Иммуногистохимического анализа в нервной системе крыс центральной и периферической ткани лимфатического узла Разделы

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Adzemovic, M. Z., Zeitelhofer, M., Leisser, M., Köck, U., Kury, A., Olsson, T. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. J. Vis. Exp. (117), e50425, doi:10.3791/50425 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Иммуногистохимия (IHC) обеспечивает высокую точность, надежную и привлекательную визуализацию белка. Правильное исполнение и интерпретация ВВК на основе многоцветного мечения является сложной задачей, особенно когда используется для оценки взаимосвязи между целевых белков в ткани с высоким содержанием жира, например, центральной нервной системы (ЦНС).

Наш протокол представляет собой уточнение стандартной методики иммунноокрашивания особенно скорректированной для выявления структурных и растворимых белков у крыс ЦНС и периферических лимфатических узлов (LN), пострадавших от нейровоспаления. Тем не менее, с или без дополнительных модификаций, наш протокол, вероятно, может быть использован для обнаружения других связанных с ними белковых мишеней, даже в других органах и видов, чем здесь представлены.

Introduction

Несмотря на использование передовых с высокой пропускной способностью анализа, выполненного на methylome, транскриптома или даже протеома уровне, иммунное остается золотым стандартом для обнаружения белка непосредственно в образце ткани, культуры клеток или клеток мазка. Раскрывая картину локализации / распределения, иммуногистохимии (IHC) может оценить относительные соотношения и топографические взаимосвязи белков-мишеней, и даже указывают на их биологическую активность. Поэтому IHC широко используется для клинических и исследовательских целях, например, для диагностики, оценки лечения, изучение механизмов развития заболеваний, функциональных и фенотипических изменений в моделях на животных и т.д.

По существу , содержащий гистологии, патологии, биохимии и иммунологии, IHC значительно продвинулась с 1941 года, когда флуоресцентно меченые антитела были использованы впервые для определения пневмококковых антигенов в инфицированной ткани 1. Visualization клеточных продуктов и компонентов по IHC основан на связывании антител (абс) до их специфического антигена (Ag). Помимо использования флуорофора помечены антитела, иммунные реакции также могут быть визуализированы с помощью ферментов , как пероксидаза 2,3 или щелочной фосфатазы 4. Кроме того, коллоидного золота меченные антитела 5 используются для выявления специфических взаимодействия антиген-антител при помощи световой и электронной микроскопии, в то время как радиоактивные метки визуализировали с помощью авторадиографии.

Иммунореакция Ag-Ab могут быть обнаружены с помощью прямых и косвенных методов. Прямой метод, по существу , быстрее и проще, так как он использует непосредственно помечены первичной Abs 6. Тем не менее, из-за значительной потери чувствительности, косвенные методы являются предпочтительными для прямых. Двухшаговые косвенные процедуры обнаружения требуют немеченого первичного Abs, как и первый, и меченого вторичного Abs , направленные против первичного Abs, в качестве второго слоя 7.Усиление сигнала может быть достигнуто путем вовлечения в дальнейшем, с ферментом в сочетании третичный Ab (трехступенчатый косвенный метод), который связывается с вторичным Ab. Обычно используемые методы обнаружения косвенными являются авидин-биотин и пероксидазу-antiperoxidase (PAP). В качестве альтернативы, щелочной фосфатазы-antialkaline фосфатазы (APAAP) комплекс может быть использован вместо метода РАР. Следует отметить, что щелочной фосфатазы (AP) методы , как представляется, еще более чувствительны , чем методы иммунопероксидазных 4. комплексный метод авидинбиотиновом (АВС) использует биотинилированные вторичные Ab в комбинации либо с меченным авидинбиотиновом комплекса (LAB), или меченый стрептавидин-биотин комплекса (ПЛИТА). Чувствительность обнаружения может быть дополнительно увеличена за счет привлечения авидин , меченный пероксидазой или щелочной фосфатазы 8. Другие методы обнаружения в использовании полимерные маркировки, тирамин усиление и иммуно-катящегося кольца 9. Следует отметить, что различные методы обнаружения могут быть объединены для многократного обнаружения Ag в той же ткани,образец, о котором сообщалось в первый раз в 1978 году 4. Одновременный двойной иммунным окрашиванием , представленной здесь проводили в фиксированных формалином, парафин крысиных срезах тканей ЦНС и LN с использованием пероксидазы переплете и АР-конъюгированные вторичные антитела, соответственно. Сигналы визуализировали с использованием 3,3'-diaminobencidine (DAB) хромоген и быстрый синий (FB) APAAP комплекс, соответственно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этическое Заявление
Данное исследование проводится в соответствии с рекомендациями Национального совета Швеции лабораторных животных и Директивы Европейского Сообщества Совета (86/609 / EEC) в соответствии с этическими разрешений N338 / 09, N15 / 10 и N65 / 10, в котором были утверждены Комитет Северной Стокгольм животных по этике.

