Whole Cell Patch-Clamp für erforschen die Mechanismen der Infrarot Neural Stimulation

Neuroscience

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Summary

Infrarot Nervenstimulation als Alternative, eine elektrische Stimulation in einem Bereich von Nerven-Typen, einschließlich derjenigen mit auditorischen System zugeordnet vorgeschlagen. Dieses Protokoll wird ein Patch-Clamp-Verfahren zur Untersuchung des Mechanismus der Infrarot Nervenstimulation in einer Kultur von primären auditorischen Nervenzellen.

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Brown, W. G. A., Needham, K., Nayagam, B. A., Stoddart, P. R. Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation. J. Vis. Exp. (77), e50444, doi:10.3791/50444 (2013).

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Abstract

Es hat sich in den letzten Jahren gezeigt, dass gepulste Infrarot-Laserlicht verwendet werden, um elektrische Reaktionen in neuronalen Gewebe hervorzurufen, unabhängig von einer weiteren Abwandlung der Zielgewebe. Infrarot neuronale Stimulation in einer Vielzahl von peripheren und sensorischen neuronalen Gewebe wurde in vivo angegeben, wobei besonderes Interesse an der Stimulation der Nervenzellen im auditorischen Nervenzellen gezeigt. Während jedoch INS gezeigt wurde, dass in diesen Einstellungen funktionieren, ist der Mechanismus (oder Mechanismen), durch die Infrarot-Licht bewirkt neuronalen Erregung momentan nicht gut verstanden. Das Protokoll hier beschreibt eine ganze Zelle Patch-Clamp-Methode entwickelt, um die Untersuchung von Infrarot neuronale Stimulation in kultivierten primären auditorischen Neuronen zu erleichtern. Durch gründliches Charakterisierung der Reaktion dieser Zellen auf Infrarot-Laserbelichtung in vitro unter kontrollierten Bedingungen kann es möglich sein, ein verbessertes Verständnis der grundlegenden Physica gewinnenl und biochemischen Prozessen zugrunde liegenden neuronalen Infrarot-Stimulation.

Introduction

Die Felder der Neurophysiologie und medizinischen Bionik verlassen sich stark auf Techniken, die steuerbare elektrische Stimulation der Antworten in Nervengewebe zu ermöglichen. Während elektrische Stimulation bleibt der Goldstandard in der neuronalen Erregung, leidet es an einer Reihe von Nachteilen wie das Vorhandensein der Stimulation Artefakte bei der Aufzeichnung neuronalen Antworten und einen Mangel an Stimulation Spezifität aufgrund der Ausbreitung von Strom in das umliegende Gewebe ein.

Die letzten zwei Jahrzehnte haben die Entwicklung von optisch vermittelten Stimulation Techniken 2 zu sehen. Einige dieser Techniken ist eine Änderung des Zielgewebes, entweder durch Zugabe eines bestimmten Moleküls (zB Käfig Moleküle) 3 oder irgendeine Form der genetischen Manipulation (z. B. optogenetics) 4, die beide nicht leicht außerhalb eines Forschungssetting gelten. Von besonderem Interesse ist daher Infrarot Nervenstimulation (INS), whereby Nervengewebe durch gepulste Infrarot-Laserlicht angeregt. INS hat das Potenzial, viele der Mängel der elektrischen Stimulation, indem du hochspezifische, berührungslose Stimulation von Nervengewebe 2 überwinden. Während jedoch INS wurde erfolgreich in einer Vielzahl von Einstellungen in vivo gezeigt, bleibt der genaue Mechanismus der Anregung unsicher.

Einige neuere Veröffentlichungen haben Fortschritte bei der Aufdeckung der Mechanismus hinter INS 5-7 gezeigt. Schnelle Erwärmung durch Absorption des Laserlichts durch Wasser scheint eine wichtige Rolle zu spielen. Doch jenseits dieser Konsens ist noch nicht erreicht. Shapiro et al. 7 schlagen eine sehr allgemeine Mechanismus, durch schnelle Erwärmung verursacht eine Störung in der Verteilung der geladenen Partikel angrenzend an die Zellmembran, was zu einer Änderung der Kapazität der Zellmembran und nachfolgende Depolarisation. Darüber hinaus Albert et al. 5 behaupten, dass laser induzierte Erwärmung aktiviert eine spezifische Klasse von temperaturempfindlichen Ionenkanälen (transient receptor potential vanilloid Kanäle), so dass Ionen durch die Zellmembran passieren. Zu diesem Zeitpunkt ist es unklar, wie diese Mechanismen zu kombinieren, oder auch, ob es weitere Faktoren, die noch identifiziert werden.

Obwohl eine kleine Anzahl von Publikationen (Referenzen 5,7-9) INS in vitro untersucht haben, hat sich die überwiegende Mehrheit der Arbeiten in diesem Bereich veröffentlicht wurden in vivo durchgeführt (zB Referenzen 1,6,10-18). Infrarot Stimulation der akustischen Neuronen hat eine Fläche von besonderem Interesse, wegen der möglichen Anwendungen in Cochlea-Implantaten 10,14-18. Während in vivo Experimente sind wichtig, um die Wirksamkeit der Technik in verschiedenen Einstellungen, die erhöhte Maß an Kontrolle gewährt durch in-vitro-Studien wird erwartet, dass eine genauere Verständnis der mech führen überprüfenmus verantwortlich für INS. Dieser Bericht beschreibt die Herstellung von kultivierten Neuronen Spiralganglienzellen für Patch-Clamp-Untersuchungen, da diese verwendet werden, um grundlegende Mechanismen zu studieren, während auch die Verknüpfung der großen Körper der vorhandenen Daten aus dem auditorischen System werden.

