Purificación y microRNA perfiles de exosomas derivados de la sangre y Cultura Medios

Biology

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Summary

La presencia de microRNAs estables (miRNAs) en exosomas ha generado gran interés como un nuevo modo de comunicación intercelular, por su utilidad potencial como marcadores biológicos y como una ruta para la intervención terapéutica. Aquí se demuestra la purificación de exosomas sanguíneos y medios de cultivo seguido de PCR cuantitativa para identificar miRNAs que se transportan.

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McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294, doi:10.3791/50294 (2013).

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Abstract

MiRNAs estables están presentes en todos los fluidos corporales y algunos miRNAs circulantes están protegidos de la degradación por secuestro en pequeñas vesículas llamadas exosomas. Los exosomas pueden fusionarse con la membrana plasmática que resulta en la transferencia de ARN y proteínas a la célula diana. Sus funciones biológicas incluyen la respuesta inmune, la presentación de antígenos, y la comunicación intracelular. Entrega de miRNAs que pueden regular la expresión génica en las células receptoras a través de la sangre ha abierto nuevas vías para la intervención de destino. Además de ofrecer una estrategia para la administración de fármacos o agentes terapéuticos de ARN, contenido exosomal pueden servir como biomarcadores que pueden ayudar en el diagnóstico, la determinación de las opciones de tratamiento y el pronóstico.

Aquí vamos a describir el procedimiento para el análisis cuantitativo de miRNAs y ARN mensajeros (ARNm) a partir de exosomas secretados en la sangre y de los medios de cultivo de células. Exosomas purificados se caracterizaron mediante análisis de Western blot para exosmarcadores Omal y PCR para ARNm de interés. Microscopía electrónica de transmisión (TEM) y inmunomarcaje se utilizan para validar la morfología y la integridad exosomal. Total de ARN se purificaron a partir de estos exosomas para asegurar que se puede estudiar tanto mRNA y miRNA de la misma muestra. Después de validar la integridad del ARN por Bioanalyzer, vamos a realizar una producción de PCR cuantitativa en tiempo real medio (qPCR) para identificar los genes miARN exosomal utilizando Taqman matriz de baja densidad (TLDA) cartas y estudios de expresión génica de las transcripciones de interés.

Estos protocolos pueden utilizarse para cuantificar los cambios en los miRNAs exosomal en pacientes, modelos de roedores y medios de cultivo de células antes y después de la intervención farmacológica. Contenido exosomal varían debido a la fuente de origen y las condiciones fisiológicas de las células que secretan exosomas. Estas variaciones pueden dar una idea de cómo las células y los sistemas de lidiar con el estrés o perturbaciones fisiológicas. Nuestros datos representativos muestran variations en miRNAs presentes en los exosomas purificados a partir de sangre de ratón, sangre humana y los medios de cultivo de células humanas.

Aquí vamos a describir el procedimiento para el análisis cuantitativo de miRNAs y ARN mensajeros (ARNm) a partir de exosomas secretados en la sangre y de los medios de cultivo de células. Exosomas purificados se caracterizaron mediante análisis de Western blot para detectar marcadores exosomal y PCR para ARNm de interés. Microscopía electrónica de transmisión (TEM) y inmunomarcaje se utilizan para validar la morfología y la integridad exosomal. Total de ARN se purificaron a partir de estos exosomas para asegurar que se puede estudiar tanto mRNA y miRNA de la misma muestra. Después de validar la integridad del ARN por Bioanalyzer, vamos a realizar una producción de PCR cuantitativa en tiempo real medio (qPCR) para identificar los genes miARN exosomal utilizando Taqman matriz de baja densidad (TLDA) cartas y estudios de expresión génica de las transcripciones de interés.

Estos protocolos pueden utilizarse para cuantificar los cambios en los miRNAs exosomal in los pacientes, los modelos de roedores y medios de cultivo de células antes y después de la intervención farmacológica. Contenido exosomal varían debido a la fuente de origen y las condiciones fisiológicas de las células que secretan exosomas. Estas variaciones pueden dar una idea de cómo las células y los sistemas de lidiar con el estrés o perturbaciones fisiológicas. Nuestros datos representativos muestran variaciones en miRNAs presentes en exosomas purificados a partir de sangre de ratón, sangre humana y de los medios de cultivo de células humanas

Introduction

MiRNAs no codificantes cortos modulan la expresión de genes mediante la unión al ARNm diana. Semilla complementariedad de secuencia de ~ 7 pares de bases permite a los genes miARN para unirse al ARNm diana que resulta en la inhibición de la traducción o en la reducción en la estabilidad del ARNm, ambos de los cuales pueden resultar en una disminución de expresión de la proteína diana 1. Las investigaciones realizadas durante la última década se ha demostrado de manera inequívoca un papel fundamental para los miRNAs en la mediación de las funciones celulares. También ha habido un considerable esfuerzo dirigido hacia la disección de los genes miARN cambios moleculares que subyacen a diversas enfermedades mediadas por 2,3. Por otra parte, la reciente identificación de miRNAs estables en los fluidos corporales 4-6 allanó el camino para su uso como nuevos biomarcadores susceptibles de diagnóstico clínico.

Un medio de transporte miRNA en los líquidos corporales es a través de los exosomas, pequeñas vesículas que transportan los ARNm, proteínas, mediadores lipídicos, y miRNAs a las células receptoras a través de la sangre circulante sistémica7-14 de iones. Esto resulta en la modulación de la expresión génica en las células receptoras y representa un nuevo mecanismo de comunicación celular. Por ejemplo, las células pueden modular procesos de inmuno-reguladoras mediante la secreción y / o absorbentes de exosomas que contienen biomoléculas implicadas en la inflamación tales como la interleuquina-1β (IL1), factor de necrosis tumoral-α (TNF), factor de crecimiento transformante-β5 (TGFβ5), y los miRNAs que regulan estos genes 13. Como los genes miARN expresión aberrante es una característica común en una variedad de enfermedades humanas, estas moléculas ofrecen nuevas oportunidades para el descubrimiento y validación de nuevas dianas terapéuticas 2.

MiRNAs circulantes están presentes en todos los fluidos corporales y se sabe que la composición de los exosomas es diferente en función de las celdas de origen de donde fueron liberados. Por lo tanto ofrecen una vía para estudiar el estado fisiológico de las células y cómo las células alteran la señalización inclusots en respuesta al estrés incluyendo enfermedades. El estudio de las alteraciones en la composición exosome puede dar una idea de la transducción de señales e investigar su posible utilidad como biomarcadores o vías de intervención terapéutica.

Aquí vamos a demostrar la purificación de los exosomas de múltiples fuentes basadas en protocolos publicados. Estos exosomas serán utilizados para el aislamiento de ARN seguido por qPCR para identificar y medir los niveles de miRNAs presentes en los exosomas.

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Protocol

Todos los experimentos con muestras de sangre de humanos y roedores fueron ejecutados en cumplimiento de todas las normas, reglamentos y las agencias reguladoras. Los sujetos humanos se inscribieron después de dar su consentimiento informado aprobado por la Drexel University College de la Junta de Revisión Institucional de la medicina y los procedimientos de los estudios realizados con animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional de Drexel y el empleo Comisión.

1. La purificación Exosome de sangre (~ 5,5 h)

CONSEJOS

  • Nos Resuspender exosomas de un tubo de sangre (~ 10 ml de sangre humana y ~ 2 ml de sangre del ratón) en 300 l de ARN tampón de lisis del kit de aislamiento de los genes miARN mirVana.
  • Para purificar exosomas de medios de cultivo celular, el medio se centrifugó a 500 xg durante 10 min para eliminar las células y también se filtra a través de un filtro de 0,22 micras después de la centrifugación a 12.000 x g. La purificación de exosomas de medios de cultivo celularno requiere una dilución en PBS, el lavado con PBS o el segundo paso ultracentrifugación.
  • Si se utilizan los exosomas purificados para los estudios de proteómica, la adición de una etapa de centrifugación en gradiente de sacarosa tras la etapa de ultracentrifugación se reducirá la cantidad de agregados de proteínas y contaminantes 15.
  • La morfología observada de exosomas puede diferir dependiendo de la fuente y los pasos de procesamiento para TEM. No se observó la morfología en forma de copa de exosomas que se ha atribuido previamente a las diferencias en el procesamiento de muestras 9,15. Nuestras imágenes de TEM, incluyendo la caracterización inmuno son similares a los anteriores informes de diferentes fuentes, incluyendo sangre, biliar y la cultura cortical exosomas derivados 9,16,17.
  1. Invierta el tubo recubierto EDTA que contiene el 5x y lugar de sangre en posición vertical a temperatura ambiente durante 10 a 60 min.
  2. Centrifugar a 2000 xg durante 15 min a 4 ° C. Recoger la capa superior, el plasma, en tubos de 15 ml y mantener en hielo.
  3. Diluir fluido con un volumen igual de PBS. Centrifugar 30 minutos a 2000 xg a 4 ° C.
  4. Transferir a tubos de centrífuga, añadir 1X PBS para un volumen total de 24 ml, y se centrifuga 45 min a 12.000 xg a 4 ° C.
  5. Traslado al ultracentrifugar tubos y centrifugar 2 horas a 110.000 xg a 4 ° C.
  6. Resuspender el pellet en PBS y centrifugar 1 hora a 100.000 xg a 4 ° C.
  7. Resuspender el sedimento en tampón apropiado (tampón de lisis de ARN).
  8. Volver a suspender en tampón PBS o RIPA para microscopía electrónica y análisis de transferencia Western, respectivamente.

2. Purificación de ARN utilizando un kit de aislamiento de los genes miARN mirVana Modificado (~ 1 hora)

CONSEJOS

  • Prepare el área para aislar ARN mediante el uso de equipo de protección personal (PPE), limpiar las superficies y pipetas con RNasa Zap, y el uso de puntas con filtro estériles y tubos.
  • Adición de una etapa de tratamiento con DNasa en columna elimina los rastros de ADN que pueden estar presentes. Dependiendo de la fuente de exosomas, el ADN ha sido informado de que se ausente en exosomas purificados a partir de algunas fuentes, incluyendo ratón y líneas de células cebadas humanas 8, pero las secuencias de ADN cromosómicas han sido detectados en exosomas purificados a partir de cultivos de cardiomiocitos de los medios de comunicación 18.
  • Hemos reducido el volumen de solución de lavado 1 a 350 l (Paso 2.4 a continuación) debido a que el proveedor proporciona sólo lo suficiente Solución de lavado 1 para uno 700 l adición. Si no se reduce el volumen no es suficiente solución de la izquierda para el uso de todo el contenido del kit. Pasos restantes se realizaron de acuerdo a las recomendaciones del fabricante.
  1. Añadir 1/10 voLume de los genes miARN Aditivo homogeneizado (30 l) y se incuba en hielo durante 10 min.
  2. Se extrae con un volumen de ácido-fenol: cloroformo igual al volumen inicial de lisado. Centrifugar y recuperar la fase superior en un tubo nuevo.
  3. Añadir 1,25 volúmenes de 100% de etanol (375 l). Vortex. Aplicar filtro de cartucho y centrifugar 15 segundos a 10.000 x g.
  4. Añadir la mitad de la recomendada volumen miRNA Wash Solution 1 (350 l) y centrifugar 15 segundos a 10.000 x g.
  5. Añadir 10 l de DNasa 1 a 70 l de tampón RDD (Qiagen) para cada muestra. Añadir 80 l a la columna y se incuba 15 minutos a temperatura ambiente.
  6. Añadir la solución de lavado 1 (350 l) y centrifugar 15 segundos a 10.000 x g.
  7. Añadir la solución de lavado 2/3 (500 l) y centrifugar 15 seg a 10.000 x g. REPETIR.
  8. Eluir con 40 l 95 ° C libre de nucleasa H 2 O.
  9. Determinar la concentración de ARN y diluir los ARN a 100 ng / l.

3. miARN perfiles de exosomas de Blood Utilizando Taqman matriz de baja densidad (TLDA) Tarjetas (~ 6,5 h)

CONSEJOS

  • Prepare el área para aislar ARN mediante el uso de PPE, limpiar las superficies y pipetas con RNasa Zap, y el uso de puntas con filtro estériles y tubos.
  • Se recomienda el paso de pre-amplificación (pre-amp) de 1-350 ng RNA (350-1,000 ng muestras no requieren etapa de pre-amplificador después de la síntesis de ADNc). Es importante determinar si el pre-amplificador es necesario para la muestra, ya que debe tratar a todas las muestras en condiciones de igualdad. Etapa Pre-amp añade costos y los valores de Ct tener una de corte aceptable más bajo (32 en lugar de 40).
  • Es útil para preparar la reacción de ADNc en tiras de tubos en lugar de una placa en función del número de tarjetas que se pueden ejecutar en un solo día. Esto minimizará la congelación y descongelación de las muestras de cDNA que no se pueden procesar en el mismo día.
  • Los exosomas recogidos de diferentes fuentes tienen difealquilar cantidades de ARN. Este protocolo permite que un máximo de 3 l molde de ARN para la reacción de síntesis de ADNc. Dependiendo de la fuente, la cantidad de ARN exosomal que se puede aislar tal vez limitado. Mientras que un tejido típico daría suficiente RNA cDNA que se harían a partir de 100 ng de ARN en 3 l de volumen, exosomas de la sangre humana o de los medios de cultivo de células humanas a menudo contienen menos de RNA y cDNA se debe hacer a partir de material de partida menos. Exosomas sangre de ratón contienen niveles más altos de ARN y al menos 100 ng en 3 l se pueden obtener.
  1. Para preparar ADNc a partir de ARN utilizando Pools Megaplex purificada transcriptasa inversa primers (Grupo A y Grupo B contienen cebadores para los miRNAs en las tarjetas de microfluidos Array A y B), descongelar los componentes de la reacción en hielo.
  2. Label dos tubos ml RNasa libre de 1,5 para la reacción RT con Piscina A primers o cebadores Grupo B y agregar componentes a fin gráfico. Añadir al menos un volumen extra de componentes para 2 o más reacciones o hacer una mezcla maestra según lo recomendado por tque vendedor.
Componente reacción de RT Componente Concentración Volumen de muestra 1 (total de V / muestra = 4,5 l)
Agua libre de nucleasa 0,20 l
RT buffer Megaplex (10 veces) 1X 0,80 l
dNTPs (100 mM) 4,4 mM 0,20 l
MgCl2 (25 mM) 5 mM 0,90 l
RNasa Inhibidor (20U/μl) 2 U 0,10 l
Megaplex RT cebadores A o B (10X) 1X 0,80 l
MultiScribe de transcriptasa inverso 75 U 1,50 l
  1. Invertir tubos de 6 veces y cientorifuge brevemente. Entonces, una pipeta 4,5 l mezcla de reacción de RT en MicroAmp Tiras de 8 tubos o un plato de reacción óptica de 96 pocillos MicroAmp.
  2. Añadir 100 ng de RNA y ajustar el volumen de 3 l de agua tratada con DEPC o añadir 3 l de ARN total, revuelva con la punta de la pipeta, y sellar los tubos o placas. Girar brevemente e incubar en hielo durante 5 min.
  3. Cargue la reacción en la máquina PCR y ejecutarla en las condiciones siguientes (según lo recomendado por el protocolo Biosystems Pools Megaplex Aplicada):
Etapa Temperatura Tiempo
Ciclo (40x) 16 ° C 2 min
42 ° C 1 min
50 ° C 1 seg
Sostener 85 ° C 5 min
Sostener 4 ° C
  1. Guarde cDNA a -20 ° C (bueno por lo menos una semana) o seguir paso pre-Amp que se puede almacenar durante una semana.
  2. Descongele primers preamplificador para el Grupo A y el Grupo B en el hielo e invierta para mezclar. Remolino Taqman Pre-Amp Master Mix y mantener en hielo también.
  3. Siga la tabla añadiendo al menos un volumen extra de componentes para 2 o más reacciones o hacer una mezcla maestra según lo recomendado por el proveedor.
Componente Reacción Pre-Amp Volumen de muestra 1
Agua libre de nucleasa 7,5 l
TaqMan PreAmp Master Mix (2X) 12,5 l
Primers preamplificador Megaplex A o B (10 veces) 2,5 l
  1. Pipetear 2,5 l RT product en MicroAmp tiras 8-tubo o una placa de reacción óptica de 96 pocillos MicroAmp y dispensar 22,5 l de la mezcla de reacción PreAmp en cada pocillo.
  2. Tapar la placa e incubar en hielo 5 min y luego cargar la muestra en la máquina de PCR. Ejecutar en las siguientes condiciones.
Etapa Temperatura Tiempo
Sostener 95 ° C 10 min
Sostener 55 ° C 2 min
Sostener 72 ° C 2 min
Ciclo (12x) 95 ° C 15 seg
60 ° C 4 min
Sostener 99,9 ° C 10 min
Sostener 4 ° C
  1. Después de que se terminó la reacción preamplificador, centrifugar brevemente los tubos o la placa y a continuación, añadir 75 l 0,1 X TE pH 8,0 a cada pocillo o tubo.
  2. Selle y mezclar y centrifugar brevemente. Almacenar el producto diluido durante una semana a -20 ° C o continuar para cargar el plato.
  3. Combina lo siguiente en un tubo de 1,5 ml RNasa libre de hielo.
Componente Volumen 1 de la tarjeta
TaqMan PCR Universal Master Mix, No AmpErase UNG (2X) 450 l
Producto diluido preamplificador 9 l
Agua libre de nucleasa 441 l
  1. Invierta el tubo para mezclar y centrifugar brevemente. Dispensar 100 l de la mezcla de reacción de PCR en cada puerto de la tarjeta de matriz de microARN Taqman.
  2. Se centrifuga la tarjeta de 2 x 1000 g durante 1 min. Sellar la tarjeta y ejecutarlo usando la plantilla proporcionada con los iniciadores del manual de Applied Biosystems y así bajo la configuración de matrices de densidad 384 Taqman. Utilizamos Applied Biosystems 7900HT Fast System PCR en tiempo real.

4. Análisis de ARNm por Taqman (~ 1,5 h)

  1. Para preparar reacción qPCR, mezclar los componentes de la reacción en el orden en el gráfico. Todas las muestras se analizaron con sondas de cebadores para el gen de interés, así como ARNr 18S como el gen normalizador.
Taqman componente de reacción Volumen de muestra 1
Agua libre de nucleasa 7 l (ajuste sobre la base de la muestra individual)
Taqman rápida Master Mix (2X) 10 l
Primer sondas Taqman (20x) 1 l
ADNc a partir de 100 ng de ARN 2 y mu; L (ajustar sobre la base de la muestra individual)
  1. Ejecutar la placa de 96 pocillos usando el rápido bloque de 96 pocillos como se recomienda por el fabricante (Biosystems 7900HT Fast sistema de PCR en tiempo real Aplicada).

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Representative Results

Después de aislamiento de exosomas de la sangre o los medios de cultivo de células, la pureza de los exosomas puede ser probado por microscopía electrónica (EM) y western blot (Figuras 1A y 1B). Se confirmó nuestras preparaciones de exosoma de diversas fuentes con EM y Western blot utilizando anticuerpos múltiples. Figura 1A muestra EM imágenes que confirma que los exosomas son intacta, con un diámetro de ~ 30 -100 nm y contienen CD81 por medio del etiquetado inmunomarcaje. Marcadores exosomal comúnmente utilizados son Hsp70 y tetraspannin glicoproteínas de la familia CD63, CD81 y CD9 14. Después de confirmar la integridad de los exosomas purificados, se realizó un Western blot para la Hsp70 en la Figura 1B y puso de manifiesto que los exosomas contienen Hsp70 mientras medio solo (control negativo) no lo hace. El Bioanalyzer traza muestra que exosomas aisladas a partir de medios de cultivo de células RAW contienen una variedad de ARN, pero no contienen grandes cantidades de ARN ribosomal que son típicos en el ARN a partir de todacélulas (Figura 1C). Figura 1D muestra el análisis de qPCR de ARNm a partir de sangre total y de los exosomas derivados de la sangre. Somos capaces de aislar a 500 ng de RNA exosomal de ~ 10 ml de sangre humana utilizando kit de aislamiento de los genes miARN mirVana. Los resultados qPCR indican la presencia de ARNm que codifican el factor de crecimiento endotelial vascular A y TNFa (VEGFA) en exosomas purificados, así como en la sangre entera.

Además de qPCR para los estudios de expresión génica, el total de ARN también se utilizó para el perfil de miARN. El miRNA TLDA tarjeta de la versión 3.0 contiene sondas de imprimación para ~ 758 miRNAs como el endógeno de control de ARN U6. Con la adición de la etapa de pre-amplificación, el proveedor recomienda 30 ng de ARN para ejecutar una tarjeta de TLDA. Esto es útil para el análisis de ARN a partir de exosomas purificados a partir de suero o sangre humana, que normalmente tienen rendimientos más bajos que los purificada a partir de sangre de ratón. El análisis de los genes miARN se muestra en la Figura 2 se realizó con 250 ng de ARN a partir de sangre de ratónexosomas y 15-30 ng de ARN exosomal de la sangre humana o de células endoteliales aórticas humanas (HAOEC). Nuestros resultados indican la presencia de 89 miRNAs en exosomas recogidos de sangre de ratón, 209 miRNAs en exosomas sanguíneos humanos, y 199 miRNAs en exosomas de medios de cultivo de células humanas. Los datos representativos de seis miRNAs se muestra como valor delta Ct normalizado a lo endógeno U6 ARN de la sangre de roedores (Figura 2), la sangre humana (Figura 2B) y HAOEC medios de cultivo de células (Figura 2C). Mientras que miR-126 y miR-200c estaban ausentes en exosomas de la sangre de roedores o los medios de comunicación HAOEC respectivamente, los cuatro miRNAs restantes están presentes en todas las tres muestras en cantidades variables. En relación con exosomas purificados a partir de medios de cultivo celular, miR-223 se expresa en niveles más altos en exosomas de muestras de sangre humana y de roedores.

Figura 1
Figura 1. Trmicroscopía electrónica de ansmission (TEM), análisis de transferencia de Western y QRT-PCR para ARNm utilizando exosomas purificados a partir de diversas fuentes. Una imagen) TEM de sangre de ratón exosomas resuspendió en 1% de glutaraldehído (a la izquierda) o exosomas derivados de células RAW se resuspendieron en 4% de paraformaldehído, marcado con oro de 10 nm y de conejo anti CD81 (derecha) y manchado en rejillas revestidas de carbono formvar para EM . análisis (barra de escala = 100 nm) B) Análisis Western de HSP70 en exosomas purificados a partir de sangre de ratón o de los medios de comunicación exosome libres + / -. 24 h de incubación con células de ratón RAW 264.7 y resuspendido en buffer RIPA C) Análisis Bioanalyzer de ARN total purificados a partir de exosomas derivados de RAW 264,7 células cultura mediática D) Total de ARN purificado de sangre entera y exosomas obtenida de un control humano representativo se utilizó para comparar los niveles de expresión de TNF-alfa y VEGFA. Click aquípara ver más grande la figura.

La figura 2
Figura 2. Expresión relativa de la fracción de los genes miARN encontrado en exosomas. Ciclo umbral (valor CT) es una medida relativa de la concentración de un miARN individual en la reacción de PCR y el valor más bajo indica una mayor expresión de CT. valores de qPCR para seis miRNAs exosomal detectables se normalizaron a U6 ARN y los valores delta Ct se graficaron para exosomas procedentes de tres fuentes. Un valor negativo indica una mayor expresión en esta figura. Los exosomas de la sangre de roedores (A) y de la sangre humana (B) expresaron hsa-miR-223 en niveles superiores de control, mientras que los exosomas de HAOEC medios de cultivo celular (C) expresaron hsa-miR-223 en niveles inferiores a control. HSA-mir-226 estuvo ausente de exosomas sanguíneos roedores y hsa-miR-200c estaba ausente de exosomas HAOEC.

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Discussion

En este protocolo, se muestra la cuantificación de miRNAs y mRNAs de exosomas purificados por centrifugación diferencial a partir de la sangre y los medios de cultivo. Los exosomas tienen diversos componentes que dependen de su origen y están implicados en un número de funciones biológicas, incluyendo la respuesta inmune, la presentación de antígenos, la comunicación intracelular, y la transferencia de ARN y proteínas 9,11,12,19,20. Aunque el tamaño y la forma es un factor determinante de la pureza exosome, una serie de documentos que muestran datos de EM de exosomas indican que estas vesículas pueden variar en tamaño y morfología sobre la base de la fuente de la que se secretan, así como el método utilizado para la fijación y formación de imágenes 9 , 15. El tamaño aceptado para exosomas de 30-100 nm es un rango promedio que incluye una pequeña población de exosomas con un diámetro mayor dependiendo de la fuente de 21,22, una de las razones que múltiples métodos se utilizan para validar la pureza exosomal. MiRNAs secretadas tienen muchos Featur requisitoes de 23 buenos biomarcadores además de ser posibles dianas terapéuticas para diversas enfermedades 2,3,24. Este método de purificación proporciona un método no invasivo para caracterizar los cambios biológicos temporales en exosomal contenido de una variedad de fluidos corporales, mientras que los genes miARN perfiles de qPCR ofrece una visión global de los contenidos miRNA 2. Más de 4500 proteínas, 1639 mRNAs, 764 y 194 miRNAs lípidos son conocidos por asociarse con exosomas 25 ( www.exocarta.org ) y, en algunos casos, los cambios en los niveles de estas biomoléculas ya se ha relacionado con estados de enfermedad. En nuestros estudios, los exosomas purificados a partir de sangre humana tenían muchos miRNAs en común con exosomas purificados a partir de los medios de comunicación a partir de líneas celulares humanas cultivadas, pero las diferencias significativas de miRNAs exosomal encuentran en la sangre del ratón. Si bien hay ejemplos de miRNAs que se dirigen a un solo mRNA, muchos miRNAs funcionan para reducir en parte los niveles de multíparale apunta a que conduce a una fuerte respuesta fisiológica. La caracterización de ambos ARNm y los genes miARN que residen en exosomas ofrece una visión única exosome mediada por la transferencia de información y el papel de miRNAs circulantes en la mediación de los cambios en la expresión génica. Purificación y caracterización de exosomas de una variedad de fuentes serán beneficiosos en la identificación de firmas moleculares asociados con estas vesículas secretoras.

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Disclosures

Los autores tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por fondos de subvención de la Fundación Rita Allen a Seena Ajit. Los autores desean agradecer a Erika Balogh y el Dr. Soumitra Ghoshroy de la Universidad de Carolina del Sur Centro de Microscopía Electrónica para el uso de instrumentos, la asistencia científica y técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) BD Diagnostics 366643 For exosome purification from human blood
EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) BD Diagnostics 367841 For exosome purification from mouse blood
PAXgene Blood RNA Tube BD Diagnostics 762165 For miRNA isolation from total blood
miRVana microRNA isolation kit Ambion AM1561
Acid-Phenol: CHCl3 Ambion 9721G
DNase 1 Qiagen 79254
TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG Applied Biosystems 4326614 For TLDA cards
Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 Applied Biosystems 4444746
Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 Applied Biosystems 4444747
Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 Applied Biosystems 4444909
Megaplex RT Human Pool set V3.0 Applied Biosystems 4444745
Megaplex Preamp human pool set v3.0 Applied Biosystems 4444748
Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 Applied Biosystems 4444913
Taqman MicroRNA RT kit Applied Biosystems 4366596
Taqman fast universal PCR master mix Applied Biosystems 4366072 For mRNA qRT-PCR
Tumor necrosis factor (primer probe) Applied Biosystems Hs01113624_g1
Vascular endothelial growth factor A (primer probe) Applied Biosystems Hs00900055_m1
Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR Thermo Scientific K1642 For mRNA
HSP70 antibody Abcam ab94368 For western blot
Anti-rabbit IgG-Gold Sigma G7402 For electron microscopy
Rabbit-anti CD81 Sigma SAB3500454
Nickel 300 mesh carbon formvar grids Electron Microscopy Sciences FCF300-Ni
Copper 300 mesh carbon formvar grids Electron Microscopy Sciences FCF300-Cu
Table 1. Table of specific reagents.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Comments

1 Comment

  1. You suggest that Pre-amplification (pre-amp) step is recommended for samples with 1-350 ng RNA, but what is the minimum amount of miRNA needed not to use pre-amp? (miRNA can be specifically isolated and quantified using small RNA chip from AGILENT).

    Reply
    Posted by: Tannia G.
    September 10, 2013 - 7:15 AM

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