1. Подготовка ткани

  1. Перфузия & крепление
    1. Обезболить животное с изофлуран для выполнения transcardial перфузии через левый желудочек. Инициирование промывку сосудистую фосфатно-солевым буфером (PBS) для удаления компонентов крови, а затем 4% параформальдегидом в 0,1 М PBS (PFA).
    2. Сосредоточение расчлененный мозги, спинной мозг и периферические ткани LN, погружая в PFA. Через 24 ч при температуре 4 ° С, не передавать ткани, из PFA в PBS и хранят при температуре 4 ° С до дальнейшей обработки. В качестве альтернативы коммерческим PBS, растворить 9 г NaCl в 250 мл S &# 246; Rensen буфер и добавьте 750 мл деионизированной воды (дН 2 O); подготовить 0,2 М Соренсен буфера (рН 7,4) растворять 13,8 г NaH 2 PO 4 х 1H 2 O и 71,2 г Na 2 HPO 4 х 2H 2 O в 2,5 л дН 2 O.
  2. Обезвоживание и вложения
    1. Отрежьте ткани в приблизительно 5 мм толщиной порциями с помощью лезвия бритвы.
    2. Инициировать ткани упрочнения процесса (обезвоживание) с использованием ткани-Tek VIP Вакуумная инфильтрация процессор (стандартная процедура , основанная на погружения в воду в концентрации восходящих этанола с последующим ксилолом и , наконец , парафин (таблица 1).
    3. Поместите ткань в форму и залить в жидкий парафин вокруг образца, чтобы сформировать "парафиновый блок". Длительное хранение требует комнатной температуры (RT). Тем не менее, до секционирования, рекомендуется , чтобы охладить блоки, например, в течение ночи (O / N) при температуре 4 ° С.

2. Секционирование

  1. Поместите блок парафина в основной держатель санно микротома, который может перемещаться назад и вперед через нож. Отрегулировать оптимальный угол между блоком и микротома нож (который зависит от геометрии ножа, но и от скорости резки и техники).
  2. Вырезать 3 - 5 мкм поперечные сечения из парафинового блока.
  3. Передача просто вырезать секцию в контейнер воды и смонтировать его затем из воды на предметное стекло.
  4. Осторожно нажмите на установленную секцию против бумажное полотенце, чтобы удалить остатки воды и возможные пузырьки воздуха. Коммерчески предварительно покрытые клейкие стеклянные слайды рекомендуется.
  5. Сухой слайды в течение нескольких часов в печи на 50 - 60 ° C.

3. Депарафинирование (Регидратация & Блокирование эндогенной пероксидазы)

  1. Погрузите слайды 2x в ксилоле (в альтернативном варианте ксилол заменительXEM-200), каждый раз, когда 15 - 20 '.
  2. Полоскание в 99% этаноле.
  3. Для того, чтобы блокировать эндогенную активность пероксидазы, инкубировать секций в течение 30 мин в метаноле растворе, содержащем 0,25% перекиси водорода.
  4. Продолжить регидратации с использованием этанола с увеличением содержания воды (99%, 70%, в конечном итоге в дистиллированной воде.
  5. С этого момента и до монтажа на покровных стеклах секции должны быть сохранены сырыми.