Die Patch-Clamp-Technik ist ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Untersuchung von elektrophysiologischen Phänomene, ein Mittel zur Aufzeichnung der elektrischen Aktivität in einzelnen Zellen und der Untersuchung der Beteiligung der einzelnen zugrunde liegenden Strömungen 19. Wenn diese Technik zu einer stabilen in vitro Herstellung von primären Neuronen, wie kultivierten Neuronen Spiralganglienzellen angewendet, bietet es die Möglichkeit, in die Tiefe, durch welche Mechanismen neuronaler Aktivität gesteuert und manipuliert wird, zu studieren.

Die Protokolle in dieser Arbeit Umriss Methoden zur Untersuchung der Wirkung von Laser-Stimulation auf die elektrischen Eigenschaften der Spirale Ganglionneuronen angegeben durch Patch-Clamp-Aufnahmen. Der Ansatz basiert auf einer Faser-gekoppelte Laser anstelle eines Freiraum-Laser basiert, ermöglicht einen sicheren Betrieb sowie einfacher und wiederholbare Ausrichtung ohne die Notwendigkeit, die Standard-Mikroskop-Konfiguration ändern. Auf der Grundlage dieser Protokolle, sollte es möglich sein, eine breite Palette von Experimenten durchzuführen, um mehr eindeutig zu bestimmen, den Mechanismus oder Mechanismen INS.

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Protocol

1. Kultur von Spiral Ganglionneuronen

  1. Sterilisieren kleinen runden (z. B. 10 mm Durchmesser) Deckgläschen und gebogenen Pinzette in einem Autoklaven. Übertragen Sie die sterilisierten Deckgläschen in einzelne Vertiefungen einer sterilen 4-Ring 35 mm Petrischale oder 4-Well-Platte mit den sterilisierten Pinzette. Bewerben 150 ul von Poly-L-Ornithin (500 ug / ml) und Mauslaminin (0,01 mg / ml) auf die Oberseite des Deckglases und in einen Inkubator (37 ° C) für bis zu 48 Stunden. Stellen Sie sicher, dass die Deckgläser schwimmen nicht weg von dem Boden des Bohrlochs.
  2. Planen 50 ml sterile Neurobasal Medien (NBM) für jedes neuronale Kultur: 47,5 ml Neurobasalmedium A, 0,5 ml N 2 Supplement 1 ml B27 Supplement, 0,5 ml L-Glutamin und 0,5 ml Penicillin-Streptomycin. Hinweis: Supplements eingefroren werden kann, bei -20 ° C gelagert und zu den Medien am Tag erforderlich.
  3. Dissociate Spiralganglienzellen Neuronen aus postnatalen Tag 4-7 Rattenjungen wie zuvor 20,21 beschrieben, unsING sowohl enzymatische (0,025% Trypsin und 0,001% DNase I) und mechanischen Techniken. Siehe Whitlon et al. 22 und Vieira et al. 23 für detaillierte Verfahren der Spiralganglienzellen Neuron Kultur oder Parker et al. 24 für eine Demonstration Modiolus Isolation.
  4. Saugen Sie alle verbleibenden poly-L-ornithine/laminin Lösung von den Deckgläsern und waschen kurz mit NBM.
  5. In 150-200 ul des dissoziierten Spiralganglienzellen Neuron Suspension auf die Deckgläser und Ort in einen Inkubator (37 ° C, 10% CO 2). Hinweis: bis zu 20 Deckgläser kann von einem durchschnittlichen Wurf von 8 Rattenjungen hergestellt werden.
  6. Vier Stunden nach dem Ausplattieren Neuronen absaugen Lösung um Zelltrümmer zu entfernen und ersetzen mit 150-200 ul erwärmte frische NBM. Hinweis: Medien können täglich Nachschub benötigen, um Austrocknung zu vermeiden.
  7. Zurück Deckgläser in den Inkubator bis zur elektrophysiologischen Ableitungen erforderlich. Hinweis: dissoziierten SpiraleGanglion Neuronenkulturen können elektrophysiologischen Experimenten Stunden nach der Dissoziation und für bis zu zwei Tagen danach verwendet werden. Zeit in vitro zu berücksichtigen bei der Analyse der Ergebnisse berücksichtigt werden. Tanken NBM jede 24-48 Std.

2. Vorbereitung für die Patch-Clamp-Recordings

  1. Bereiten Lösungen
    1. Intrazelluläre (Mikropipette) Lösung: 115 mM K-Gluconat, 7 mM KCl, 10 mM HEPES, 0.05 mM EGTA, 2 mM Na 2 ATP, 2 mM MgATP, 0,5 mM Na 2 GTP (auf pH 7,3 mit KOH; einstellen bis 295 mOsmol / kg mit Saccharose). Übergeben Sie die Lösung durch ein Sterilfilter (0,2 um) und teilen sich in 200 ul Aliquots bei -20 ° C bis zum Tag der Aufnahme gespeichert werden.
    2. Extrazelluläre (Badewanne) Lösung: 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 10 mM HEPES, 10 mM Glucose (auf pH 7,4 mit NaOH; anzupassen 300-310 mosmol / kg mit Saccharose) . Diese Lösung wird am Tag der Aufzeichnung gemacht.
  2. Bereiten Sie die Aufnahme Pipetten mit einem Widerstand von 2-6 MOhm. Wir verwenden ein CO 2-Laser-Abzieher (P-2000; Sutter Instruments) und Borosilikatglas (1,0 mm Außendurchmesser, 0,58 mm Innendurchmesser, 75 mm Länge).
  3. Bereiten Sie den Laser. Dieses Protokoll wird für die Verwendung mit einem fasergekoppelter Laser, wie die 1.870 nm Infrarot-Nerv-Stimulator aus OptoTech P / L. bestimmt Die optische Faser für leichte Lieferwagen in unseren Experimenten verwendet wird, ist ein 200/220 um Kern / Mantel Durchmesser Silica-Faser mit einer numerischen Apertur von 0,22 und FC-PC-Steckern an beiden Enden (AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C -0.22). Die Patchkabel wurden in zwei Hälften geschnitten, um zwei Faserpigtails (dh an einem Ende mit Steckverbindern und gespalten auf der anderen) zu produzieren. Die Auswirkungen Faserkerndurchmesser und die numerische Apertur auf laserinduzierten Temperaturänderungen im Detail von Thompson et al. 25
    1. Cleave die Spitze des Lichts Lieferung Faser unter Verwendung von Standardverfahrenund dass die sich ergebende Spitze von hoher Qualität ist durch Beobachtung mit einem optischen Mikroskop (dh die Spitze sollte senkrecht zu der Faserachse und erscheinen bei Sichtprüfung flach). Schließen Sie das Licht Lieferung Faser auf die Faser-gekoppelten Ausgang der Stimulation mit einem geeigneten Laser-Through-Anschluss (zB Thorlabs ADAFC2).
    2. Messen Sie den Ausgang Laserleistung von der gespaltenen Spitze des Lichts Lieferung Faser mit einem geeigneten Instrument (zB Coherent FieldMate mit LM-3-Detektor Kopf). Es wird empfohlen zu prüfen, die Laserleistung jedes Mal das Licht Lieferung Faser gespalten wird oder eine signifikante Anpassung wird mit dem Laser gemacht (z. B. Transport von einem Labor zum anderen).
    3. Legen leichte Lieferfahrzeuge Faser in einer Faser Futter oder einer gleichwertigen Einrichtung und bringen das Futter an die entsprechende Mikropositionierer. Es ist wichtig, dass eine genaue Bestimmung der Winkel θ, dass die optische Faser mit dem Deckglas macht. Diese angle können, indem sie ein Foto von der experimentellen Anordnung und mit Bildverarbeitungssoftware (zB ImageJ), um den Winkel zu erhalten, gemessen werden. Insbesondere dem Mikroskop - Der Winkel θ (oder einen Bereich von möglichen Winkeln) wird vor allem durch räumliche Einschränkungen der Versuchsanordnung eingeschränkt. Typische Werte von θ in unseren Experimenten (basierend auf einem aufrechten Mikroskop) sind um 36 °, aber die optimalen Winkel können sich erheblich für alternative Setups (zB solche mit einem inversen Mikroskop).
    4. Stellen Sie die Verbindungen zwischen dem Laser und der Patch-Clamp-Datenerfassungssystem (zB Digidata 1440A, Molecular Devices), wie in Abbildung 2 dargestellt. Die digitale Ausgabe aus dem Patch-Clamp-Datenerfassungssystem sollte der Laser über einen externen Funktionsgenerator verbunden werden, wodurch es möglich Pulsparametern unabhängig von dem Datenerfassungssystem angeben. Alternativ kann dieser Ausgang direkt angeschlossen werdender Laser-Treiber (erfordert die Pulsdauer und Wiederholrate durch die Datenerfassungs-Software eingestellt werden). In jedem Fall sollte das Signal verwendet wird, um den Laser auslösen zu einem Eingang der Datenerfassungs-System angeschlossen werden, um sicherzustellen, dass der Zeitpunkt und die Dauer der Laserpulse gleichzeitig mit der elektrophysiologischen Signal aufgezeichnet werden.

3. Patch-Clamp-Aufnahmen zur Untersuchung von INS

  1. Füllen Sie den entsprechenden Container der Perfusion mit extrazellulären Lösung und stellen Sie den Durchfluss, um die Perfusion des Bades mit einer Geschwindigkeit von 1-2 ml / min liefern. Wir verwenden eine Schwerkraft-System (Saugflasche, Quetschventils und PE-Schlauch) mit einem Durchlauferhitzer zu schnelle Erwärmung der Lösung und eine peristaltische Pumpe verbrauchten Lösung durch Absaugen entfernen können.
  2. Legen Sie ein Deckglas mit kultivierten Zellen in die Aufnahme Kammer (Badewanne) von einem aufrechten Mikroskop. Mit einer hohen Vergrößerung Wasser-Immersions-Objektiv (e. G. 40X) und Phasen-Kontrast (zB Differential-Interferenz-Kontrast oder Dodt Gradienten Kontrast), visuell lokalisieren die Spiralganglienzellen Neuronen in der Kultur. Ein typisches Spiralganglienzellen Neuron Phase-hell, rund und etwa 15 &mgr; m im Durchmesser mit einem prominenten Kern, wie in Abbildung 1a gezeigt.
  3. Sobald ein Neuron lokalisiert worden ist, auf eine niedrigere Vergrößerung Ziel (z. B. 10X) wechseln und suchen Sie die Zielneuron innerhalb des Gesichtsfeldes.
  4. Bewegen Sie das Licht Lieferung Lichtwellenleiter in Position mit dem folgenden Verfahren (oder gleichwertig):
    1. Über die Mikropositioniereinrichtung die Ausgangsfaser zu bewegen, bis die Spitze in der Nähe der Ziel-Neuron in der horizontalen und vertikalen Ebenen. Die vertikale Position der Faserspitze kann durch Bewegung des Objektivs auf und ab (Scannen des Fokus) überprüft werden.
    2. Wechseln Sie zurück zu dem Ziel hoher Vergrößerung und Positionierung der Spitze der optischen Faser in ihrer vorgesehenen Position neben ter Neuron (siehe Abbildung 2 Einschub). Beim Einstellen der vertikalen Position der Faser, ist es wichtig, dass der untere Rand der Faser ist (dh gerade berührt) des Deckglases ruht, zu Unsicherheiten in der Position der Faser zu minimieren. Optimale Ausrichtung in der horizontalen Ebene wird von dem Winkel θ abhängt, dass die Faser mit dem Deckglas und dem Radius der Faser r macht. Um die Faser so zu positionieren, dass das Zentrum der Zielneuron liegt entlang der Faserachse, sollte der horizontale Abstand zwischen der Oberkante der Faser und der Zielzelle
      Δ target = r (θ cosec - 2 sin θ),
      wobei negative Werte anzeigen, dass die optische Faser Überhänge die Zelle. Beim Ausrichten der Faser kann ein Abstand von Δ Ziel zwischen dem oberen Rand der Faser und dem Mittelpunkt des Neurons etwa durch visuelle Inspektion erreicht werden. Allerdings Δ Ziel ist so konzipiert,dienen als grobe Richtwerte. Positionierung der Faser, so daß der tatsächliche Abstand Δ zwischen der Oberkante der Faser und dem Mittelpunkt des Neurons meßbar unterscheidet sich von Δ Ziel (wie in 1) einen Einblick in die Wirkung von sowohl radialen Verschiebung (dh vom und zum Zentrum der beam) und axiale Verschiebung (dh entlang der Faser-Achse) des Strahls relativ zu der Ziel-Nervenzelle. Wenn Sie z. B. Δ ≈ 0 zu erwarten, dass die lokale Temperatur in der Umgebung der Zelle zu erhöhen - also seit das Strahlprofil für typische Multimode-Fasern ist gut mit einem Hut Verteilung 26, der Rückgang in lokal absorbierte Energie (Temperatur) angenähert durch Verschiebung von der Mitte des Strahls minimal ist im Vergleich zu dem Anstieg der absorbierten Energie von Bewegung der Faserenden näher an der Zelle.
      Während sollte darauf geachtet werden, um die Faser so genau und reproduzierbar zu positionieren als possible Verwendung visuelle Hinweise, präzise Messung der Faser Stelle relativ zum Zielneuron (zB Δ) ist von größerer Bedeutung als Positionierung in einem vorbestimmten Abstand. Δ bestimmt werden kann (mit einem geschätzten maximalen Unsicherheit von ± 3 um) durch Bildanalyse werden, wie in Schritt 3.8.2 des Protokolls beschrieben. In einigen Experimenten 5,8 haben weiße Lichtquellen durch die Faser gekoppelt ist, um die gewünschte Zelle zielen. Dieser Ansatz wurde festgestellt, dass in der aufrechten Mikroskopaufbau wirksam, da die Intensität von Licht, das von der Zielregion verteilt war relativ niedrig an diesen flachen Winkeln (θ).
    3. Sobald die Faser in Position ist, verschieben Sie sie durch eine bekannte Menge an einfachen Positionierung der Mikropipette aktivieren. Die Faser kann dann in die ursprüngliche Position, wenn ein neuronales Aufnahme erreicht wird zurückgegeben.
  5. Füllen Sie die Mikropipette mit intrazellulären Lösung und sicher einrastet passen auf den Köpfentage des Verstärkers (zB Multiclamp 700B, Molecular Devices). Mit Hilfe von Schläuchen, die an der Seite des Halters Mikroelektrode, eine kleine Menge eines Überdrucks zu einer Verstopfung der Mikropipette zu verhindern.
  6. Mit einem Mikromanipulator, bewegen Sie die Mikropipette in Position knapp über dem Zielneuron.
  7. Protokoll für die ganze Zelle Aufnahmen:
    1. Tragen Sie eine 10 ms, +10 mV Rechteckimpuls (z. B. Seal Test) in Voltage-Clamp-Modus des Verstärkers und stellen Sie die Mikropipette Potential (Pipette Offset) von der Baseline-Signal auf 0 nA. Die Dichtung Test sollte auch festgestellt werden, ob der Widerstand der Mikroelektrode in dem gewünschten Bereich (z. B. 2 - 6 MQ) befindet.
    2. Bei der Überwachung des Widerstandes, verwenden Feineinstellungen der Mikromanipulator leicht positionieren der Mikropipette auf die Oberfläche des Targets Neurons. Wenn die Mikropipette in Kontakt mit dem Neuron ist, wird der Widerstand zu erhöhen (von ~ 0,5 bis 1 MQ). Inmittelbar nach den Widerstand zu erhöhen, entfernen Sie den Fluidüberdruck und eine kleine Unterdruck. Ist die Beständigkeit 10 geführt - 20 MOhm, beheben das Membranpotential einer Holding-Ebene (z. B. um -60 mV).
    3. Die Elektrode Widerstand sollte weiter ansteigen, bis sie 1 G überschreitet, was bedeutet, dass eine wirksame Dichtung (genannt "Giga") zwischen der Zellmembran und Mikropipette gebildet wurde. An diesem Punkt, entfernen Sie alle Flüssigkeitsdruck aus der Pipette.
    4. Sobald die Gigaseal gebildet worden ist, verwenden Sie kurze Stromimpulse (25 bis 100 us; +1 V) oder kurze Impulse Fluidunterdruck zum Bruch der Zellmembran und erreichen Ganzzellkonfiguration.
    5. Notieren der Membran Kapazität Serienwiderstand und Eingangswiderstand ab der Exponentialkurve versehen sind, die während der aktuellen Dichtung Testimpuls bestimmt. Minimieren Sie die Kapazität durch die Anpassung der Transienten CpFast und CpSlow Steuerelemente auf dem Verstärker, dann switch der Verstärker in Ganzzell-Modus und kompensieren Kapazität und Widerstand bis zu einem flachen Strom wird während der Dichtheitsprüfung beobachtet. Bewerben Vorwiderstand Entschädigung (~ 70% Korrektur; 70% Vorhersage), die Anpassung Kapazität und Widerstand Kontrollen, um eine flache Prüfsiegel Reaktion aufrecht zu erhalten.
    6. Wechseln Sie zu Current-Clamp-Modus in den Verstärker. Beachten Sie die Ruhemembranpotenzial (in Abwesenheit der Stromeinspeisung). Stellen Sie einen Haltestrom an das Membranpotential auf dem gewünschten Niveau (zB -60 mV) zu stabilisieren. Neutralisieren Sie die Pipette Kapazität und stellen Sie die Balance Brücke, um den Spannungsabfall auszugleichen.
    7. Überprüfen Sie die Zündung Eigenschaften des Neurons durch die Stimulierung mit depolarisierenden Strom (10-200 pA in +10 pA Schritten, 300 ms Dauer).
    1. Bewegen Sie den Lichtwellenleiter zurück in Position neben dem Neuron. Mit Bildverarbeitungs-Software, die mit einer CCD-Kamera, die Aufnahmen der Position der Faser mit Bezug auf die Soll neuron, die sich auf der Ebene des Neurons zunächst und dann an der oberen Kante der optischen Faser (siehe Abbildung 1).
    2. Durch anschließende Analyse der resultierenden Bilder (z. B. Fig. 1b und 1c) ist es möglich, genau zu bestimmen, Δ (die Position des oberen Randes der optischen Faser relativ zu der Mitte des Zielneuron). Wenn Δ bekannt ist, können Parameter, wie der Abstand von der Faserendfläche der Zielneuron (entlang der Faserachse) z und der radialen Verschiebung des Neurons aus dem Zentrum des Strahls δ r unter Verwendung einfacher trigonometrischer Beziehungen werden:
      z = r sin 2θ + Δ cos θ
      δ r = ((r cos 2θ - Δ sin θ) 2 + Ay 2) 1/2,
      wobei ∂ y der Abstand zwischen der Faserachse und dem Mittelpunkt des Neurons von oben gesehen wird (zB SEe Abbildung 1).
      Analyse zu berücksichtigen Lageabweichungen von Zelle zu Zelle zu nehmen, da die genaue Kenntnis dieser Lage Parameter erforderlich, um mögliche Unterschiede zwischen Stimulation Prozesse 25 zu lösen.

4. INS Experimente

  1. Während der Aufzeichnung elektrophysiologische Daten entweder Stromzange oder Voltage-Clamp-Konfigurationen laufen die Stimulation Laser an den gewünschten Parameter (zB Leistung, Pulsdauer, Pulsfrequenz etc.). Mit Laser wird die optische Energie über einen direkten Eingang zu dem Lasertreiber gesteuert und wird manuell vor jeder Aufzeichnung spezifiziert. Pulsdauer und Pulsfrequenz kann entweder durch ein externes Signal Generators oder der Datenerfassungs-Software (wie in Schritt 2.3.4 beschrieben) gesteuert werden. Sicherstellen, dass die Daten sowohl von der Patch-Clamp-Kanal und dem Laser-Trigger-Kanal aufgezeichnet.

Laserpulse mit Längenvon etwa 500 &mgr; s bis 15 ms und Energien von ~ 0,25-5 mJ pro Impuls liefern typischerweise messbaren elektrischen Antworten. Einstellen der Wiederholungsrate der Laserpulse auf 1 Hz oder weniger sein kann für den ersten Experimenten nützlich, da sie die Wirkung dieser Parameter zu minimieren. Typische Ergebnisse, die die Änderung in dem aufgezeichneten Signal werden im folgenden Abschnitt dargestellt.

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Representative Results

Spiral Ganglionneuronen auf Laserbeleuchtung reagieren mit wiederholbaren Wellenformen sowohl Voltage-Clamp-und Strom-Clamp-Aufnahme-Konfigurationen. 3a zeigt typische Änderungen des Stromflusses durch eine Zellmembran in Antwort auf eine 2,5 ms, 0,8 mJ Laserpuls (durchschnittliche Reaktionszeit von 6 Laserpulse, bei 1 sec Intervallen) mit dem Membranpotential bei -70 mV, -60 mV und -50 mV gehalten wiederholt. Net Einwärtsströme konsequent in Reaktion auf Laserpulse hervorgerufen, Rückkehr zu Ausgangswerten nach der Beleuchtung hat aufgehört. Die Form der Laser induzierten Ströme ist zu sehen, wie das Membranpotential geändert wird variieren, was anzeigt, dass es wichtig sein kann, um Experimente in einem Bereich zu halten Potentiale durchzuführen, um ein vollständiges Verständnis der zugrunde liegenden Prozesse INS erlangen. Diese Versuche können mit geringfügigen Änderungen des derzeitigen Protokolls durchgeführt und ausgewertet werden etablierte Techniken wie Ladungs-Spannungs-(QV) Analyse (see Reference 7 Beispiele für QV-Kurven von INS in vitro).

Die Daten in Abbildung 3b dargestellt sind, welches die Veränderung des Membranpotentials der Regel von einem 2,5 ms, 0,8 mJ Laserpuls (initial Membranpotential-73mV, gemittelt über 16 Laserpulse mit einer Wiederholfrequenz von 4 Hz geliefert) hervorgerufen. Current-clamp Messungen zeigen eine stetige Depolarisation im Verlauf des Laserpulses durch eine annähernd exponentielle Abnahme Richtung Ruhemembranpotenzial nach dem Impuls gefolgt. Das Beispiel in Abbildung 3b zeigt auch eine kleine zusätzliche Membrandepolarisation nach dem Laserpuls. Shapiro et al. 7 haben gezeigt, dass Laser-induzierten Veränderungen des Membranpotentials eng mit lokalen Änderungen in der Temperatur (dh die Temperatur in unmittelbarer Umgebung der Zelle) in Zusammenhang stehen. Ferner kann das Modell von Thompson et al. 27hat festgestellt, dass unter bestimmten Bedingungen Ausrichtung, Diffusion aus axialen und radialen Temperaturgradienten im beleuchteten Bereich auf lokale Temperaturschwankungen die nahe mit den Änderungen des Membranpotentials in 3b gezeigt führen. Als Folge dieser Ergebnisse wird angenommen, dass die Position der Zielzelle relativ zu der Stirnfläche der Lichtabgabe Faser eine bedeutende Rolle bei der Bestimmung der momentanen zeitlichen Verlauf des Laser hervorgerufenen Veränderungen des Membranpotentials und der maximalen Temperatur spielt im Bereich der Zelle.

Beleuchtung mit überschüssiger Energie oder durch Einwirkung von starken Anstieg der Temperatur kann zu Schäden an der Zielneuron führen. Dies kann oft durch eine Verschlechterung der elektrischen Eigenschaften Zelle beobachtet werden (zB eine abrupte Zunahme der erforderlich ist, um das Membranpotential auf einem konstanten Niveau zu halten und / oder eine große Zunahme des Rauschens und Instabilität innerhalb des Signals). In extremen Falls Zelltod tritt fast augenblicklich auf Laser-Belichtung. Abbildung 4 zeigt eine Voltage-Clamp-Aufzeichnung der Tod eines Spiralganglienzellen Neuron durch den Kontakt mit einer 25 ms, 8 mJ Laserpuls.

Abbildung 1
Abbildung 1. Phasenkontrast-Aufnahmen zeigen eine typische Spiralganglienzellen Neuron und die relativen Positionen der optischen Faser und Mikropipette (von oben gesehen) im optischen Stimulationsexperimente. A) Typische Spiralganglienzellen Neurons. B) der optischen Faser in Position (Bild auf der Oberseite konzentriert Rand der optischen Faser) c) überlagerte Bilder, welche die Faser relativ zu der Zelle (Anmerkung:. die Oberkante der Faser leicht überhängenden die Zelle dh Δ negativ ist). Von oben, δ y und & Del gesehenta, sind die radiale Verschiebung des Neurons entfernt von der Faserachse und der Abstand von der Oberkante der Faser zu dem Zentrum des Neurons sind. Die Pfeile zeigen die Position des Spiralganglions Neurons. Maßstab Bars 20 um.

Abbildung 2
Abbildung 2. Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus für die optische Stimulation Experimente (nicht maßstabsgetreu) Einschub:. Stellung der optischen Faser und Mikroelektroden in Bezug auf die Zielzelle. θ, Δ und z wie in Protokoll 3.4.2 und 3.8.2 Schritte definiert.

Abbildung 3
Abbildung 3. A) Voltage-Clamp (durchschnittliche Reaktionszeit von 6 Laserpulsen deliverot mit einer Rate von 1 Hz) und b) Strom-Klemme (durchschnittliche Antwortzeit von 16 Laserpulse mit einer Rate von 4 Hz wiederholt) Aufnahmen von Spiralganglienzellen Neuronen zeigt Laser-induzierte Veränderungen in der Membran Strom und Membranpotential bei Beleuchtung durch eine 2,5 ms 0,8 mJ Laserpuls. Schattierten Bereiche zeigen die zeitliche Einteilung der Laserbelichtung. Einschübe zeigen Reaktionen während Laserbeleuchtung näher. Hinweis: Der Einsatz in einem) konzentriert sich auf die Spur mit einem Membranpotential von -60 mV erhalten. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Fig. 4
Abbildung 4. Voltage-Clamp-Aufzeichnung zeigt Zelltod durch den Kontakt mit einer übermäßig energische (25 ms, 8 mJ) Laserpuls. Beachten Sie, dass die Amplitudedas Signal wird in nA gezeigt und ist wesentlich größer als die pA Ströme in Abbildung 3 dargestellt.

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Discussion

Mit den Protokollen vorliegenden Ausführungen ist es möglich, zu extrahieren und Kultur Spiralganglienzellen Neuronen und Laser-evozierte elektrische Aktivität durch Ausführen Ganzzell Patch-Clamp-Experimenten untersucht. Bei in vitro verwendet werden, bietet der Patch-Clamp-Verfahren eine Stufe der Kontrolle über die experimentellen Parameter, die nicht in vivo zu erreichen ist. Laser Stimulationsparameter wie Wellenlänge, Pulsenergie, Pulslänge, Pulsform und Impulsfolgefrequenz Sequenzen können in eine reproduzierbare Einstellung untersucht werden. Darüber hinaus kann die Umgebung, in der die Neuronen erhalten (zB Lösungstemperatur, chemische Faktoren) systematisch variiert werden, was es ermöglicht, die Membran Eigenschaften zu untersuchen und somit die Mechanismen der Infrarot neuralen Stimulation. Die Wechselwirkung zwischen den elektrischen und optischen Stimulation Modalitäten können auch in einer kontrollierten Art und Weise untersucht. Diese grundlegenden Studien kann weiter vorangetrieben werden durch die Einführung von fluorescent Sonden zur Überwachung zusätzliche Parameter wie ionische Konzentrationen oder die Expression von Hitzeschock-Proteinen. Ein klares Verständnis dieser verschiedenen Parameter ist nicht nur entscheidend für ein vollständiges Verständnis des Phänomens zu erreichen, sondern auch eine effizientere Stimulation durch Prozessoptimierung zu erreichen.

Aufgrund der wichtigen Rolle, die Temperatur in den Mechanismus der INS gespielt 5-7, ist eine genaue Messung der lokalen Erwärmung durch Laserbeleuchtung von größter Bedeutung bei der Definition dieser Mechanismus 27. Eine genaue Methode zur Gewinnung von kalibrierten Temperaturmessungen durch Aufzeichnung des Stroms, der durch einen offenen Patch-Pipette wurde von Yao et al. 28 und eingesetzt von zahlreichen Autoren, um die Größe und Zeitverlauf der laserinduzierten Temperaturänderungen in Umgebungen repräsentativ für die Bestimmung gefunden in vitro (siehe zB Referenzen 7, 8). Bietend die Position der Lichtabgabe Faser genau bestimmt werden können (zB über die aktuelle Protokoll), ist diese Methode der Temperaturmessung wahrscheinlich exakte Abbildung der lokalen Temperaturänderung durch typische INS Impulse aktivieren.

Die Wellenlänge des anregenden Laser ist ein Parameter, der in INS Experimente in Betracht gezogen werden, da die laserinduzierte Temperaturänderungen (und somit die zugrundeliegenden Mechanismen der INS) durch die wellenlängenabhängige Absorption Eigenschaften von Wasser 7 vermittelt (siehe Thompson et al. 25 für eine ausführliche Diskussion der erwarteten Wellenlänge Effekte). Abgesehen von dem 1.870-nm-Diodenlaser in diesem Protokoll (Infrared Nervenstimulator Optotech P / L), eine Vielzahl von Wellenlängen und Laser-Paketen verwendet wurden von anderen Autoren verwendet. Einige typische Beispiele der Laser in bestehende INS Publikationen verwendet werden, sind: Diodenlaser von Aculight mit Wellenlängen im Bereich von 1,840-1,940 nm 6,7,10,13,16-18; Holmium: YAG-Laser (2,12 um) von Laser 1-2-3 6,11,12,14,15 und Diodenlaser, die bei 1.875 nm 5,8, 1.470 nm 8 und 1.535 nm 8 von Sheaumann Laser.

Ein möglicher Nachteil der Anwendung dieser Technik kultivierten Neuronen des Ganglion spirale, dass aufgrund der relativ kleinen Größe der Neuronen (~ 10-15 Mikrometer Durchmesser) wird der Aufnahme-Elektrode direkt durch den Laser beleuchtet wird. Es wurde vorgeschlagen, dass Laser-Beleuchtung ab einer bestimmten Schwelle kann die Eigenschaften des Aufnahme-Schaltung 7 (dh Dichtung und Pipette Widerstand) ändern. Shapiro et al. 7 gemessen diesen Schwellenwert durch Überwachung der Änderung in Umkehrpotential von QV Kurven Laserleistung erhöht wurde, finden eine Schwelle Pulsenergie von 3 mJ. Als Alternative kann es möglich sein, das Ausmaß dieses Effekts durch Messen der kombinierte Widerstand der Dichtung und Pipette w bestimmenLoch-Zellen-Modus (zB durch Aufnahme des aktuellen Antwort auf einen 10 ms, +10 mV Spannungsimpuls) unter Veränderung der Temperatur der extrazellulären Lösung. Um das Verständnis der Mechanismen des INS, ist es wichtig, dass Laser-induzierte Resistenz Veränderungen gemessen und berücksichtigt werden.

Um die Mehrheit der experimentellen Arbeit über Infrarot neuronale Stimulation in vivo vorgenommen worden Laufenden. Während berichtet Bestrahlung Schwellenwerte für Infrarot-Stimulation in vivo etwas variieren (zB 0,32 Jcm -2 bei 2.12 um für Ratten Ischiasnerven 1, <0,1 Jcm -2 bei 1.855 um für Wüstenrennmaus Hörnerven 18), sie sind deutlich niedriger als Schwellenwerte bestimmt durch In-vitro-Studien (z. B. etwa 20 Jcm -2 bei 1.875 um für Maus retinalen Ganglienzellen und Ratte vestibulären Ganglienzellen 5,8, 8,3 J cm -2 für Ratten Neugeborenen Kardiomyopathiezyten 9). Zu diesem Zeitpunkt die Details der INS-Prozess nicht ausreichend gut verstanden, über die Ursache dieser Differenz zu spekulieren, aber Verwendung von in vitro-Modellen wie auditorischen Neuronen, ähneln die Ziele der vorherigen in vivo Arbeit kann bei der Suche nach einer Erklärung vorteilhaft .

Einige andere in vitro-Modelle umfassen größere Zellen, wie Xenopus Oocyten (~ 1 mm Durchmesser) von Shapiro et al. 7 Dies kann nützlich sein, zum Sondieren räumliche Schwankungen in der Wirksamkeit des INS in einzelnen Zellen, um zu untersuchen, ob zellulären Komponenten beeinflusst werden nach Stimulation. Einfachere Modelle wie Lipid-Doppelschicht Vesikel können noch genauere Kontrolle über experimentelle Parameter als in-vitro-Experimenten zu ermöglichen, sind jedoch solche Modelle etwas in ihrem Umfang begrenzt und darf nicht offenbaren die ganze Komplexität des INS.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vom Australian Research Council unter Linkage Projektstipendium LP120100264 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture materials and equipment
Glass coverslips Lomb Scientific CSC 10 1 GP
4-ring cell culture dish VWR International 82050-542
Poly-L-ornithine solution Sigma-Aldrich P4957
Laminin Invitrogen 23017-015
Curved forceps WPI 14101 Dumont #5 tweezers (45° angle tip)
CO2 Incubator ThermoScientific Heracell 150i
Table 1. Cell culture materials and equipment.
Neurobasal media
Neurobasal A Gibco 10888-022
N-2 supplement Invitrogen 17502-048
B27 serum-free supplement Invitrogen 17504-044
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-148
L-Glutamine Invitrogen 25030-149
Intracellular solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich G4500
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Na2ATP Sigma-Aldrich A2383
MgATP Sigma-Aldrich A9187
NaGTP Sigma-Aldrich G8877
Potassium hydroxide LabServ BSPPL738.500
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Extracellular solution
Sodium chloride Sigma-Aldrich 310166
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Calcium chloride Sigma-Aldrich 383147
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Sodium hydroxide LabServ BSPSL740.500
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution.
Upright microscope Zeiss AxioExaminerD1 Equipped with Dodt contrast
Water-immersion objective Zeiss W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75
Platform and X-Y stage ThorLabs Burleigh Gibraltar
Recording chamber Warner Instruments RC-26G
Vibration isolation table TMC Micro-g 63-532
CCD Camera Diagnostic Instruments RT1200
Camera software Diagnostic Instruments SPOT Basic
In-line solution heater Warner SH-27B
Temperature controller Warner TC-324B
Patch clamp amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Patch clamp data acquisition system Molecular Devices Digidata 1440A
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Micropipette glass Sutter Instruments GBF100-58-15 Borosilicate glass with filament
Micropipette Puller Sutter Instruments P2000
Recording Software AxoGraph Lab pack and electrophysiology tools
Aspirator bottle Sigma-Aldrich CLS12201L 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing
PE Tubing Harvard PolyE #340
Masterflex peristaltic pump Cole-Parmer HV-07554-85
Table 3.Patch clamp equipment.
1,870 nm laser diode Optotech
200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA
Optical fiber through connector (FC/PC) Thorlabs ADAFC2
Optical fiber cleaver EREM FO1
Optical fiber stripping tool (0.25 - 0.6 mm) Siemens For removing optical fiber jacket
Optical fiber stripping tool (0.6 - 1.0 mm) Siemens For removing outer coating of patch cord
Signal generator Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered
Optical fiber positioner Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments
Optical fiber chuck Newport FPH-DJ
Laser power meter and detector head Coherent FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head)
Table 4. Laser equipment.

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References

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