Diseño y uso de arrays de quimiostato multiplexados

Published 2/23/2013
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Biology
 

Summary

Hemos desarrollado y validado una serie de pequeñas dimensiones, de quimiostatos miniatura construidas con piezas fácilmente disponibles por un costo bajo. Resultados de la evolución fisiológica y experimental fueron similares a quimiostatos de mayor volumen. La matriz Ministat proporciona una plataforma compacta, barata, y accesible para los experimentos chemostat tradicionales, genómica funcional, y aplicaciones químicas de detección.

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Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262, doi:10.3791/50262 (2013).

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Abstract

Quimiostatos son sistemas de cultivo continuo en el que las células se cultivan en un muy controlado, ambiente químicamente constante donde está limitada la densidad de cultivo mediante la limitación de nutrientes específicos. 1,2 Datos de quimiostatos son altamente reproducibles para la medición de caracteres cuantitativos, ya que proporcionan una tasa de crecimiento constante y el medio ambiente en estado estacionario. Por estas razones, quimiostatos se han convertido en herramientas útiles para la caracterización a escala fina de la fisiología a través del análisis de la expresión génica 3-6 y otras características de los cultivos en equilibrio de estado estacionario. 7 experimentos a largo plazo en quimiostatos puede resaltar trayectorias específicas que las poblaciones microbianas adopten durante la evolución adaptativa en un entorno controlado. De hecho, quimiostatos se han utilizado para la evolución experimental desde su invención. 8 Un resultado común en experimentos de evolución está para cada réplica biológica para adquirir un repertorio único de mutaciones9-13. Esta diversidad indica que aún queda mucho por descubrir mediante la realización de experimentos de evolución con un rendimiento mucho mayor.

Se presenta aquí el diseño y operación de una relativamente simple, de bajo costo de matriz quimiostatos-o miniatura ministats-y validar su uso en la determinación de la fisiología y en experimentos de evolución con levadura. Este enfoque implica el crecimiento de decenas de quimiostatos funcionan con una sola multiplexado bomba peristáltica. Los cultivos se mantienen en un volumen de 20 ml de trabajo, que es práctico para una variedad de aplicaciones. Tenemos la esperanza de que el aumento de rendimiento, disminución de gastos, y la disponibilidad para la construcción detallada e instrucciones de operación también pueden motivar la investigación y la aplicación industrial de este diseño como una plataforma general para caracterizar funcionalmente gran número de cepas, las especies y los parámetros de crecimiento, así como la genética o bibliotecas de medicamentos.

Introduction

La dinámica del crecimiento microbiano y la evolución son fundamentales para la microbiología, la ecología, la genética y la biotecnología. El método más común de los microbios de cultivo es en lotes, donde las células se inoculan a baja densidad en caldo rico en nutrientes y se cultivaron hasta saturación. Aunque fácil de realizar utilizando un equipo estándar de laboratorio, cultivos discontinuos experimentar un ambiente químico fluctuante y en consecuencia cambiar la fisiología celular. Este entorno de crecimiento heterogéneo puede resultar en efectos secundarios de crecimiento y estrés que pueden enmascarar sutiles diferencias fisiológicas. Evolución experimental mediante transferencia por lotes de serie puede seleccionar para mezclas complejas de subpoblaciones fase de crecimiento específicos, lo que complica los intentos de conexión adaptaciones específicas para condiciones selectivas. Medición de caracteres cuantitativos puede ser difícil debido al ruido de sincronización de la muestra imprecisa y la variación en las características tales como tiempo de retraso. Cultivos continuos proporcionan una alternativarégimen de crecimiento donde las células puede ser reproducible cultivada en un medio químicamente homogénea a una tasa de crecimiento definido para alcanzar un estado de equilibrio fisiológico. Debido a estas ventajas, los estudios de evolución experimental y caracterización del estado celular utilizan a menudo el ambiente controlado de cultivos continuos como el quimiostato. 14

Valoración de estas ventajas ha llevado a un resurgimiento del interés en chemostat culturas. 15 Desde su introducción en 1950, 1,2 chemostat sistemas han sido desarrollados para funcionar en una variedad de escalas que van desde litros a microlitros y para una variedad de aplicaciones. 16 -19 Estos diseños diferentes, que van desde biorreactores producidos comercialmente a los buques glassblown a las plataformas de microfluidos personalizados, comparte los principios generales de diseño. Una cámara de cultivo se agita y se airea (generalmente por burbujeo de aire a través de él) y los microbios contenidos en el mismo se mantiene homogéneaLy dispersado por toda la cámara de cultivo en todo momento. Medio fresco de la composición definida se añade continuamente y la velocidad de adición controla la tasa de crecimiento y la influencia del entorno químico experimentado por el cultivo. Un desbordamiento establece el volumen de cultivo en el tubo de crecimiento, y a través de este desbordamiento de la cultura se muestrea a la misma velocidad a la que entra en medio fresco. De esta manera las culturas alcanzan rápidamente un estado fisiológico estable en el que muchos parámetros biológicos se mantienen constantes. A pesar de las ventajas de quimiostatos e informes de estas plataformas diferentes en la literatura, la adopción generalizada se ha visto limitado por dificultades en la construcción y operación de estos sistemas, y los altos costos asociados con las opciones comerciales. Además las descripciones de cómo realizar y utilizar estos dispositivos pueden ser opacas.

Se presentan diseños e instrucciones de uso de una matriz de pequeñas dimensiones, de quimiostatos miniatura construidos a partir de piezas fácilmente disponibles a bajo costo. Nos obsErve parámetros experimentales altamente consistentes y reproducibles resultados al comparar nuestro dispositivo con los datos reportados por levaduras cultivadas en biorreactores de mayor volumen comercial. Esto incluye la reproducibilidad de la fisiología celular como se ve a través de alcanzar el estado estacionario de equilibrio dentro de 10-15 generaciones y la obtención de densidades similares de cultivo en el equilibrio. Además, los patrones de expresión génica son consistentes entre ministats y una plataforma comercial de mayor volumen. Estabilidad de la tasa de dilución, la densidad óptica y la reproducibilidad de la expresión génica entre tres cultivos replicados demostrar la robustez de nuestra plataforma. También muestran que las mutaciones de adaptación surgen las mismas sobre escalas de tiempo similares evolución experimental como con quimiostatos de mayor volumen.

Protocol

Utilice una técnica estéril apropiada durante todo el protocolo.

1. Montaje de piezas y preparación para la matriz Ministat

  1. Encargar todas partes.
  2. Limpiar los tubos de vidrio. Marque los tubos con un volumen de 20 ml.
  3. Hacer asambleas de corcho con aire, medios de comunicación y los puertos de efluentes y colocarlos en la parte superior de los tubos de cultivo de vidrio limpios.
  4. Preparar cámaras de humidificación y organizar todas las piezas no tratadas en autoclave
  5. Hacer aire, efluentes, y los tubos de medios con longitudes suficientes tubos y acoplamientos compatible.
  6. Conecte cada tipo de tubería (aire, medios de comunicación y efluente) a los conjuntos de corcho y los filtros de papel de aluminio y los medios de comunicación. Conexión rápida a fin de prepararlos para el autoclave
  7. Preparar una bombona para su uso en la fabricación de chemostat medio estéril.
  8. Prepare las botellas de muestreo de cultivo mediante la inserción de un tapón de goma con dos orificios con los accesorios adecuados. Frustrar cada filtro para prepararlos para la autoclave.
  9. Fit la matriz montado fácilmente en una o más bandejas autoclave y dejar todas las partes.
  10. Marca y filtrar los medios de comunicación chemostat en bombonas autoclave.