4. Антиген Retrieval

  1. Используйте пароварку для кипячения слайдов в растворе поиска взаимосвязанного антигена (в данном случае ЭДТА , рН 8,5 буфер) в течение 60 '(ЭДТА буфер исходный раствор содержит 1,21 г Трис и 0,37 г ЭДТА , растворенного в 50 мл дН 2 O, для приготовления рабочего разбавленный раствор 2,5 мл ЭДТА раствор в 47,5 мл дН 2 O).
  2. Охладить слайды на комнатной температуре в течение прибл. 1 ч, а затем промыть 3 - 5x с Трис-солевом буферном растворе (TBS, используют в качестве альтернативы PBS), состоящий из 0,05 М Трис и 0,15 М NaCl; рН 7,5 доводили Wiй HCl. В качестве альтернативы использовать коммерческую TBS.

5. Блокирование неспецифических сайтов связывания

  1. Для того, чтобы избежать неспецифические фоновые реакции, инкубировать разделы по комнатной температуре в течение 30 мин в блокирующем растворе, содержащем 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) и 90% буфера DAKO.

6. Дважды иммунноокрашивания: Одновременная Инкубация с первичными Абс

  1. Развести необходимое количество первичных антител в блокирующем растворе и инкубировать O / N при температуре 4 ° С. Для получения двойного иммуноокрашиванием объединить альфа-эотаксина (Ccl11; 1: 300) с альфа-CD68 (Ed1; 1: 1000) или α-Iba1 (Aif1, 1: 1000) или α-Cd8α (Ox-8; 1: 200) ,
  2. Ополосните слайдов 3-5x с буфером TBS (использовать в качестве альтернативы 10x разбавленный буфер DAKO).
  3. Развести необходимое количество вторичных антител (биотинилированных анти-коза и AP-сопряженную анти-мышь, как 1: 200) в блокирующем растворе и инкубировать 1 час на RT.
  4. Промыть слайды 3 - 5x с буфером TBS (насе альтернативно 10x разводили DAKO буфера).
  5. Инкубируйте слайды с авидин-пероксидаза хрена (HRP комплекса), разведенного в блокирующем растворе в течение 1 часа по РТ.
  6. Промыть слайды 3 - 5 раз с TBS буфером (использовать в качестве альтернативы 10x разбавленный буфер DAKO).

7. Визуализация

  1. Визуализация связанного AP-меченным вторичным антителом
    1. Готовят 0,1 М Трис-HCl, растворяя 12,1 г трис - в 1 л дН 2 O и доведения рН до с помощью HCl. Используйте один и тот же буфер Tris-HCl, чтобы приготовить 1М раствор левамизол. Подготовьте свежемолотый 4% раствор NaNO 2 в дН 2 O.
    2. Для того, чтобы получить 50 мл Быстрого голубой (FB) субстрат (объем, необходимый для одной стандартной стеклянной кювете) растворяет 6,25 мг нафтол-AS-MX-фосфатдегидрогеназы в 312,5 мкл ДМФА в стеклянной трубке и размешать в 50 мл подогретого (37 ° C), буфер Трис-HCl. Растворить 12,5 мг FB RR соли в 312,5 мкл 2 н HCl добавляют 312.5 мкл ранее Подготовительномкрасный 4% раствор NaNO 2 , и перемешивали смесь в те же 50 мл подогретого буфера трис-HCl. Слегка встряхните, пока желтая жидкость не станет ясно, и, наконец, добавить 77 мкл предварительно приготовленного раствора 1 М левамизол. Фильтрата полученную смесь и вылить на предметные стекла помещают в стеклянную кювету.
    3. Инициировать инкубации при 37 ° С и контролируют процесс развивается под световым микроскопом, прибл. через каждые 15 - 30 мин. Поворачивая нечеткое, замените FB раствора свежей смеси.
    4. Промыть слайды 3 - 5x с TBS буфером и передачи затем в буфере PBS.
  2. Визуализация связанного биотинилированного вторичного антитела
    1. Приготовьте DAB / H 2 O 2 проявляющий раствор путем разбавления 1 мл маточного раствора DAB (25 мг DAB в 1 мл PBS) в 49 мл PBS. Добавить 16,5 мкл H 2 O 2 и фильтрат перед заливкой на секции.
    2. Преобразование хромогена DAB в лоб осаждающейсяп пигмент может быть немедленным. Контроль процесса разработки под световым микроскопом (даже пару секунд дольше инкубации может вызвать высокий фон и замаскировать специфический сигнал).
    3. Интенсивность осадка коричневого пигмента может быть альтернативно повышена путем инкубации в растворе, состоящем из 2% сульфата меди и 0,9% NaCl в течение 5 '.
    4. Промыть слайды 3 - 5 раз с PBS и , наконец , с дН 2 O, используют в качестве альтернативы водопроводной воды.
    5. Установите слайды с крышкой скользит непосредственно из воды с помощью водной GelTol монтажной среды. Избегайте создания пузырьков воздуха.
    6. Разрешить полного высыхания монтажной среды, например, о / п при 4 ° С. Хранить сушеные слайды на RT.
1. % Спирт этиловый 20 ' 40 ° C
2. % Спирт этиловый 60 &# 39; 40 ° C
3. % Спирт этиловый 90 ' 40 ° C
4. % Спирт этиловый 60 ' 40 ° C
5. % Спирт этиловый 90 ' 40 ° C
6. % Спирт этиловый 60 ' 40 ° C
7. % Спирт этиловый 90 ' 40 ° C
8. % Спирт этиловый 120 ' 40 ° C
9. Ксилол 30 ' 40 ° C
10. Ксилол 60 ' 40 ° C
11. парафиновый 60 ' 60 ° C
12. парафиновый 60 ' 60 ° C
13. парафиновый 60 ' 60 ° C
14. парафиновый 120 ' 60 ° C

Таблица 1. Обработка тканей Tissue-Tek VIP вакуумной пропитки процессор.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Двойные immunostainings (со-окрашивании) были выполнены в фиксированных формалином, парафин крысиных ЦНС и LN секции. 3-5 мкм срезы толщиной ткани были вырезаны с помощью саней микротома, установленный впоследствии на предварительно покрытых стеклах клеевых и обрабатывают , как описано ранее 10,11,12. Если коротко, то после того, как deparaffinizing, регидратации ткани и эндогенной пероксидазы инактивацией срезы подвергали процессе извлечения антигена, с последующей стадией блокировки звонков неспецифические сайты связывания. Со-окрашивание были выполнены в следующих комбинациях: я) Ccl11 / МАА-1, II) Ccl11 / Ed1 и III) Ccl11 / CD8. Первичный Абс используется для каждого совместного окрашивания были повышены в двух разных видов (козьих и мыши, соответственно), что дало возможность их одновременной инкубации. Ccl11 визуализировали коричневого продукта реакции пероксидазы, в то время как Iba-1, Ed1 и CD8, визуализировали с помощью синего сигнала AP.

10. Согласно ВВК анализ , проведенный на крысах ЦНС, Ccl11 присутствовал в pericarya, дендритов и аксонов нейронов , расположенных в вентральной рога серого вещества спинного мозга (рис 1А и В). Кроме того, одиночные Ccl11 + клетки плазмы были обнаружены в одних и тех же участках ткани (рис 1А), а также одного Ccl11 + / Ed1 + макрофаги и микроглия резиденты мозга , наблюдаемые на участке воспаления (данные не показаны; Ed1 является маркером лизосомальных белка в активированных макрофагах и микроглии 13). Примечательно, что Ccl11 хемокин не был найден совместно с локализацией Iba-1 + макрофагах и микроглии мозга (резидентные 1А; Iba-1 является маркером для обнаружения ионизируется Ca 2+ -bindi нг белка 14).

IHC на основе белка таргетирование проводят в периферических ЛУ крыс выставлены Ccl11 белка совместная локализация с Ed1 (рис 2В). Тем не менее, нет Ccl11-секретирующих CD8 + Т - лимфоциты , не были обнаружены в одних и тех же срезах ткани (рис 2А, CD8 + клетки были обнаружены с помощью анти-Cd8α, маркер преимущественно цитотоксические Т - клетки , которые связываются с МНС класса I молекул 15). для исключения первичных Abs во время o / n инкубации в блокирующем растворе За исключением случаев, секции управления обрабатывали, как описано в протоколе. Нет Обнаружение сигналов целевых белков (представленных на фигурах 1А, В и 2А, В) не наблюдалось в секциях ЦНС и Л.Н. управления (фиг.1С и 2С, соответственно).

s / ftp_upload / 50425 / 50425fig1.jpg "/>
Рисунок 1. A, B: Двойной Иммунологическое в Rat LN. Первичные антитела , направленные против хемокина Ccl11 в комбинации либо с альфа-CD8 (А) или Ed1 (В). Не наблюдалось совместная локализация в пределах одной ячейки для Ccl11 + (коричневый) и CD8 + клеток (синий . ) B: Ccl11 сигнал обнаружения (коричневый) совместно локализирующем с маркером для белка лизосомной в макрофагах (Ed1, синий). C: Отрицательный контроль; деталь показывая немаркированные клеток - резидентов в периферийном LN. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. A, B: Двойной Иммунологическое в Rat SPinal шнура. Брюшной рог серого вещества , проявляющего Ccl11 в нейрональных pericarya, дендритов и аксонов (коричневый) совместно окрашивались либо Iba-1 + (A; синий) или ED1 + (B, синий) макрофаги / микроглии клетки C:. Отрицательный контроль; деталь показывая немаркированные клеток - резидентов в вентральном роге серого вещества спинного мозга. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Стандартные процедуры IHC часто требуют определенных корректировок для получения оптимального результата, который обычно подразумевает обширный опыт, но и "проб и ошибок" подход. От подготовки ткани до целевой визуализации, почти каждый шаг в протоколе не может быть подвергнут индивидуально разработаны модификации для того, чтобы улучшить конечный результат. Протокол Двойное окрашивание, представленные здесь служит примером IHC на основе белка таргетирования особенно скорректирована для оценки взаимосвязи между белками-мишенями нашего интереса к разделам ЦНС и LN ткани фиксированные формалином, парафин крыс, затронутых нейровоспаления. Как таковой, он может быть использован в качестве обучающей программы для обучения технику IHC, но и в качестве источника вдохновения для более продвинутых испытаний. Тем не менее, следует иметь в виду, что простое воспроизведение этого протокола для нацеливания других белков, и / или в других тканях, чем здесь представленных, может генерировать неоптимальные результаты.

В гибридизация с использованием запертой нуклеиновой кислоты (LNA) Riboprobe против Ccl11 выставлены повышающую регуляцию соответствующих уровней мРНК в ЦНС от конгенных штамма крыс 10. Этот вывод был подтвержден кПЦР анализов. Кроме того, КПЦР показал Ccl11 повышающую регуляцию также в конгенных периферических ЛУ по сравнению с диким типом (вес) штамма. И, наконец, Вестерн - блот (ВБ) показал значительную положительную регуляцию белка Ccl11 в обеих тканях - мишенях болезненного защищенный конгенных штамм крысы 10. Поэтому мы стремились исследовать происхождение этого хемокина непосредственно в ткани-мишени, и для этой цели мы разработали здесь описанный двойной протокол окрашивания.

Кроме того, во избежание механического повреждения ткани во время посмертного вскрытия и после фиксации декальцинации, ткани секционирования может показаться довольно сложной задачей. Секционирования, как правило, требует навыков и практики. Качество среза зависит от многих аспектов сUCH как регулировка прямой угол между блоком ткани и нож для того , чтобы уменьшить давление , прилагаемое на образце в процессе резания, скорость резания и т.д. Толщина залитых парафином тканевых срезов , полученных ездовой микротома может варьироваться от 2 до 50 мкм. Вырезать ломтики парафиновые ткани установлены из ванны с теплой водой на стеклянные слайды предпочтительно коммерчески покрытые клеем, такие как поли-L-лизина или Аминопропилтриэтоксисилан (APTS), чтобы обеспечить лучшее удержание во время окрашивания с требованием процедуры. В отличие от крио срезов ткани, которые разрезают примерно -20 ° С, используя cryomicrotome и сушат при комнатной температуре до окрашивания, охлажденный парафиновые блоки нарезаются при комнатной температуре, а затем сушат при температуре 50- 60 ° С до депарафинизации.

Очень сохранившейся архитектурой ткани, морфологии клеток и целевые эпитопы имеют важное значение для оценки локализации и взаимосвязь белков-мишеней. Для достижения оптимальной preser тканивации, образцы должны быть надежно закреплены, используя либо коагулирующая или сшивающие фиксативов. Коагулирующие фиксаторов, такие как этанол, чаще используются для криоконсервации. Денатурации белка с использованием этанола достигается за счет тканевой дегидратации 9; что может привести к недостаточному клеточной консервации 16. В отличие от коагулирующих фиксаторов, формальдегид представляет собой сшивающий фиксатив , который наиболее часто используется в рутинной гистологии и IHC 9 как для крио- и парафиновой консервации тканей. Мы достигли оптимальной фиксации для крысы ЦНС и LN, погружая в раствор формальдегида в течение 24 ч при 4 ° С до декальцинации и последующего парафин. Несмотря вызывает глубокие изменения в конформации макромолекул (формальдегид, а именно образует метиленовые мостики, белки и сшивки таким образом маскируют антигены, которые могут предотвратить специфическое связывание антител), это полу-обратимой, ковалентная реагент обеспечивает высокое каченость сохранения тканей. Следует отметить, что температура и продолжительность фиксации с сшивания реагентов могут повлиять на некоторые аспекты, такие как IHC секционирования, обнаружение эпитоп и даже перекрестной реактивности. Таким образом , и в соответствии с фиксацией и чрезмерной фиксации с использованием альдегидов на основе реагентов , таких как формальдегид может вызывать артефакты, которые в первую очередь из - за автолиза или перекрестные связи 17 соответственно. Тем не менее, неспецифической фоновое окрашивание за счет гидрофобного связывания с белками наблюдали overfixation может быть уменьшено с помощью низких соленых буферов , содержащих неионогенные моющие средства, или путем повышения рН буфера для разведения при использовании поликлональные Abs 18. Тем не менее, неспецифической фоновое окрашивание (шум) , вызванное ионными и электростатических взаимодействий белков может быть уменьшена с помощью разбавителя буферов с высокой ионной силой, которая в то же время могут обострить шум , вызванный гидрофобными связывания с белками 18. Когда речь идет о выявлении целевых эпитопов, формальдегид-яnduced изменение третичной структуры белков могут быть, хотя и не полностью, восстанавливается посредством извлечения антигена 19: I) путем нагревания в буферах с различными значениями рН (термически индуцированные извлечения эпитоп (Hier), II) путем ферментативного разложения (протеаза-индуцированный поиск эпитоп (ПИРС; 20)), III) путем инкубации в сильной щелочной или кислый раствор, или сахароза 21, 22 или IIII) путем обработки концентрированной муравьиной кислоты 23. HIER оказывается удобным для большинства мишени эпитопов 19. Кроме того, продолжительность нагрева, значение рН растворов, таких как ЭДТА (рН 5,5, 8,5 или 9,0) или цитрат натрия буфера (рН 6.0- 6.2) может иметь существенное значение для исхода HIER. Следует отметить, что наиболее удовлетворительный результат в нашем исследовании, было достигнуто за счет обработки паром образцы в течение 1 ч в растворе ЭДТА при рН 8,5.

Хотя антитела преимущественно связываются с их конкретными эпитопов, привлечение к неспецифическим, подобно родственному Ag связываниясайты, не могут быть полностью исключены. Примечательно, что, вероятно , является наиболее эффективным методом для снижения фонового окрашивания является инкубирование в блокировании белки (такие как FCS , используемые в нашем исследовании) перед применением первичного Абс 9. Моноклональные первичные Абс так или иначе предпочтительнее поликлональных антител из-за более высокой специфичности и тем самым снижения неспецифического фонового сигнала. Тем не менее, перекрестная реактивность по- прежнему может появиться, как мышиные моноклональные Абс направлены против эпитопов , обычно состоящие из небольшого числа аминокислот, которые могут быть частью некоторого другого (неспецифического) белка 24. В отличие от моноклональных антител, поликлональные Abs имеют более высокую вероятность распознавания нескольких изоформ белка-мишени. Первоначально мы использовали два различных первичного Abs для обнаружения Ccl11: я) поликлональное, поднятого в козу и II) моноклональное, поднятого в мыши. В наших руках, оба продукта выставлены по той же схеме окрашивания на целевом хемокина. Для того чтобы выполнить одновременное совместное окрашивание, мы использовали козье антитело крысы Ccl11 Ab в сочетании с антителами против Iba-1, Ed1 и CD8, соответственно, которые все были произведены на мышах. Тем не менее, к тому же одновременно, двойное иммунное окрашивание может также выполняться последовательно 25, как это требуется для совместного маркировки первичной Abs , произведенного в тех же видов.

Оптимальная рабочая концентрация Абс, используемых в нашем исследовании оценивалась с помощью серии испытаний для разбавления в качестве оптимального соотношения между интенсивностью конкретного сигнала и фонового шума. Тем не менее, следует иметь в виду , что оптимальная рабочая концентрация того же антитела могут иногда изменяться от органов, видов, фоновой патологии и т.д. Следует отметить, что пермеабилизации не требовалось в нашей процедуры окрашивания , выполняемого в парафином, 3-5 мкм Срезы толщиной ткани, тем не менее, моющие средства, такие как Triton X-100 еще может быть использован для уменьшения поверхностного натяжения и, таким образом, чтобы облегчить связывание между антигеном и антителом. Нанаоборот, permeabilization- опосредованной улучшение проникновения Ab обычно требуется для обнаружения белков в культивируемых клетках или клеточные суспензии (иммуноцитохимия (ICC)), для иммунофлуоресценции (ИФ) в крио секциях и IHC / IF в свежем (толстый, vibratome вырезом) FREE- плавающие кусочки ткани.

Несколько элементов управления принципиально важны для создания конкретного / надежного immunotargeting. В качестве положительного контроля, мы использовали легкие от крысиной модели астмы, где можно было бы обнаружить Ccl11 + эозинофилы. Негативные контроли инкубировали только в блокирующем растворе o / n при температуре 4 ° С в отсутствие первичного Абс.

Мы уже упоминали некоторые причины и возможные средства для уменьшения фонового сигнала. Неспецифическое иммунное продукт также может возникать как реакция между ДАБ и pseudoperoxidase красных кровяных клеток и пероксидазы из миелоидных клеток 26. Активность этих ферментов, так как шум Causред эндогенного биотина или AP уже снижается во время формалином фиксации. Тем не менее, предварительная обработка смесью метанол / H 2 O 2 необходимо для их дальнейшего или полной инактивации 27, 28. Фоновое окрашивание , вызванное деятельностью AP в тканях млекопитающих может быть дополнительно тормозится левамизол 29, или с помощью уксусной кислоты 29. Неспецифическое связывание в результате ионного притяжения между авидин и противоположно заряженных молекул клеточной 30 можно избежать путем замены авидин из яичного белка с стрептавидина из Streptomyces avidinii 31.

DAB является, вероятно, наиболее часто используемый хромоген в IHC. К тому же ДАБ (коричневый продукта реакции), другие пероксидазу Хромогены в использовании 3-амино-9-ethylcarbazole (AEC, красный), 4-хлор-1-нафтол (CN, синий) и тетраметилбензидином (ТМВ, синий). Обычно выбранные AP Хромогены являются FB, Fast Red (FR), новый фуксин и 5-бром-4-хлор-3-indolylphosphate / нитро блуе хлорида тетразолия (BCIP / NBT). Выбор ферментов и хромогенами в основном независимо от индивидуальных предпочтений, тем не менее, он может управляться с помощью целевых функций , таких как локализация, паттерна экспрессии, но и наличием эндогенных пигментов (меланин, гемосидерина) 32. Контрастное является последним, факультативный шаг в процедуре IHC обычно осуществляется с использованием гематоксилин, ядерный быстрый красный или метил зеленый 18. Как правило, больше подходит для одной маркировки, контрастное облегчает интерпретацию морфологии тканей, и она должна быть тонко разработан, чтобы избежать каких-либо помех осадка хромогена.

После завершения процедуры окрашивания участков ткани должны быть тщательно смонтированный с покровным с помощью монтажного среды. Формирование пузырьков воздуха следует избегать. Помимо физической защиты, гистологическая среда улучшает визуализацию и качество изображения. Либо органический / гидрофобными или водно / гидрофильные, ЦОOICE монтажной среды в зависимости от растворимости конечного продукта в органическом растворителе. В то время как на основе гистологическая среда толуол будет подходящим, например, для DAB, водная гистологическая среда может быть применена ко всем ферментативных хромогенами, включая маркировку флуоресценции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) Baxter 1001936060 Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment.
Sodiumchloride (NaCl) Merck 1.0604
Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet Sigma-Aldrich P4417
Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% in 1x PBS Apl pharma 34 24 28 Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity.
Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) Sigma-Aldrich 459844-1L Flamable.
Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 Sigma-Aldrich 534056 Flamable. Acute toxicity.
Histo-Comp Paraffin Wax Tissue-Tek V0-5-1001
Adhesive Microscope Slides Starfrost MIC-1040-W
Xylol substitute XEM-200 Vogel GmbH ND-HS-200 Respiratory sensitization. Carcinogenicity.
α-CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody AbD Serotec MCA48G
α-Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody Millipore MABN92
α-CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody AbD Serotec MCA341R
α-eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody Santa Cruz BT SC-6181
Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody Dakopatts, Denmark D0314
Biotinylated secondary antibody Amersham Biotech RPN1025
Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) Sigma-Aldrich A3151
Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) Sigma-Aldrich N4875-1G Acute toxicity.
Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) Sigma-Aldrich FBS25
Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) Sigma-Aldrich 31742 Acute toxicity.
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) DAKO S3000 Highly flammable. Toxic.
Copper sulphate (CuSO4) Merck 1.02791 Acute toxicity. Environmental hazzard.
GelTol Aqueous Mounting Medium Thermo Electron Corporation 230100
Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) Merck 107210 Acute toxicity.
Methanol (CH3OH) Fluka 65543 Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable.
Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) AppliChem A1379 Skin and eye irritation.
Tris Buffered Saline (TBS), tablet Sigma-Aldrich T5030
Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) Merck 1.0658
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) Merck 1.06346
Fetal calf serum (FCS) Cambrex BioScience DE-14-802F
DAKO cytomation wash buffer 10x DAKO S3006 Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming.
N,N-Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) Fluka 40250 Flammable. Acute toxicity.
Glas coverslips 24 x 36 mm Menzel-Gläser BB024036A1
Hydrochloric acid, conc. (HCl) Sigma-Aldrich 30721 Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.
Hydrochloric acid solution volumetric, 2 M HCl (2 N) Fluka 71826 Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.
Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) Sigma-Aldrich S2252 Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment.
Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) Merck 1.08454 Oral exposures may cause reproductive and developmental effects.
Equipment
Tissue-TekV.I.P Vacuum Infiltration Processor Sakura 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz
Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome Hacker instruments
Household food steamer Braun MultiGourmet FS 20
Light microscope Leica Polyvar 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
  2. Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
  3. Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).
  4. Mason, D. Y., Sammons, R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).
  5. Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).
  7. Polak, J. M., Van Noorden, S. Introduction to immunocytochemistry. Bios Scientific Publishers Ltd. Oxford, UK. (2003).
  8. Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods. American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).
  9. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Vet Pathol. 42, 405-426 (2005).
  10. Adzemovic, M. Z., et al. Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats. PloS one. 7, 39794 (2012).
  11. Bauer, J., et al. Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes. Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).
  12. Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord. The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).
  13. Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).
  14. Hirasawa, T., et al. Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).
  15. Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature. 336, 79-81 (1988).
  16. Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).
  17. Hayat, M. Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy. Kluwer Academic. New York. (2002).
  18. Boenisch, T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).
  19. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).
  20. Huang, S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).
  21. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).
  22. Taylor, C. R., Shi, S. R. Antigen retrieval: call for a return to first principles. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).
  23. Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).
  24. Nelson, P. N., et al. Monoclonal antibodies. Molecular pathology : MP. 53, 111-117 (2000).
  25. Van der Loos, C. Immunoenzyme multiple staining methods. Bios Scientifc publishers Ltd. New York. (1999).
  26. Elias, J. Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis. ASCP Press. Chicago. (2003).
  27. Straus, W. Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).
  28. Streefkerk, J. G. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).
  29. Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).
  30. Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones. Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).
  31. Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells. The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).
  32. Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics