E511-100
Xylene Fisher HC700-1GAL
Tween 20 Sigma P5927
Coplin staining jar VWR 47751-792
Sodium citrate buffer 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0
Pap pen Cedarlane Mu22
Goat serum Sigma G902-3
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher BP1600-100
Triton X-100 Sigma T8532
Sodium azide Sigma SZ002
Blocking buffer 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C.
Antibody dilution buffer 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA
Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20)
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen P-36931
Coverslips Fisher 12.54SE
Benchtop incubation shaker Barnstead Lab Line Max Q4000
Fluorometer Perkin Elmer Victor2D
Refrigerated centrifuge Beckman Coulter Microfuge 22R
Steamer Black Decker
Fluorescence microscope Zeiss Axio Image.Z1

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References

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