2. Configuración de una prueba

  1. Llena cada frasco con 700 ml hidratación ddH 2 O.
  2. Coloque los ministats autoclave en el conjunto de bloque de calentamiento a la temperatura deseada.
  3. Coloque las compañías aéreas en el múltiple de 4 puertos y encienda la bomba de aire.
  4. Conecte los conductos de evacuación a las 100 botellas de la colección ml.
  5. Retirar la lámina desde el extremo de la tubería de medios de comunicación y medios de bombona y conectar el rápido de dos conecta. Pase cada uno de longitud de tubo de la bomba a través de un cartucho de bomba peristáltica y haga clic en su lugar. Encienda la bomba de medios de comunicación.
  6. Vamos a llenar las cámaras. Apague la bomba de medios de comunicación.
  7. Pulverizar los conjuntos de corcho con 70% de etanol y inocular los cultivos utilizando una jeringa. Guardar una muestra del inóculo como un stock de glicerol congeladosi se desea. Vamos culturas crecer durante 30 horas.
  8. Ajustar la altura de la aguja efluente hasta que el volumen de cultivo se ajusta a 20 ml con el flujo de aire apagado. Esto puede tardar varios ajustes en el transcurso de una hora. Cuando termine su vez el flujo de aire de nuevo.
  9. Encienda la bomba multimedia en.
  10. Vaciar las botellas de muestreo de efluentes, que contienen los medios de comunicación recogieron durante el ajuste del volumen de cultivo de trabajo, y registrar el tiempo.
  11. Para tomar un lugar medición del tiempo de cero a los conductos de evacuación en tubos de recolección estériles durante 15 minutos-2 horas (dependiendo de qué volumen desea muestrear para análisis de ADN). También hacer una reserva de glicerol congelado para cada cultura en este momento si lo desea.

3. Las mediciones diarias

  1. Al igual que con el tiempo-cero de medición, la muestra en hielo durante 15 min-2 h (como se requiere para la prueba) en hielo y registrar el tiempo de muestreo para el ADN y las muestras congeladas de stock.
  2. Para las muestras de ARN o bien recoger una pequeña volbio mediante una jeringa y una aguja 22G 5 "de la cultura o descorchar cada Ministat para cosechar toda la cultura. Las muestras deben ser tomadas rápidamente, recogió por filtración y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido.
  3. Mida el efluente retenido desde la última toma de muestras para cada Ministat para cuantificar la tasa de dilución. Ajuste de dilución si es necesario por el reajuste de la configuración de la bomba o el ajuste del ajuste fino en las líneas individuales de la bomba.
  4. Vuelva a colocar los conductos de evacuación en botellas de colección vacía.
  5. Cuantificar células / ml, así como criterios de valoración de interés y hacer una reserva de glicerol congelado.

4. Post-experimento limpieza

  1. Coloque todos los tubos en bandejas separadas y enjuagar excesivamente con ddH 2 O. Tubería seca con una bomba de acuario.
  2. Limpie los conjuntos de corcho con ddH 2 O y usar inserto la aguja para limpiar las agujas, aspirar y dispensar agua a su vez. Limpiar el exterior de las agujas y de corcho para eliminar cualquiermedios residuales.
  3. Limpiar el tubo de vidrio con agua y etanol, y eliminar los contaminantes físicos con 3 bola con Kimwipes y fórceps.
  4. Enjuague y seque todas las partes de nuevo antes de su uso.

Representative Results

La matriz Ministat descrito anteriormente y en la (Figura 1A, B) fue usado para cultivar una cepa de laboratorio MATa haploide de levadura de gemación (S288c) bajo condiciones limitantes de sulfato como se describe anteriormente. 10 Hemos probado la eficacia para aplicaciones chemostat comunes incluyendo la determinación de la fisiología y evolución experimental. Para validar los ministats, se repitió varios experimentos realizados anteriormente en fermentadores industriales modificados para uso quimiostato. 10,20,21 Sixfors ATR fermentadores se llevaron a cabo en un volumen de 300 ml de trabajo, más de diez veces el volumen de los ministats, y tienen modos considerablemente diferentes cultura de la aireación y agitación. Hemos intentado replicar estabilidad equipo, fisiología estado estacionario, los resultados experimentales evolución, y patrones de expresión génica obtenidos con estos fermentadores.

Dado que la uniformidad de la tasa de dilución y la aireación son aspectos importantes del diseño de quimiostato, que measured la tasa de dilución real a través de 32 ministats después de 15 generaciones de crecimiento y se ha encontrado que con una tasa de dilución objetivo de 0,17 vol / hr (4-5 gotas / min) se alcanzó una tasa de dilución promedio de 0,17208 con una desviación estándar de 0,0075 a través de 32 se replica. Esta gama estaba dentro de nuestro tolerancia típica de + / -0,01 vol / hr diferencia de la fijación de objetivos, más allá de que cambios a gran escala en la expresión génica se han observado. 22-23 Across 4 ministats la tasa de flujo de aire se determinó que era 307,5 ​​ml / min con una desviación estándar de 9,57 ml / min. Esto sugiere que el flujo de aire dentro de las cámaras es robusto y divide por igual entre las 4 cámaras y es un valor similar a la descrita para la aireación en fermentadores industriales. 20

Hemos observado anteriormente amplificación recurrente de la SUL1 transportador de alta afinidad de iones de azufre en 8.8 experimentos de evolución sulfato limitados en la levadura. 10 Teniendo en cuenta la coherencia de los resultados de acuerdo con thicondición s elegimos sulfato de limitación para poner a prueba la capacidad de nuestro sistema. Un elemento necesario de la cultura chemostat es la necesidad de mantener un ambiente químico constante. Las fluctuaciones en la abundancia de una limitación de nutrientes o cambios de otro tipo en el medio ambiente suelen dar lugar a un cambio en el número de células en un cultivo dado. Se midió la densidad óptica tal como un proxy para el número de células (Figura 2A) y la reproducibilidad medido a través de 16 cultivos replicados, encontrar un promedio A600 de 1,12 (~ 10 9 células) después de ~ 15 generaciones de crecimiento con una desviación estándar de 0,057 unidades, o 5,1 %. Para la comparación, las medidas tomadas de 4 cultivos replicados cultivadas en los fermentadores industriales mostraron una desviación estándar de 2,5%. Las células fueron bien mezclados en la cámara de crecimiento: mediciones de OD y recuento de células tomadas de la pista efluente eran equivalentes a las muestras tomadas directamente desde el tubo de cultivo (datos no mostrados). Estos resultados demuestran la solidez de nuestra plataforma de und capacidad para mantener un ambiente químico constante con una tolerancia similar a la del fermentador industrial.

En una lectura más sensible de la fisiología, se comparó el genoma expresión estable del gen estado de los cultivos que crecen bajo limitación sulfato en las ministats y en el fermentador industrial. La expresión génica en las ministats mostraron un alto grado de similitud a través de tres réplicas biológicas (Figura 2B). Hemos observado anteriormente que para el ARN derivado de dos quimiostatos Sixfors repetidos y de co-hibridizada a un microarray, la expresión de genes de 99% cayó dentro de un rango de 1,5-veces, lo que permite el uso de 1,5 X como un corte de significación empírica. 21 la expresión génica desde ministats tres replicados, por parejas, en comparación mostró 99% de los genes cayó dentro de un rango de 1.5-1.7 veces, comparable a los resultados de los fermentadores industriales. Las tres muestras se hibridó con los conjuntos individuales y las relaciones de pares calculados después, por lo que estos VAlues incluyen inter-array ruido además de ruido biológico, potencialmente sobreestimar la variación entre las réplicas en comparación con los publicados, co-hibridados resultados. 138 genes fueron expresados ​​diferencialmente> 1,5-veces en todos los Ministat tres repeticiones en comparación con una muestra obtenida de un cultivo crecido emparejado en el fermentador industrial. Genes disminución en la expresión en las ministats se enriquecieron en gran medida por el metabolismo del hierro. Esta firma puede reflejar la composición del metal diferente de cada configuración de dispositivos: el aparato Sixfors incluye un impulsor de metal y ensamble aireación inmerso en la cultura, los medios de comunicación y la garrafones utilizado anteriormente también se requiere hardware metal. El Ministat utiliza agujas de acero inoxidable, pero ningún componente metálico. Los genes con una mayor expresión se asocia en gran medida con las membranas celulares, aunque la importancia biológica de esta asociación no está claro.

Por último, hemos probado unde evolución experimentalr estas condiciones. Después de 250 generaciones de sulfato limitado crecimiento, 4/4 clones ensayados de 4 poblaciones independientes evolución mostraron amplificación de SUL1 como se detecta por hibridación genómica comparada (CGH, Figura 2C). Este resultado es consistente con los hallazgos en quimiostatos de mayor volumen en intervalos de tiempo similares. 10

Figura 1
1. A. Diseño y disposición de la matriz Ministat. Figura B. Diseño de la cámara de cultivo.

