Specifikationen av Telencephalic glutamaterg nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Detta förfarande ger telencephalic nervceller genom att gå igenom checkpoints som liknar de som observerats under människans utveckling. Cellerna får spontant differentiera, utsätts för faktorer som driver dem mot det neurala härstamning, isoleras och stryks ut på täckglas för att möjliggöra terminal differentiering och mognad.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (74), e50321, doi:10.3791/50321 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Här har en stegvis procedur för att effektivt generera telencephalic glutamaterga nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller (PSC) har beskrivits. Differentieringen initieras genom att bryta de mänskliga PSC till klumpar som avrunda att bilda aggregat när cellerna placeras i en suspensionskultur. Aggregaten odlas sedan i hESC medium från dag 1-4 för att medge spontan differentiering. Under denna tid, cellerna har förmåga att bli någon av de tre groddblad. Från dag 5-8, är cellerna placerade i en neural induktion medium för knuffa dem i neurala linjen. Omkring dag 8, cellerna fick fästa på 6 brunnars plattor och differentiera under vilken tid neuroepitelceller formuläret. Dessa neuroepitelceller kan isoleras på dag 17. Cellerna kan därefter hållas så neurosfärer tills de är redo att plattades på täckglas. Med hjälp av ett basiskt medium utan caudalizing faktorer neuroepitelceller är specified till telencephalic prekursorer, som sedan kan ytterligare differentieras i rygg telencephalic föregångare och glutamaterga neuroner effektivt. Sammantaget ger vårt system ett verktyg för att generera humana glutamaterga nervceller för forskare att studera utvecklingen av dessa neuroner och de sjukdomar som påverkar dem.

Introduction

Mänskliga pluripotenta stamceller (PSC), både mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs), har kapacitet att generera alla celltyp i kroppen, inklusive nervceller 1-3. Riktad differentiering av olika neuronala subtyper från mänskliga PSC är nyckeln för tillämpningen av dessa celler i regenerativ medicin. Den generation av funktionella neuronala subtyper under utveckling är en komplex process som involverar induktion av neurala härstamning, specifikation av regionala stamfäder längs Rostro-caudal axeln och differentieringen av post-mitotiska neuron typer från de regionala stamceller 4,5. Från och med 2001 har flera system etablerats för att generera neurala härkomst från hESCs som har gett en plattform för nästa generation av neuronala subtyper 6,7. Baserat på utvecklingsmässiga principer, flera neuron typer såsom spinal motoriska neuroner 8-12, mitthjärnan DOPaminergic neuroner 13-15 och neurala näthinnans celler 16,17 har effektivt anges från humana PSC. Detta gjordes genom att kritiska morfogener som är viktiga för att specificera dessa neuron typer under in vivo-utvecklingen. Andra protokoll har också utvecklats för att främja differentiering av hESCs till nervceller med hjälp av antingen ytterligare faktorer 18-20 såsom små molekyler eller genom samodling med andra celltyper för att främja differentiering 21.

Den mänskliga neocortex är högt utvecklad och innehåller många celltyper, inklusive glutamaterga nervceller som spelar en viktig roll i inlärning, minne och kognitiv funktion 22,23. Det första steget vid generering av glutamaterga neuroner i odling är att ange telencephalic progenitorceller. Yoshiki Sasai grupp rapporterade först riktade differentiering av telencephalic prekursorer från mus ekonomiska och sociala råd (mESCs) med en serumfritt suspensioN-kulturen i närvaro av DKK1 (som inhiberar Wnt signalering) liksom LeftyA (som inhiberar nodal signalering) 24. Därefter har flera grupper inklusive vår rapporterade också specifikationen av telencephalic prekursorer från mänskliga PSC i serumfritt medium 25-27. Den generation telencephalic prekursorer från mänskliga PSC kräver inte användning av exogena morfogener och effektivitet i att generera dessa prekursorer är mycket högre än den från mESCs 26,27. Här har ett kemiskt definierat system för neural induktion som väl grundades av Zhang grupp 7 har beskrivits. Utan tillsats av exogena caudalizing faktorer genererar detta protokoll effektivt telencephalic prekursorer från mänskliga PSC 27. Dessa stamfäder kan sedan delas in i dorsala eller ventrala föregångare genom att reglera signalering av Wnt-och Sonic hedgehog (SHH). Den dorsala stamfäder vidare kan differentiera till glutamaterga neuron efficiently 27. Dessutom fungerar detta protokoll också väl för generering av glutamaterga neuroner från humant iPSCs 28, som möjliggör generering av patientspecifika neuroner som kan utnyttjas för att undersöka verkningsmekanismen samt potentiella terapier för en stor mängd sjukdomar . Dessutom ger vårt system också en plattform för att undersöka möjligheten att utarbeta och specifikation av olika neuronala typer i telencephalon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generering av Human Cell pluripotenta stamceller aggregat (D1-D4)

  1. Humana pluripotenta stamceller odlas på mus embryonala fibroblast (MEF) matare i närvaro av hESC medium kompletterat med basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF, 4 ng / ml). Efter 5-7 dagar i odling, när kolonierna är stora men fortfarande differentierade, är de redo för nästa steg.
  2. Enzymlösningen bör först beredas. I en 50 ml rör, upplösa dispas (eller kollagenas) vid en 1 mg / ml koncentration i DMEM/F12-medium. Eftersom dessa lösningar blandas bäst när värms, placera röret med mediet och enzymet i en 37 ° C vattenbad under 10-15 minuter och sedan sterilisera den med en Steriflip filter.
  3. Sug bort mediet från cellerna, skölj dem med DMEM/F12 och aspirera detta bort också. Tillsätt 1 ml dispas till varje brunn och plats i inkubatorn under 3-5 min för hESCs (upp till 10 minuter för iPSCs). Titta på cellerna under mikroskop, närkanterna krypa upp något / titta lite mörkare, cellerna är redo för nästa steg. Det är bäst att kontrollera cellerna efter 3 min och lägg tillbaka dem i om det behövs. Vid användning av detta protokoll för första gången, är det bäst att starta med endast en platta av celler vid en tidpunkt då det är viktigt att avlägsna cellerna från dispas så snabbt som möjligt.
  4. Aspirera bort dispas från cellerna. Försiktigt (cellerna är mycket sårbara i detta skede och kommer bort från plattan relativt lätt) lägga 1,5 ml DMEM/F12-medium till varje brunn för att skölja bort dispas. Aspirera av DMEM/F12 och tillsätt 1,5 ml av hESC medium till varje brunn.
  5. Att lösgöra och bryta upp cellerna, placera spetsen på en 10 ml glaspipett mot det nedre högra hörnet av en brunn (vidrör cellerna) och flytta pipetten upp och ner (vertikalt) - den uppåtgående stoke bör vara i närheten till förfarandet nedåtgående slag. När den andra sidan av brunnen nås, upprepa i det horisontella ödesdigraInsatser.
  6. När alla cellerna är i suspension, placera dem i 15 ml rör och centrifugera dem vid 200 xg under 2 minuter. Det bör finnas en pellet av celler på botten av röret. Sug bort mediet från ovan pelleten.
  7. Storleken av cellkulturen kolven som bör utnyttjas för att hålla aggregaten i beror på den ursprungliga kvantiteten av celler. För 6 brunnar (1 platta) av hESCs behandlade en icke-vävnadskultur T75 kolv med 50 ml hESC medium bör användas. Överför cellerna från steg 1,6 till kolven och inkubera vid 37 ° C.
  8. För att bli av med celldebris, bör cellmediet och kolven bytas ungefär 12 timmar senare. För att göra detta, placera alla medel / cellerna i ett 50 ml rör, snurra celler nedåt (200 xg under 2 minuter) och aspirera bort den gamla mediet. Nästa, tillsätt 50 ml av färskt hESC medium till cellerna, och lägg till en ny T75 kolv. Cellerna kan sedan matas dagligen efter samma procedur (fram till dag 5).

  1. Överför celler / medium till ett 50 ml rör och centrifugera cellerna under 2 minuter vid 200 x g.. Därefter aspirera bort supernatanten och överför cellerna till en ny (icke-vävnad som behandlas kultur) T75 kolv med 50 ml neural induktion medium (NIM).
  2. När cellerna är i NIM, bör hälften av mediet ut varannan dag. Aggregaten bör vara tillräckligt stor för att där de kommer att sjunka till botten av en 50 ml koniskt rör på egen hand efter några minuter (ingen centrifugering krävs). Efter 2-3 dagar i NIM (D7-D8 totalt), bör cellerna vara redo att plattan. Laminin eller fetalt bovint serum (FBS) kan användas för att hjälpa cellerna fäster till plattorna.
  3. Antalet vävnadskultur behandlade plattor med 6 brunnar som behövs beror på densiteten av cellerna som varje aggregat skall kunna växa på plattan under flera dagar utan att röra någon av de andra. I genomsnitt, cellerna från enT75 kolv kommer att ge ca 04-06 Juni brunnar värde av celler.
    1. Om använder laminin, späda den i NIM till 10-20 pg / ml för att belägga 6-brunnars platta (~ 0,5 ml / brunn). Efter beläggning för 2-3 tim, aggregat platta celler på 6-brunnars plattor (~ 20-30 aggregat per brunn). Efter aggregaten har fäst, tillsätt 1,5 ml NIM.
    2. Om du använder FBS, förbereda en blandning av 90% NIM och 10% FBS (1,5 ml / brunn). Lägg 1,5 ml medium med de celler till varje brunn, försiktigt skaka plattan och tillbaka för att sprida ut aggregaten, och tillåta cellerna att fästa O / N i en inkubator. Var noga med att byta mediet (2 ml / brunn av NIM) följande morgon för att ta bort FBS.
  4. Efter en dag eller två för att vara pläterade, kommer varje aggregat spridas ut för att bilda ett monoskikt. Inom ett par dagar kommer centra för de flesta av dessa celler verkar morfologiskt liknar kolonnformade celler (avlånga). Under denna period byter NIM varannan dag. Vissa PSC linjer (specielltly IPSC), kan bilda pelarformiga celler mindre effektivt. Om detta händer, kan tillägg av BMP och TGF-hämmare (Dorsomorphin 29, SB431542 19 vid 2 M) under etapp 2 vara till hjälp.
  5. Runt dagar 14-17, kommer de kolumnära celler, tycks mer kompakt. Ibland dessa celler bildar åsar eller ringar med synliga lumen inuti. Förutom kolumner morfologi, celler i detta skede inte uttala neuroepiteliala markörer, såsom PAX6 och SOX1 12,26.
  6. Innan isoleringen kan börja, måste man först undersöka de celler för att bestämma om det finns några icke-neuroepitelceller närvarande. En objektiv markör kan användas för att ange de icke-neuroepiteliala kolonier. Dessa kan sedan elimineras genom skrapning dem med en pipettspets.

3. Generering av Telencephalic föregångare (D17-D24)

  1. Mittpunkter kolonierna innehåller neuroepitelceller, och bör isoleras från resten av kolonin. Detta kan göras genom att användaen mikropipett och en steril 1 ml filtrerad pipettspets. När en liten mängd tryck anbringas på den centrala delen av kolonin, lyfter det i allmänhet bort ganska lätt. Var försiktig att inte låta den yttre delen av kolonin loss också. Om centrumen är envis och kommer inte att komma iväg på egen hand, kan de tas bort genom att skära dem med en nål i mikroskop i en steril huva. Överför de centrala delarna av kolonierna till en 15 ml rör och snurra vid 200 xg under 2 minuter.
  2. Mediet bör sugas bort av cellerna. Två plattor värde av cellerna kan sedan överföras till en icke-vävnadskultur behandlad T25 kolv innehållande 10 ml NIM med tillsats av B27 (utan A-vitamin, 1:50). Användning 5-10 ml medium per en platta av celler.
  3. När cellerna ses följande dag, bör de ha en sfär utseende. Det är nödvändigt att överföra dessa celler till en ny kolv (i närvaro av NIM och B27, 1:50) eftersom det ofta är de perifera cellernasom smyga in och fäst till botten av kolven.
  4. Neurosfärerna bör därefter odlas i suspension i en vecka med NIM kompletterat med B27 (1:50). För att främja cell-uthållighet och spridning, cyklisk AMP (cAMP, 1 | iM) samt insulin tillväxtfaktor (IGF1, 10 ng / ml) kan sättas till mediet under suspensionsodling. Vid denna punkt, neurosfärer innehåller telencephalic föregångare (FOXG1 +) och är redo att beläggas på täckglas för terminal differentiering.