Figura 2
Figura 2. A. ExperimeNTAL datos que muestran que los cultivos alcancen el equilibrio dentro de diez generaciones de crecimiento (n = 16). B. Datos de expresión para tres repeticiones biológica S1-3 muestreadas durante el estado estacionario bajo limitación de sulfato en comparación con una referencia común crecido en un conjunto combinado de sulfato limitado chemostat Sixfors C. amplificaciones. SUL1 recuperado en ministats después de 250 generaciones de crecimiento en un entorno de sulfato limitado. El ADN genómico de cada clon evolucionado se comparó con el ADN ancestral por CGH como se describe. 21 La media de número de copia se calculó para cada región amplificada y se muestra junto a cada uno de amplificación. Todos los datos de microarrays se depositan en la base de datos GEO bajo adhesión GSE36691. Haga clic aquí para ampliar la figura.

Discussion

Cultivo en chemostat los ministats, como con cualquier chemostat, requiere atención al detalle y la resolución de problemas. Dado que la contaminación es de gran preocupación en experimentos con cultivos continuos, se suelen mirar a través de microscopio en busca de contaminación bacteriana y fúngica tras la inoculación y cada 50 generaciones durante experimentos de evolución a largo plazo. Hasta la fecha no hemos observado contaminación a través de 96 experimentos de evolución de más de 300 generaciones (datos no mostrados). Para la prueba de contaminación cruzada entre ministats y el potencial de microbios para colonizar la cámara de cultivo por medio de la línea de efluente que corrió 16 ministats tales que cada Ministat otro se inoculó con la levadura como anteriormente y el resto no se inocularon con cualquier cultura. Los cultivos se recogen en un contenedor de residuos comunales, que se vació cada dos días. Así, si fuera posible que los contaminantes para entrar a través de la línea de efluente que probablemente han observado que en este experiment. Durante tres semanas y más de 100 generaciones de crecimiento en este patrón de tablero de ajedrez de los cultivos inoculados y no inoculadas No se observó crecimiento en no inoculadas tubos de cultivo MINISTAT, lo que sugiere que la contaminación de la levadura u otros microbios exterior es poco probable que ocurra en los experimentos de marcos de tiempo similares.

Aunque los ministats fueron diseñadas para operar en un modo análogo a quimiostatos comerciales, la naturaleza modular de esta disposición permite la optimización para adaptarse a las necesidades del usuario y el presupuesto. La bomba peristáltica utilizada en este protocolo pueden lograr tasas de flujo entre 0,0186 vol / hora a 3,6 vol / h (datos no mostrados). Mayor control de las tasas de dilución se podría lograr con modelos de bombas alternativos. Tenga en cuenta que la operación a tasas de dilución inferiores pueden requerir la sustitución de una aguja de calibre más alto para lograr la misma frecuencia de entrega de las gotitas. Tamaño de la población es un factor importante para el diseño adecuado de los experimentos de evolución.La tasa de dilución estándar y la concentración de nutriente utilizado aquí proporciona un tamaño de población relativamente grande (~ 10 9 células) del mismo orden de magnitud que los estudios publicados evolución. 11 poblaciones más grandes o más pequeñas podría ser mantenida por cambiar el volumen de trabajo o limitar la concentración de nutrientes. Aumento en el suministro mutación también podría obtenerse trabajando con cepas con elevadas tasas de mutación.

Los ministats también podría ser mejorado en nuestro diseño actual. Por ejemplo, la condensación puede acumularse en las paredes del tubo de cultivo y se puede reducir considerablemente mediante el uso de un baño de agua profunda, incubadora, o sala a temperatura constante. Aunque aglutinación y crecimiento de la pared en sulfato de cultivos limitados parece ser relativamente poco frecuente, apareciendo en experimentos de evolución 5/48 por 300 generaciones (datos no mostrados), una variedad de tensioactivos están disponibles que pueden ayudar a disminuir o retrasar este rasgo. En el caso de que interfiere con la formación de grumos cultivo adecuadola mezcla y agitación, aumento se puede lograr mediante la reducción de la cantidad de formas se divide cada bomba de aire, o mediante la adición de un aparato de agitación. Sondas adicionales para la concentración de gas disuelto, pH, u otros parámetros también pueden ser incluidos, como en algunos otros diseños. 17

A pesar de las modificaciones posibles, utilizando los ministats como se describe en este protocolo, se observó parámetros experimentales altamente consistentes y reproducibles resultados al comparar nuestro dispositivo con los datos reportados por quimiostatos de mayor volumen comercial. Esto incluyó la reproducibilidad de la fisiología celular como se ve a través de alcanzar el estado estacionario de equilibrio dentro de 10-15 generaciones (Figura 2A) y la obtención de densidades similares de cultivo en el equilibrio. Patrones de expresión génica fueron consistentes entre los tres repeticiones biológica en ministats y entre ministats y comerciales de gran volumen plataformas (Figura 2B), con la excepción de los genes del metabolismo de hierro. Estos expresión diferencias son causados ​​probablemente por los cambios en el contenido de metal de los dos dispositivos o mejoras en la calidad de los ingredientes de los medios. Nuestros datos sugieren que ministats será útil para experimentos de fisiología o competición donde se requiere un ambiente consistente.

Para probar si el diseño Ministat es suficiente para aplicaciones evolución experimental que se desarrollaron culturas con limitación sulfato para 250 generaciones y CGH utilizado para caracterizar la amplificación del locus SUL1 -. Un sello de evolución a largo plazo en estas condiciones en quimiostatos mayor volumen 10 Observamos amplificación de SUL1 en clones de 4/4 experimentos de evolución independientes en sulfato limitados medios de comunicación (Figura 2C). Tomados en su conjunto estos datos sugieren que ministats son una plataforma robusta que puede ser útil para una variedad de aplicaciones chemostat tradicionales. A pesar de que ha demostrado su uso en el cultivo de levadura en ciernes, los ministats deberíatambién ser compatible con otros organismos y diseños similares, de hecho, han sido utilizados para el cultivo de bacterias y otras especies de levadura. 16,17,25 Además, el volumen menor cultura y la necesidad de una correlación disminuyó para los medios de comunicación pueden hacer ministats una alternativa atractiva para experimentos que requieren costosos o exóticos reactivos como puede ser el caso en química o cribados genéticos.

Disclosures

Los autores declaran que no tienen conflictos de interés.

Acknowledgements

Creación del video fue apoyado por becas del Centro Nacional para Recursos de Investigación (5P41RR011823-17) y el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (8 GM103533 P41-17) de los Institutos Nacionales de Salud. Este trabajo también fue apoyado por NSF subvención 1120425. MJD es una Fundación Rita Allen Scholar. AWM es apoyado en parte por el NIH T32 HG00035. Damos las gracias a Anna Sunshine para obtener ayuda con la mejora de los protocolos. Además, reconocemos Sara DiRienzi, Payen Celia, y Sirr Amy como los primeros usuarios de los ministats.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3/32" x 7/32" silicone tubing VWR 63009-260 Tubing: Order: (50' coil pack)
1/2" x 5/8" silicone tubing (extra large) VWR 63009-299 Tubing: Order: (50' coil pack)
1/4" x 3/8" silicone tubing (medium) VWR 63009-279 Tubing: Order: (50' coil pack)
Orange green marprene pump tubing Watson-Marlow 978.0038.00+ Tubing: Order: 6x(pack of 6)
Female luer, 1/8" barb Cole Parmer HV-45500-04 Connectors: Order: 4x(pack of 25)
Male luer lock, 1/8" barb Cole Parmer HV-45503-04 Connectors: Order: 1x (pack of 25)
Reducing connector, PVDF, 1/4" to 1/8" Cole Parmer EW-30703-50 Connectors: Order: 1x (pack of 10)
Barbed Y connector, 1/8" ID Cole Parmer HV-30703-92 Connectors: Order: 3x(pack of 10)
Medium tubing clamps VWR 63022-405 Clamps: Order: 1x(pack of 12)
Day Pinchcock (metal clamp for tubing) VWR 21730-001 Clamps: Order: 1x(pack of 10)
Male inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. Fisher 05-112-39 Connectors: Order: 1x(pack of 25)
Female inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. I.D.,Polypropylene Fisher 05-112-37 Connectors: Order: 1x(pack of 5)
Silent Air Pumps Aquarium Guys.com 212422 Air Supply: Order: 4 pumps
PTFE filters, 0.45 μm, for air filtration Cole Parmer HV-02915-22 Air Supply: Order: 1x(box of 100)
1L Flask with sidearm Fisher 10-181F Air Supply: Order: 2x(Pack of 6)
#8 silicone stopper, 3/8 in hole, for sidearm flasks Fisher K953715-0801 Air Supply: Order: 8 stoppers
4-Port manifold Cole Parmer EW-06464-85 Air Supply: Order: 8 manifolds
55 ml Screw cap culture tubes Corning Life Sciences 9825-25 Culture Chamber: Order: 2x(pack of 48)
Regular hypodermic white hub needle, 16G, 5 in. length for effluent line Fisher 14-817-105 Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100)
Spinal tap needle VWR BD40836 Culture Chamber: Order: 4x(pack of 10)
Regular hypodermic pink needle Fisher 14-817-104 Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100)
Foam Silicone stopper size "2", pink Cole Parmer EW-06298-06 Culture Chamber: Order: 2x(pack of 20)
8-Well tube Rack VWR 82024-452 Culture Chamber: Order: 4 racks
10L Reservoir bottle with bottom hose outlet: vacuum safe VWR 89001-530 Media: Order: 2 or more
Yellow foam silicone stopper, non-standard size 12 Cole Parmer EW-06298-22 Media: Order: 2 or more
Carboy Venting Filter Fisher SLFG 050 10 Media: Order: 1x(pack of 10)
Electrical tape, green Amazon.com 10851-BA-10 Media: Order 1 roll.
Bottle top filter, 1L, .2 μm, 45 mm VWR 29442-978 Media: Order: (1 case of 12)
5000 ml Reservoir bottle with bottom outlet: vacuum safe VWR 89003-384 Media: (Optional)
Blue Foam Silicone stopper, nonstandardsize 10 1/2 Cole Parmer EW-06298-18 Media: (Optional)
205S/CA16, 16 Cartridge pump Watson-Marlow 020.3716.00A Media Pump: Order: 1
16-channel 205CA Extension pump head Watson-Marlow 023.1401.000 Media Pump: Order: 2 extension pump heads
Silicone aquarium sealer Fisher S18180B Media Pump: Order: 1
6-block dry bath VWR 12621-120 Heatblock: Order: 2 for 32 ministats or 1 for 16.
Block for drybath, 6 x 25 mm test tube per block VWR 12621-120 Heatblock: Order: 12 for 32 ministats or 6 for 16.
Nylon Membrane Filters, 0.45 μm Pore Size; Dia.: 25 mm Fisher R04SP02500 Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional)
Nylon Membrane Filters,0.45 μm Pore Size; 45 mm Fisher R04SP04700 Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional)
47 mm, large filter apparatus Fisher XX10 047 30 Harvesting: Order: 1 (optional)
Glass filter holder, 25 mm, small filter apparatus VWR 26316-692 Harvesting: Order: 1 (optional)
Dewar flask, 1L for Liquid Nitrogen VWR 63380-052 Harvesting: Order: 1 (optional)

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References

  1. Monod, J. Récherches sur la Croissance des Cultures Bacteriennes. Ann. I. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
  2. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science. 15, 715-716 (1950).
  3. Daran-Lapujade, P., Daran, J. -M., van Maris, A. J. A., de Winde, J. H., Pronk, J. T. Chemostat-based micro-array analysis in baker's yeast. Adv. Microb. Physiol. 54, 257-311 (2009).
  4. ter Linde, J. J. M., Pronk, J. T., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181, 7409-7413 (1999).
  5. Boer, V., de Winde, J., Pronk, J., Piper, M. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).
  6. Wu, J., Zhang, N., Hayes, A., Panoutsopoulou, K., Oliver, S. Global analysis of nutrient control of gene expression in Saccharomyces cerevisiae during growth and starvation. 101, 3148-3153 (2004).
  7. Diderich, J. A., Kruckeberg, A. L., et al. Glucose Uptake Kinetics and Transcription of HXT Genes in Chemostat Cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 274, 15350-15359 (1999).
  8. Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
  9. Kubitschek, H. E., Bendigkeit, H. E. Mutation in continuous cultures. I. Dependence of mutational response upon growth-limiting factors. Mutation Res. 1, 113-120 (1964).
  10. Gresham, D., Dunham, M. J., et al. The Repertoire and Dynamics of Evolutionary Adaptations to Controlled Nutrient-Limited Environments in Yeast. PLoS Genet. 4, e1000303 (2008).
  11. Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).
  12. Kvitek, D. J., Sherlock, G. Reciprocal Sign Epistasis between Frequently Experimentally Evolved Adaptive Mutations Causes a Rugged Fitness Landscape. PLoS Genet. 7, e1002056 (2011).
  13. Helling, R. B., Adams, J. Evolution of Escherichia coli during Growth in a Constant Environment. Genetics. 116, 349-358 (1987).
  14. Dunham, M. J. Experimental Evolution in Yeast: A Practical Guide. Methods Enzymol. 470, (2010).
  15. Hoskisson, P. A., Hobbs, G. Continuous culture - making a comeback. Microbiology. 151, 3153-3159 (2005).
  16. Nanchen, A., Schicker, A., Sauer, U. Nonlinear dependency of intracellular fluxes on growth rate in miniaturized continuous cultures of Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 72, 1164-1172 (2006).
  17. Klein, T., Schneider, K., Heinzle, E. A system of miniaturized stirred bioreactors for parallel continuous cultivation of yeast with online measurement of dissolved oxygen and off-gas. Biotechnol. and bioeng. (2012).
  18. Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
  19. Groisman, A., Lobo, C., Cho, H., Campbell, J. K., Dufour, Y. S., Stevens, A. M., Levchenko, A. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
  20. Brauer, M. J., Botstein, D., et al. Homeostatic Adjustment and Metabolic Remodeling in Glucose-limited Yeast Cultures. Mol. Biol. Cell. 16, 2503-2517 (2005).
  21. Torres, E. M., Amon, A., et al. Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast. Science. 317, 916-924 (2007).
  22. Regenberg, B., Nielsen, J., et al. Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biology. 7, R107 (2006).
  23. Castrillo, J. I., Oliver, S. G., et al. Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast. Journal of Biology. 6, 4 (2007).
  24. Brauer, M. J., Botstein, D., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).
  25. Ferenci, T. Bacterial physiology, regulation and mutational adaptation in a chemostat environment. Adv. Microb. Physiol. 53, 169-229 (2008).

Comments

3 Comments

  1. Our more detailed lab manual for building and running the ministats is also posted on my lab website:
    http://dunham.gs.washington.edu/protocols.shtml
    We'd love to hear from anyone who builds a set, especially if you improve on our design!

    Reply
    Posted by: Maitreya D.
    March 1, 2013 - 4:28 PM
  2. This is great! I was about to email you and ask about small chemostats (I used to run chemostat experiments for F Rosenzweig, so I know about those custom-blown glass babies!). I'll be building a set of these ministats to use in experiments with Chlamydomonas reinhardtii. Have you had any problems with the effluent needle clogging, or with back growth up the needle? Since the vessel is under slight positive pressure, I guess that I could clean the exterior of the needle every so often with EtOH -- this is going to be a very long long experiment!

    Heidi Kuehne, U Edinburgh

    Reply
    Posted by: Heidi K.
    August 26, 2013 - 9:43 AM
  3. Hi Heidi. I'm excited you're building a setup for Chlamydomonas! We have not had backflow problems, as long as the pump head is fastened down. You do need to clamp the media lines if you are loosening the pump heads. However, we have had growth in the needle on occasion (never on the exterior of the needle). One nice thing is that the setup is modular, so if it happens, you can just swab the cork with ethanol and swap in another piece of sterile tubing with a new needle. However, for yeast, line growth is highly correlated with the evolution of clumping/wall growth, so we do get recolonization at some frequency. We have not gotten effluent needle clogging, even with cultures that evolve large clumps, and we have never seen back-contamination via the effluent lines. The air flow seems to be sufficient to empty the line efficiently and keep it cleared. Let me know if you have any other questions, and I'd love to hear how it turns out. Good luck!

    Reply
    Posted by: Maitreya D.
    August 26, 2013 - 4:31 PM

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