4. Ytterligare differentiering till de Telencephalic neuroner (D25 +)

    1. Förbered poly-ornithine/laminin belagda täckglas (i 24-brunnars plattor) för plätering av cellerna. Täckglas först rengörs, och beläggs sedan med knep-ornitin (vid 0,1 mg / ml, 37 ° C, O / N och lagras i frysen).
      Poly-ornitin beläggning:
      1. Sterilisera täckglasen: Placera täckglasen i enbägare innehållande salpetersyra och försiktigt skaka i dragskåpet under en timme. Häll ut salpetersyra, skölj flera gånger med avjoniserat vatten, och lämna täckglasen under rinnande DI-vatten i minst 15 minuter. Placera täckglasen i 95% etanol och antingen skaka i 30 minuter (om du använder direkt) eller förvara i etanol vid rumstemperatur.
      2. I en steril huva, häll ut innehållet i 50 ml rör innehållande steriliserade täckglas i locket på en 6-brunnars platta. Använda steriliserade pincett, plocka upp en täckglas vid en tidpunkt och upprätt i en enda brunn i en 24-brunnsplatta. Upprepa så att varje brunn har ett täckglas.
      3. Efter de torka helt trycker plattorna tills täckglasen har sjunkit lägenhet i varje brunn. Tillsätt därefter 100 pl poly-ornitin (0,1 mg / ml i sterilt dH 2 O) till varje täckglas och inkubera plattorna O / N vid 37 ° C.
      4. Nästa dag, ta bort plattorna från inkubatorn och låt dem svalna till RT. Aspirera poly-ornitin off av varje täckglas (från kanten av tHan täckglas) att se till att inte röra eller repa täckglasen i processen. Låt täckglasen torka i cirka 30 minuter innan du tvättar.
      5. Tillsätt 1 ml sterilt dH 2 O till varje brunn, låt sitta i 10 minuter, och aspirera bort vattnet från varje brunn. Upprepa detta tvättsteg två gånger. Efter plattorna torka helt, (tjänstledig täcker upp i huven) placera locken på, täck med aluminiumfolie och förvara vid -20 ° C.
      1. Att belägga täckglasen med laminin, tillsätt 50 pl av en blandning av neural differentiering medium och laminin (slutlig koncentration av 20 pg / ml) till varje poly-omitin behandlad täckglaset var noga med att endast ha vätskan röra täckglaset själv (och inte spilla avstängd). Inkubera dem vid 37 ° C under 1-2 timmar innan förbereda cellerna för fastsättning.
  1. Samla och centrifugera neurosfärerna vid 200 xg under 2 min i en 15 ml tub. Sug bort supematanten.
  2. <li>
    1. Skölj cellerna med DMEM-F12 och centrifugera cellerna igen. Om neurosfärer är alltför stora för att fästa ordentligt, kan de vara dissocierades med Accutase i detta steg.
    2. Vid användning Accutase: Efter tvättning av cellerna med DMEM-F12, neurosfärerna dissocieras till små kluster genom tillsats Accutase (~ 2 ml) och inkubera cellerna vid 37 ° C under 3 minuter. Därefter lägger samma mängd av trypsininhibitor (~ 2 ml) och centrifugera cellerna vid 200 x g under 3 minuter. Cellerna skall sedan åter-suspenderas i NDM och bröts med användning av en P200 pipett. De små kluster kan sedan pläteras på förbelagda täckglas.
  3. Aspirera bort majoriteten av mediet och placera celler på en 6 cm Petriskål i några droppar av mediet så att välja dem blir lättare. Lägg ca 4-5 neurosfärer till varje förbelagda täckglas. Det finns inget behov att suga bort laminin först.
  4. Låt neurosfärerna fästa för minst 2-4 timmar. När de har enttached väl bör mer medel (0,5 ml / täckglas) läggas till. Det bör bestå av neurala differentiering medium kompletterat med B27 (1:50), cAMP (1 pM), och faktorer neurotrofiska (BDNF, GDNF och IGF, allt vid 10 ng / ml). Vid denna punkt halv av mediet kan ändras varannan dag och dessa celler kan upprätthållas under flera månader.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Här, till ett protokoll differentiera mänskliga PSC till telencephalic glutamaterga nervceller genom flera viktiga steg: bildandet av PSC aggregat har induktion av neuroepitelceller, generering av telencephalic föregångare, och terminal differentiering av dessa stamfäder till telencephalic neuroner (figur 1) beskrivits. Detta system är robust och effektiv vid generering av telencephalic progenitorer och glutamaterga neuroner. Som ett exempel (figur 2), utan tillsats av caudalizing faktorer var hESCs differentieras in den neurala linjen 27. Vid 24 dagar efter differentiering var majoriteten av neurala prekursorer positivt för FOXG1 (en transkriptionsfaktor som uttrycks av telencefalon) men negativa för HOXB4 (en markör för bakhjäman och spinal celler sladd) antyder de telencephalic stamfäder framgångsrikt genererades (fig 2D). Dessa telencephalic stamfäder p ossess en dorsal fenotyp, såsom indikeras av uttrycket av Pax6 (en markör uttryckt av dorsala progenitorer) (figur 2E), men inte NKX2.1 (en markör för ventrala progenitorceller) (Figur 2F). Efter ytterligare differentiering, dessa telencephalic rygg föregångare differentieras till glutamaterga neuroner, som var positivt för glutamaterg markören TBR1 (cirka 80%) 27. Nervceller som färgades positivt för TBR1 var också positivt för neuronala markörer βIII-tubulin (Figur 2G) eller mikrotubuli-associerat protein 2 (MAP2, figur 2H). Dessa celler uttryckte också vesikulär glutamat transportör 1 (vGLUT1), en markör för mogna glutamaterga neuroner, vilket tyder på effektiv generering av telencephalic glutamaterga neuroner i kultur (figur 2I).

highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50321/50321fig1.jpg "/>
Figur 1. En schematisk tidsplan för neuronal differentiering processen.

Figur 2
Figur 2. Bilder belyser celler under flera kritiska stadier under neuronal differentiering. (A) Mänskliga ekonomiska och sociala råd odlades under 4 dagar. Fas bilder som visar bildningen av aggregat ESK (B) och neuroepitelceller (C). Vid 24 dagar efter differentiering från hESCs, var majoriteten av NE celler FOXG1 + men HOXB4 - (D). De telencephalic progenitorer (FOXG1 +) var PAX6 + (E) men NKX2.1 - (F) efter 1 månad av differentiering. Efter två ytterligareveckor (6 veckor totalt) för att differentiera cellerna på täckglasen, färgades de flesta av dem positivt för glutamaterg markören TBR1 (G, H) liksom de neuronala markörer βIII-tubulin (G) och MAP2 (H). Efter åtta veckors differentiering var cellerna positiva för den mogna glutamaterg markören, vGLUT1 (I). Skala staplar: 100 ^ m (A), 50 ^ m (BI). (DI har anpassats från vår tidigare publikation 27 med tillstånd).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det finns flera viktiga steg under den neurala differentiering processen. Det är viktigt att säkerställa att de humana PSC är pluripotenta eftersom annars cellerna kan redan vara förspänd mot att bli en icke-neuronal härstamning. Detta kan bekräftas genom färgning av humana PSC med antikroppar mot pluripotensbestämmande markörer såsom Oct4, Sox2, nanog, och Tra-1-60 1-3. Om de mänskliga PSC inte fäster mycket väl efter passage dem, kan ROCK-hämmare (Y27632) läggas att hjälpa till. För dem som har problem med att hålla sina pluripotenta, vissa potentiella problem är kvaliteten / densitet MEF celler, liksom mycket KOSR används som det kan finnas variationer från parti till parti. Även MEF matarceller har använts för att hålla PSC i ovanstående protokoll, fungerar denna metod även för PSC som odlas med matare-fria system.

När cellerna bryts upp för att bilda aggregat PSC, är det viktigt att limdet deras dispas exponering bara några minuter (kanterna kommer att runda upp). Den tid som det tar innan kanterna av iPSCs (upp till 10 minuter) är vanligen längre än den hos rådens (3-5 minuter). Det är optimalt att tillsätta dispas till endast en platta av humana PSC vid en tidpunkt för att säkerställa att cellerna inte är i enzymet för länge som detta kan skada eller till och med döda cellerna. Efter det att cellerna är i PSC sammanlagda skede är det viktigt att hålla cellerna vid en låg densitet. Densiteten är också ganska viktigt när PSC aggregaten är pläterade. Dessa celler kommer att expandera på plattan under de närmaste dagarna och försiktighetsåtgärder bör vidtas för att säkerställa att de inte kommer att beröra när de växer sig större. Under fastsättningen steget (2,2), är det nödvändigt att säkerställa att cellerna inte har en långvarig exponering för FBS eftersom detta skulle kunna påverka genuttryck. Innan isolering av neuroepitelceller, är det också viktigt att skrapa bort de icke-neuronala kluster för att ge en mer renpopulation av celler. Om man ville att karakterisera huruvida deras celler går in i neuronala linjen kan olika faktorer ses som Pax6 eller Sox1. Pax6 tänds runt dag 10 under neural differentiering och Sox1 tänds med 2 veckor efter differentiering 12,26,30.

Detta protokoll är i framkant av neurala differentiering eftersom det rekapitulerar många steg som sker under utvecklingen av det mänskliga nervsystemet. Utan användning av caudalizing faktorer (retinoinsyra, basiskt FGF), neuroepitelceller differentierar effektivt i telencephalic stamceller, vilka sammanfaller med neuroectoderm celler först skaffa en rostral fenotyp under in vivo utveckling 31. Dessa telencephalic progenitorceller har en dorsal fenotyp på grund av endogen Wnt signalering som dorsalizes cellerna 27. Detta system genererar rygg stamfäder som sedan kan ytterligare differentieras till glutamaterga cells.. Medan denna celltyp är mycket viktig, är det ingalunda den enda celltypen att detta system är i stånd att bilda. Exempelvis har tillsatsen av SHH visats ventralize cellerna, tillåter dem att differentiera till celler GABAergiska 27,32. Det var även visat att dessa hESC härledda GABAergic nervceller kan transplanteras in i möss och att de kan rätta till rörelseaktivitet fel på grund av hjärnskador 32. Eftersom det protokoll som visas i den här artikeln går igenom de stegvisa checkpoints, erbjuder ett verktyg för att producera ett brett utbud av celler i det mänskliga nervsystemet som endast begränsas av vår förståelse av utveckling och vår fantasi.

Förmågan att bilda humana neuroner från PSC öppnar ett stort antal dörrar från både en grundläggande vetenskap samt ett kliniskt perspektiv. Postmortem vävnadskällor är begränsade och kvaliteten kan variera, medan humant PSC differentiering tillåter forskare att ge enobegränsat och jämn tillförsel av celler att arbeta med. Med tillkomsten av inducerad pluripotenta stamceller (IPSC) teknik 1,3,33,34, är det nu möjligt att få hESC-liknande celler från patienten fibroblaster inklusive dem med olika sjukdomar 35-38. Som framgår av vår grupp 28 liksom många andra, har den framgångsrika generationen av nervceller från IPSC varit och kommer att fortsätta att vara ett unikt och användbart verktyg för dem som länge sökt efter mänskliga modeller för sjukdomar och utveckling. Dessutom, har flera grupper visat att PSC-härledda neuroner kan modellera vissa aspekter av sjukdomsprocessen 36,37,39-42 och sålunda kan användas för att screena terapeutiska föreningar 43. Detta är särskilt uppmuntrande, eftersom utan en bra modell för att testa läkemedelskandidater för det centrala nervsystemet med, endast cirka 8% av dem har visat sig vara kliniskt effektiv 44. Kan dock denna metod och andra som det hjälpa att dramatiskt förbättra thär nummer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgements

Författarna vill tacka Dr Y. Sasai för generöst ge FOXG1 antikroppen. Detta arbete stöddes av Connecticut Stem Grants Cell Research (08-SCB-UCHC- 022 och 11-SCB24) och spastisk paraplegi Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) Gibco 11330-032
Knockout Serum Replacer Gibco 10828-028
L-glutamine (200 mM) Gibco 25030
Non Essential Amino Acids Gibco 1140-050
2-Mercapt–thanol (14.3 M) Sigma M-7522
Neurobasal medium Gibco 21103-049
N2 Gibco 17502-048
B27 Gibco 12587-010
Heparin Sigma H3149
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine) Sigma 116K5103
Laminin (human) Sigma L-6274
Laminin (mouse) Invitrogen 23017-015
FBS Gemini 100-106
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A-7906
Dispase Gibco 17105-041
Collagenase Invitrogen 17104-019
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
ROCK Inhibitor Stemgent 04-0012
SB431542 Stemgent 04-0010
Dorsomorphin Stemgent 04-0024
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) Invitrogen 13256-029
Trypsin inhibitor Gibco 17075
0.1% gelatin Millipore ES-006-B
Foxg1 antibody Dr. Y. Sasai
Hoxb4 antibody (1:50) Developmental Studies Hybridoma Bank I12
Pax6 antibody (1:5000) Developmental Studies Hybridoma Bank PAX6
Nkx2.1 antibody (1:200) Chemicon MAB5460
Tbr1 antibody (1:2000) Chemicon AB9616
vGLUT1 antibody (1:100) Synaptic Systems 135302
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) PrepoTech Inc. 450-02
Glial derived neurotrophic factor (GDNF) PrepoTech Inc. 450-10
Insulin growth factor 1 (IGF1) PrepoTech Inc. 100-11
Cyclic AMP (cAMP) Sigma D-0260
Sonic hedgehog (SHH) R&D 1845-SH
50 ml tubes Becton Dickinson (BD) 352098
15 ml tubes BD 352097
6 well plates BD 353046
24 well plates BD 353047
T25 flasks (untreated) BD 353009
T75 flasks (untreated) BD 353133
Coverslips Chemiglass Life Sciences 1760-012
6 cm Petri dishes BD 353004
9'' glass pipetes Fisher 13-678-20D
Steriflip filters (0.22 μM) Millipore SCGP00525
Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM) Millipore SCGPU10RE
Phase contrast microscope (Observer A1) Zeiss R2625
Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150) Thermo Electron Corporation
Biosafety hood (Sterilgard III Advance) The Baker Company
Centrifuge (5702 R) Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., Tanabe, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  3. Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  4. Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes. Nat. Rev. Genet. 1, 20-29 (1038).
  5. Wilson, S. I., Edlund, T. Neural induction: toward a unifying mechanism. Nat. Neurosci. 4, 1161-1168 (2001).
  6. Reubinoff, B. E., Itsykson, P., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
  7. Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).
  8. Hu, B. Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).
  9. Singh Roy, N., Nakano, T., et al. Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells. Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).
  10. Lee, H., Shamy, G. A., et al. Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons. Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).
  11. Boulting, G. L., Kiskinis, E., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29, 279-286 (2011).
  12. Li, X. J., Du, Z. W., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
  13. Perrier, A. L., Tabar, V., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).
  14. Roy, N. S., Cleren, C., et al. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat Med. 12, 1259-1268 (2006).
  15. Yan, Y., Yang, D., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
  16. Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16698-16703 (2009).
  17. Osakada, F., Ikeda, H., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
  18. Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., et al. Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells. Exp. Neurol. 172, 383-397 (2001).
  19. Chambers, S. M., Fasano, C. A., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  20. Chambers, S. M., Qi, Y., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nat. Biotechnol. 30, 715-720 (2012).
  21. Kawasaki, H., Mizuseki, K., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
  22. Rubenstein, J. L., Beachy, P. A. Patterning of the embryonic forebrain. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 18-26 (1998).
  23. Hevner, R. F., Hodge, R. D., Daza, R. A., Englund, C. Transcription factors in glutamatergic neurogenesis: conserved programs in neocortex, cerebellum, and adult hippocampus. Neurosci. Res. 55, 223-233 (2006).
  24. Watanabe, K., Kamiya, D., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  25. Watanabe, K., Ueno, M., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  26. Pankratz, M. T., Li, X. J., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  27. Li, X. J., Zhang, X., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136, 4055-4063 (2009).
  28. Zeng, H., Guo, M., et al. Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 5, e11853 (2010).
  29. Kim, D. S., Lee, J. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev. 6, 270-281 (2010).
  30. Zhang, X., Huang, C. T., et al. Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant. Cell Stem Cell. 7, 90-100 (2010).
  31. Stern, C. D. Initial patterning of the central nervous system: how many organizers. Nat. Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).
  32. Ma, L., Hu, B., et al. Human embryonic stem cell-derived GABA neurons correct locomotion deficits in quinolinic acid-lesioned mice. Cell Stem Cell. 10, 455-464 (2012).
  33. Li, W., Wei, W., et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).
  34. Lowry, W. E., Richter, L., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
  35. Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321, 1218-1221 (2008).
  36. Ebert, A. D., Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  37. Lee, G., Papapetrou, E. P., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
  38. Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
  39. Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17668-17673 (2010).
  40. Kiskinis, E., Eggan, K. Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells. J. Clin. Invest. 120, 51-59 (2010).
  41. Koch, P., Tamboli, I. Y., et al. Presenilin-1 L166P mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation. Am. J. Pathol. 180, 2404-2416 (2012).
  42. Walsh, R. M., Hochedlinger, K. Modeling Rett syndrome with stem cells. Cell. 143, 499-500 (2010).
  43. Egawa, N., Kitaoka, S., et al. Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
  44. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates. Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-716 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics