Live cell imaging van Vroege Autophagy Evenementen: Omegasomes en Beyond

1Signalling Programme, The Babraham Institute, 2MRC Group, Cardiff School of Biosciences, Cardiff University
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Time-lapse microscopie van fluorescent gelabelde autofagie markers zorgt voor de opvolging van de dynamische autofagie respons met een hoge temporele resolutie. Met specifieke autofagie en organel markers in een combinatie van 3 verschillende kleuren, kunnen we de bijdrage van een eiwit autophagosome vorming in een robuuste ruimtelijke en temporele context volgen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond. J. Vis. Exp. (77), e50484, doi:10.3791/50484 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Autofagie cellulaire respons veroorzaakt door het gebrek aan voedingsstoffen, in het bijzonder de afwezigheid van aminozuren. Autophagy wordt bepaald door de vorming van een dubbele membraan structuren genaamd autophagosomes dat cytoplasma, langlevende eiwitten en eiwitcomplexen, defecte organellen, en zelfs virussen of bacteriën sekwestreren. Autofagosomen uiteindelijk fuseren met lysosomen leidt tot bulk degradatie van de inhoud, met de geproduceerde voedingsstoffen worden teruggevoerd naar het cytoplasma. Daarom autofagie is cruciaal voor cel homeostase, en ontregeling van autofagie kan leiden tot ziekte, met name neurodegeneratie, veroudering en kanker.

Autophagosome formatie is een uitgebreid proces, waarbij cellen van een bepaalde groep eiwitten, de zogenaamde kern autophagy machines toegewezen. De kern autofagie machines wordt functioneel aangevuld met extra eiwitten betrokken bij diverse cellulaire processen, bijvoorbeeld in membrane mensenhandel, in het mitochondriaal en lysosomale biologie. Coördinatie van deze eiwitten voor de vorming en afbraak van autofagosomen vormt de zeer dynamische en verfijnde respons van autofagie. Live cell imaging maakt het mogelijk om de moleculaire bijdrage van elke autofagie-gerelateerd eiwit volgen tot op het niveau van een enkele autophagosome formatie evenement en in real-time, dus deze techniek biedt een hoge temporele en ruimtelijke resolutie.

Hier gebruiken we een cellijn stabiel tot expressie GFP-DFCP1, een ruimtelijke en temporele context voor onze analyse vast te stellen. DFCP1 merken omegasomes, die voorloper structuren die leiden tot autofagosomen vorming zijn. Een eiwit van interesse (POI) kan worden gemarkeerd met een rood of cyaan fluorescente label. Verschillende organellen, zoals het ER, mitochondria en lysosomen, zijn allemaal betrokken bij verschillende stappen van autophagosome vorming en kan worden gekleurd met een specifiek tracker kleurstof. Time-lapse microscopie van AutopHagy in deze experimentele opstelling, waarmee informatie kan worden afgeleid omtrent de vierde dimensie, dat wil zeggen de tijd. Dus kunnen we de bijdrage van de POI te autofagie in ruimte en tijd te volgen.

Introduction

Autofagie is een zeer dynamisch proces, waarbij de coördinatie van een groot aantal eiwitten voor het uiteindelijke resultaat van autophagosome formatie 1-3 vereist. Microscopie is waarschijnlijk de meest toegepaste techniek voor het bestuderen van autofagie 4. De lokalisatie van de meeste autophagy eiwitten is uitgebreid bestudeerd in gefixeerde cellen, zowel immuno-kleuring de endogene eiwitten en door expressie van fluorescent gelabeld exogeen eiwit. Bovendien heeft Elektronenmicroscopie (EM), alleen en in combinatie met immuno-goud labeling, beschreef de fijne details van deze structuren 5,6. Hoewel deze technieken ons begrip van autophagosome formatie in de 3 dimensies van ruimte hebben vastgesteld, hebben zij niet voldoende informatie over de 4e dimensie te geven - time. Live cell imaging overwint deze barrière moet het mogelijk worden na de vorming van een autophagosome zo dicht mogeble om real-time 7. Deze techniek werd voor het eerst gebruikt om autofagie studeren door Yoshimori en collega 8, en in toenemende mate voortaan gebruikt.

Time-lapse microscopie vangt de lokalisatie van de POI in levende cellen en over een periode van tijd. Door deze informatie te vergelijken met een goed gekarakteriseerd autofagie en / of organel marker, kan live cell imaging analyse de POI zetten in de grotere ruimtelijke en temporele context van autophagosome formatie. Live cell imaging analyse zijn de repetitieve vastleggen van de POI lokalisatie langs alle stappen autophagosome vorming, terwijl beeldvorming van gefixeerde cellen is gebaseerd op een opname. Daarom kan live cell imaging van de bijdrage van de POI op specifieke stappen van autophagosome vorming te bewijzen, terwijl de beeldvorming van vaste cellen alleen de rol van de NP, op basis van haar gemiddelde lokalisatie in vele autofagosomen tegelijk gevangen in verschillende stadia van hun lifecy kunnen aannemencle.

Hoewel live cell imaging is een methode van hoog analytisch vermogen, het heeft een aantal inherente beperkingen, die in aanmerking moeten worden genomen. Allereerst live cell imaging vereist de expressie van een of meer exogene fluorescent gelabelde eiwitten. Fluorescentielabels neiging groot in omvang zijn en ze soms gevolgen voor de werking van een eiwit door sterische redenen. Deze situatie wordt geaccentueerd voor membraaneiwitten, omdat deze de functie in de beperkte ruimte van de 2 dimensies van membranen. Opmerkelijk, autophagosomes zijn vliezige structuren en derhalve hun vorming vereist een groot aantal membraan-geassocieerde eiwitten.

Een andere reeks problemen verbonden met het expressieniveau van de POI. In principe moet een exogeen proteïne expressie op niveaus vergelijkbaar met de endogene proteïne. Dit zorgt ervoor dat belangrijke regulatoren van de sub-cellulaire lokalisatie niet worden verzadigd, en the analyse biologisch relevant. Bovendien moet overexpressie van autofagie eiwitten worden vermeden, wanneer daarbij de endogene niveaus worden uitgedrukt, zij meestal autophagy reactie 9 remmen. Omgekeerd, omdat de expressieniveaus van de NP moet hoog genoeg zijn om na de lokalisatie voor een goede tijd toe te laten zonder fotoblekingsreactie zijn, een compromis worden bereikt. Het bereiken van de optimale expressie van een exogeen eiwit in zoogdieren cellen vergt veel afstemming, maar het is haalbaar door de oprichting en het screenen van cellijnen stabiel tot expressie verschillende niveaus van de POI.

De ruimtelijke resolutie die met conventionele fluorescentiemicroscopie kan worden bereikt, is een beperkende factor. Resolutie is afhankelijk van een aantal redenen, maar hoogstens zal laterale resolutie rond 250 nm. Dit betekent dat alle objecten op een afstand kleiner dan verschijnt dit verbonden (of als eenobject) en objecten kleiner dan 250 nm zal in het beeld groter dan ze in werkelijkheid zijn vertegenwoordigd. Daarom afbeeldingen moet altijd worden geïnterpreteerd met dit in gedachten en complementaire technieken zoals EM vereist zal zijn om fijne ultra-structurele detail te lossen.

Tenslotte live cell imaging inherent vereist blootstellen van een cel aan licht, mogelijk gedurende een langere tijdsperiode. Dit kan de fysiologische reacties van een cel, een verschijnsel bekend als foto-toxiciteit veranderen.

We hebben met succes gebruik live cell imaging van de PI3P-bindende eiwit DFCP1 te beschrijven voor het eerst dat autofagosomen afkomstig zijn van PI3P-rijk ring-achtige structuren genoemd omegasomes, die in nauwe samenwerking met ER strengen 10,11. We hebben duidelijk aangetoond dat LC3-positieve structuren te starten waarbij in nauwe samenwerking met omegasomes. Wij hier suggereren dat het gebruik van een cellijn stabiel tot expressie GFP-DFCP1 voor de levende celbeeldvorming van het eiwit van belang, wordt een robuuste ruimtelijke en temporele frame voor de karakterisering van zijn rol in autophagosome formatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell Preparation

  1. Zaad lage passage aantal HEK-293T-cellen stabiel tot expressie GFP-DFCP1 op 22 mm ronde dekglaasjes; cultuur cellen overnacht in Dulbecco Modified Eagles's medium (DMEM), tot een confluentie van 30-40% (streven naar een confluentie van 80% na 2 dagen - dag van live cell imaging).

2. Cell Transfectie

  1. Bereid de transfectie complexe mix voor elke plaat, met 100 ul OptiMEM verminderde ik serummedium, 3 pi X-tremeGENE 9 DNA transfectiereagens, en 0,5 ug pECFP-LC3 plasmide DNA. Meng voorzichtig door en neer te pipetteren en incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur. [Opmerking: we hebben herhaaldelijk gevonden dat andere transfectie reagentia, zoals Lipofectamine 2000, hebben veel toxiciteit, en bovendien, ze produceren fluorescerende deeltjes op hun eigen die interfereren met vele microscopietechnieken.]
  2. Zuig het medium van de platen door vers DMEM voorverwarmd bij 37 ° C.
  3. Voeg de transfection complex aan cellen door pipetteren, incubeer cellen gedurende 24 uur.

3. Cel Incubatie met de Organelle Marker (optioneel)

  1. Voeg Mitotracker / Lysotracker naar DMEM bij een uiteindelijke concentratie van 75 nM, en op ijs bewaren in een Falcon buis met aluminium folie, langs de gehele experimentele dag, blootstelling aan licht en herhaald invriezen en ontdooien cycli voorkomen.
  2. Verwijder een monster van 2 ml van de Mitotracker / Lysotracker-bevattend medium en opwarmen bij 37 ° C; aspireren medium van getransfecteerde cellen en vervangen door Mitotracker / Lysotracker-bevattend medium en incubeer cellen gedurende 30 - 60 minuten.

4. Voorbereiding van incubatiekamer voor live cell imaging (figuur 1)

  1. Schoon metaal en kunststof O-ring met 75% ethanol en breng siliconenvet op de rand van de metalen O-ring.
  2. Behulp van een tang verwijder het dekglaasje van de plaat en droog de overmaat medium uit de onderzijde van het dekglaasje,om te voorkomen dat het mengen te veel medium met het vet, omdat dit de kans op lekkage te verhogen.
  3. Laat het dekglaasje te rusten op de rand van de plastic O-ring en past de metalen O-ring boven het plastic O-ring, met het dekglaasje ingeklemd tussen, om een ​​gesloten kamer te creëren.
  4. Bijvullen kamer met het medium van de plaat; vanaf dit punt en op, vermijd langdurige incubatie van de cellen in DMEM medium zonder buffermiddel, om veranderingen in de pH te voorkomen te voorkomen, zoals het bicarbonaat buffersysteem van DMEM vereist kunstmatige CO 2-concentratie van 5-10% en de CO2 concentratie van de lucht veel lager.

5. Verhongering van Cellen

  1. Zet de incubatiekamer op de microscoop podium.
  2. Zuig het compleet medium en wassen met 2 ml van de honger medium 3 keer, om ervoor te zorgen dat er geen aminozuren zijn gebleven uit de DMEM, die uiteindelijk de autofagie reactie zal remmen, stellen detimer ON.

6. Microscopie

  1. Een passend beeldvormingssysteem geconfigureerd voor levende cellen wide-field epi-fluorescentie wordt vereist. Deze omvat gewoonlijk een onderzoeks-grade omgekeerde microscoop frame, een intense breed-spectrum lichtbron, spiegels en filters specifiek voor het fluorescente proteïne (s) / kleurstof (fen) plaats, een hoge kwaliteit objectieflens, een gevoelige CCD / scmos camera en een incubatiekamer. Alle grote microscoop fabrikanten bieden volledige groothoek-systemen geschikt voor live-cell imaging, maar het is ook mogelijk om naar huis te bouwen van een systeem met behulp van onderdelen van verschillende fabrikanten en de controle met behulp van open source software, zoals Micro-Manager ( http: / / valelab.ucsf.edu / ~ MM / MMwiki / ). Het belangrijkste aspect naar onze mening is een systeem van hoge gevoeligheid gebruiken, zodat expressie van de fluorescente reporters een minimum kunnen worden beperkt.
  2. Selecterende de juiste cellen om imago.
    1. Kies grote en platte cellen die het mogelijk meer autophagosome vorming gebeurtenissen vast te leggen. Ook kiezen voor cellen die al zijn begonnen met het produceren van een groter aantal omegasomes.
    2. Start de video-opname na 30 minuten of tot ver in autofagie respons, met het oog op een grotere verhouding van autophagosome vorming gebeurtenissen per video vast te leggen.
  3. Imaging.
    1. Gebruik een hoge vergroting lens (100x 1.4 NA).
    2. Stel de intensiteit van excitatie licht om 10-20% van de maximale te voorkomen fotoblekingsreactie.
    3. Stel de camera (Hamamatsu ORCA ER, pixelgrootte 6,45 pm) waardoor 100-500 msec blootstelling, 2x2 binning en 100 gewin.
    4. Stel het beeld overname tarief voor 1 beeld elke 10 sec.

7. Het creëren van Montages van autophagosome Vorming Evenementen met ImageJ

[Dit kan een niet-systematische wijze worden gedaan door simpelweg scannen van de samengevoegde Video eventilatieopeningen van belang, maar het kan ook gesystematiseerd worden zoals hieronder beschreven.]

  1. Open image stacks voor de 3 (of 2) gevangen kanalen in ImageJ / Fiji.
  2. Solliciteer groen, rood en blauw LUT (Lookup Tables) aan het corresponderende kanaal; fuseren 3 kleuren en op te slaan.
  3. Vanuit het tabblad Analyseren, selecteert u Extra> ROI manager ... > Geef aan, selecteer vervolgens een willekeurig gebied van gedefinieerde grootte in het eerste beeld van de stapel.
  4. Vanuit het tabblad, selecteert dupliceren om het geselecteerde gebied van de stack dupliceren.
  5. Vanuit het tabblad Beeld, selecteert u Stapels> Make montering ... om een ​​voorlopige montage met daarin maken alle frames gevangen. Scan alle frames in de montage voor een compleet autophagosome formatie gebeurtenis; houden noten van het eerste en het laatste frame van het evenement.
  6. Vanuit het tabblad Analyseren, selecteert u Extra> ROI manager ... selecteert u hetzelfde gebied in het eerste beeld van de stack voor de andere 2 kleuren, alsmede voor het imago samengevoegde kleuren en dubbele stacks.
  7. Van tHij tabblad Bestand, kies Nieuw> Afbeelding, en stel voor breedte volgens het aantal initieel geselecteerde pixels met de ROI manager, die voor hoogte 4 maal de in de ROI manager hoogte plus 3 pixels voor de ruimte in tussen de 3 kleuren en het samengevoegd, en stel Slices als het aantal frames in elke stapel.
  8. Vanuit het tabblad Beeld, selecteert u Stapels> Extra> Invoegen ... en steek elke sub-stack op een top van een ander, waardoor ruimte van 1 pixel in tussen.
  9. Vanuit het tabblad Beeld, selecteert u Stapels> Make montering ... het creëren van een montage beginnen en eindigen met de eerste en laatste frame van de autophagosome formatie evenement gevangen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Beschreven in het protocol, hebben we gebruikt time-lapse microscopie om de lokalisatie van de GVB-gelabeld LC3 in een cellijn te volgen stabiel tot expressie GFP-gelabelde DFCP1, onder autofagie inducerende omstandigheden. De uitkomst van dit experiment is de vangst van 2 series of stapels van beelden, een van de groene en een uit het blauwe kanaal, dat overeenkomt met GFP-DFCP1 en CFP-LC3. We hebben verder geanalyseerd deze video's met ImageJ, om montages overeenkomt met enkele autophagosome vorming gebeurtenissen, zoals beschreven in de sectie-protocol. Deze analyse liet ons toe om te bewijzen dat een LC3-positieve autophagosome afkomstig is van een DFCP1-positieve omegasome. In de montage is getoond in figuur 2, de vorming van een omegasome blijkt uit het tweede frame, in de vorm van een kleine plek. De omegasome begint breiden teneinde de karakteristieke ring-structuur vormen, en bereikt zijn maximale diameter na 6 minuten. Vervolgens, de omegasome begint collapsing en uiteindelijk verdwijnt, na ongeveer 10 minuten. Aanbrengen nu de vorming van de LC3-positieve structuur of autophagosome in de context van de omegasome formatie, zien we dat de autophagosome verschijnt na de omegasome en duidelijk zichtbaar na ongeveer 1,5 minuten. De autophagosome begint uit te breiden in nauwe samenwerking met de omegasome, eerste plek en dan bellen, en toen de omegasome begint instortende de autophagosome toppen af. Uiteindelijk de autophagosome blijft achter, blijkbaar te fuseren met de lysosomen, na de omegasome verdwijnt. Deze analyse geeft een duidelijke indicatie over de functionele relatie tussen de 2 structuren, volgens welke LC3 positieve autofagosomen afkomstig zijn van overeenkomstige omegasomes.

In een ander voorbeeld, hebben we een lysosoom tracker toegevoegd om de ruimtelijke en temporele organisatie van de vormende autophagosome met lysosomen (figuur 3 vangen

Echter, dezelfde soort analyse te interpreteerbare resultaten vanwege een verscheidenheid van redenen. In het weergegeven voorbeeld in figuur 4, worden de resultaten interpreteerbaar door een drift in focus. Video begint met succes het vastleggen van de vorming van een autophagosome echter een drift in beeld optreedt na de 3 min teken. De video-opname gaat van de aandacht voor de volgende 6 min, maar uiteindelijk wordt de scherpstelling handmatig te corrigeren na de 9 tot 10 min mark. Deze analyse echter onmogelijk maakt om te discrimineren of de autophagosome vorming gebeurtenis vastgelegd wanneer de focus wordt gecorrigeerd is hetinitiële gebeurtenis die bijna voltooid is, of een nieuwe die is begonnen na de drift in focus.

Bijkomende problemen kunnen worden toegeschreven aan de confluentie van de gekweekte cellen. Bijvoorbeeld, wanneer de cellen worden gekweekt bij hoger dan optimaal confluentie, zijn ze gedwongen te breiden bovenop een aangrenzende cel, waardoor de nadruk zeer uitdagend. Bovendien cellen die worden gekweekt bij hoge confluentie hebben de neiging om worden benadrukt, het verhogen van het niveau van de achtergrond autofagie activiteit vóór de inleiding van de honger.

Tot slot, fluorescentie-gerelateerde zaken zijn vrij algemeen. GVB heeft zwakkere fluorescentie activiteit vergeleken met GFP, en vaak krijgt foto-gebleekt in latere stadia van de video-capturing. Analyse van dergelijke video's kan leiden tot vals negatieve conclusies over de ruimtelijke associatie van de NP met vormende autofagosomen. Echter, kunnen deze problemen worden overwonnen door een van de varianten zoals mTurquise2. Een andere veel voorkomende fenomenologischn komt voort uit het feit dat de fluorescentie van rode markeringen niet gedoofd bij de lagere pH van lysosomen. Veel eiwitten autofagie fysiologisch afwerking van hun levenscyclus in de lysosomen, terwijl autofagosomen uiteindelijk fuseren met lysosomen. Bovendien worden niet-functionele eiwitten vaak gericht voor afbraak in lysosomen. Daarom zou men uiteindelijk na de niet-gerelateerde associatie van autofagosomen met lysosomen, in plaats van een fysieke associatie tussen een rood-gelabeld POI en omegasomes.

Figuur 1
Figuur 1. Incubatie kamer. Het plastic O-ring past om de rand van de metalen O-ring en heeft onderaan een dunne rand die naar binnen uitstrekt. Het dekglaasje wordt op de rand van de plastic O-ring, en vervolgens de plastic O-ring is aangebracht op de bodem van de metalen O-ring. Op deze manier, het dekglaasje is zandwiched tussen de 2 O-ringen, waardoor een gesloten kamer.

Figuur 2
Figuur 2. Cellen die GFP-DFCP1 en CFP-LC3 werden uitgehongerd voor 30 min en afgebeeld met een snelheid van 1 beeld elke 10 sec. Een montage van een representatief autophagosome formatie evenement wordt gepresenteerd. Signalen van groene en blauwe kanalen zijn pseudo-groen gekleurd en rood navenant. Pijlen geven de eerste waarneembare omegasome en autophagosome. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 3
Figuur 3. Cellen die GFP-DFCP1 en CFP-LC3, werden geïncubeerd met Lysotracker rood, uitgehongerd voor 30 min en afgebeeld met een snelheid van 1 beeld elke 15 sec. Een montage van een representatief autophagosome formatie evenement wordt gepresenteerd. Signalen van groene, rode en blauwe kanalen zijn pseudo-groen gekleurd, blauw en rood navenant. Pijlen geven de eerste waarneembare omegasome en autophagosome. Pijlpunt geeft de eerste vangst van autophagosome fusie met het lysosoom. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 4
Figuur 4. Cellen die GFP-DFCP1 en CFP-LC3 werden uitgehongerd voor 30 min en afgebeeld met een snelheid van 1 beeld elke 10 sec. Een montage van een voorbeeld van sub-o ptimal capture wordt gepresenteerd. Signalen van groene en blauwe kanalen zijn pseudo-groen gekleurd en rood navenant. Pijlen geven de eerste waarneembare omegasome en autophagosome. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Video 1. Video van de autophagosome formatie gebeurtenis weergegeven in Figuur 2. De afspeelsnelheid is 4 frames per seconde. Klik hier om de film te bekijken .

Video 2. Video van de autophagosome formatie gebeurtenis weergegeven in Figuur 3. De pijl geeft de eerste plaats de vorming van de omegasome en anderzijds de fusie van de autophagosome de lysosoom. De afspeelsnelheid is 4 frames per seconde."> Klik hier om de film te bekijken.

Video 3. Video van de autophagosome formatie evenement voorgesteld in Figuur 4. De afspeelsnelheid is 4 frames per seconde. Klik hier om de film te bekijken .

Tabel 1. Lijst van specifieke reagentia en uitrusting voor het protocol, samen met het corresponderende provider en catalogusnummer.

BUFFERS

Buffer Samenstelling Stap Gebruikt
Uitputtingsmedium 20 mM HEPES pH 7,4 5.2
140 mM NaCl
1 mM CaCl2
1 mM MgCl2
5 mM glucose
1% BSA

Tabel 2. Lijst van buffers die in dit protocol. De buffers, de samenstelling en de eerste stap waarin ze worden gebruikt in het protocol zijn opgenomen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De methode beschreven in dit protocol kan de visualisatie van de lokalisatie van een eiwit tijdens autophagosome formatie. We hebben geprobeerd verschillende methoden van het visualiseren van de gebeurtenissen beschreven, waaronder point-scanning confocale, spinning disk confocale en Total Internal Reflection Fluorescentie (TIRF) microscopie. Wij hebben geconstateerd dat voor algemene doeleinden standaard wide-field epi-fluorescentie biedt het beste compromis tussen gevoeligheid en resolutie. Dit zorgt voor een goede signaal-ruis, minimale photo-bleaching/photo-toxicity en snelle acquisitie. Het gebrek aan optische sectie geen probleem eventueel gebieden van de cel gekozen beeld di de omtrek waar de cel verspreiden en vlak. Het is echter belangrijk dat het beeldvormingssysteem gebruikt geschikt is geconfigureerd (zowel wat betreft de gebruikte hardware en systeeminstellingen).

Voor de beste ruimtelijke resolutie, is het raadzaam om een ​​hoge vergrotingsfactor, h gebruikenoge numerieke opening olie immersie lens (onderdompeling in water lenzen zullen geen voordeel beeldvorming in de nabijheid van het dekglaasje te bieden). Er wordt voorgesteld om de intensiteit van de verlichting (bijv. met grijsfilters), de camera-instellingen (belichtingstijd, binning en winst) evenwicht op de signaal-ruis te maximaliseren en minimaliseren bleken. Dit zal moeten empirisch worden gedaan, maar als leidraad, bij gebruik van een 100x 1.4 NA lens we meestal verminderen de kracht van onze excitatie licht om 10-20% van de maximale en zet de camera (Hamamatsu ORCA ER, pixelgrootte 6,45 pm) tot 100-500 msec blootstelling, 2x2 binning en 100 gewin.

Het beeld overname dient te worden ingesteld in het bereik van 1 beeld elke 1-10 sec. Het verwerven van beelden in een hogere framerates zal zorgen voor een betere continuïteit tussen afbeeldingen (betere temporele resolutie), maar zal cellen bloot aan meer licht en dus verhoging photo-bleaching/photo-toxicity.

Als de beeldvorming meer fluorescence-kanalen, moet worden gezorgd dat de vertraging tussen kanaal capture wordt geminimaliseerd (verminderen belichtingstijd, fit snel filterwisselaars). Dit zal de kans op beweging artefacten te zien zijn in de samengestelde afbeelding verkleinen. Als bewegingsartefacten blijken moeilijk te vermijden overwegen om een ​​afbeelding splitter (een apparaat om de gelijktijdige aankoop van twee fluorescentie kanalen met behulp van een camera te vergemakkelijken) of een dubbele camera-adapter.

Imaging blauwe kanaal vereist de selectie van geschikte filters en spiegels om cross-emissie van de blauwe fluorescentie te voorkomen voor het groene kanaal. We hebben met succes gebruik gemaakt van een Olympus CellR microscoop, die gebruik maakt van de Till Polychrome V verlichter, waardoor specifieke selectie van de golflengte, bandbreedte en intensiteit en dus is zeer flexibel. De lichtbron 'lekkende' met enkele witte licht dat door naast de geselecteerde wavelengths.For Wij hebben daarom voorzien (multi) bandpass excitatiefilters in dekubussen, zodat er extra filtering van het excitatielicht. De volgende combinatie van spiegels / filters werd gebruikt (alle Semrock). Voor GFP & mCherry: Exciter FF01-479-585, Emitter FF02-525/40 (GFP) en FF01-607/36 (mCherry), Dichroic Mirror FF505/606-Di01. Voor GVB: Exciter FF01-416/501, Emitter FF01-523/610, Dichroic Mirror FF440/520-Di01. We hebben ook gebruik gemaakt van een andere CellR microscoop, die suboptimale resultaten heeft gegeven, met cross-emissie van de blauwe fluorescentie voor het groene kanaal. Deze microscoop maakt gebruik van een witte lichtbron en heeft een snelle filter wiel om de excitatie wavelengths.This betekent dat de selectie van de golflengte is beperkt tot de 8 filters in het wiel, maar er is een apart wiel om intensiteit te regelen. De volgende combinatie van spiegels / filters werd gebruikt. Voor GFP (Semrock): Exciter FF01-470/40, Emitter FF02-525/50, Dichroic Mirror FF495-DI02. Voor GVB en mCherry: Exciter FF01-427/10 (GVB, Semrock) 572/23 (mCherry, Chroma), Emitter FF01-472/30 (GVB, Semrock) 632/60 (mCherry, Chroma), Dichroic Mirror 89006bs (Chroma).

De betekenis van deze techniek in vergelijking met andere beeldvormende technieken is tweeledig: ten eerste kan de lokalisatie van het eiwit van interesse in levende cellen en tweede vangen, kan de gegevens uit het toevoegen van de vierde dimensie van tijd te verhogen. Echter, zoals met exogene eiwitten er altijd de mogelijkheid mislocalization, hetzij door verhoogde expressieniveaus of door tagging, derhalve live cell imaging gecombineerd met immuno-kleuring van de endogene POI in gefixeerde cellen, teneinde de resultaten bevestigen . Tenslotte zij opgemerkt dat beeldvorming van levende cellen kan worden gecombineerd met immuno-EM, om de ruimtelijke resolutie van de analyse toenemen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgements

Ons werk wordt ondersteund door de Biologie en Biotechnologie Sciences Research Council. Wij willen graag Prof Tamotsu Yoshimori bedanken voor vriendelijk ons ​​te voorzien van de plasmide voor de expressie van de GVB-LC3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 41965
OptiMEM I Invitrogen 31985-062
MitoTracker Red FM Invitrogen M22425
LysoTracker Red DND-99 Invitrogen L-7528
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent Roche Applied Science 6365787001
22 mm coverslips VWR 631-0159
35 mm plates Fisher NUNC 153066
Silicon grease RS Components Ltd. RS 494-124
O-rings Custom made
Attofluor Cell Chamber Invitrogen A-7816 Suggested alternative to custom-made O-rings
Microscope Olympus IX81 Inverted microscope
Objective Olympus UPLSAPO 100XO N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5
Camera Hamamatsu ORCA-R2 C10600 10B Progressive scan interline CCD
Illuminator TILL Photonics Polychrome V Ultrafast monochromator
Incubation chamber Solent Scientific Cell^R IX81
Software Olympus SIS xcellence

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mizushima, N. Autophagy: process and function. Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).
  2. Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. The role of Atg proteins in autophagosome formation. Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).
  3. Klionsky, D. J. Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).
  4. Klionsky, D. J. Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve. Autophagy. 4, 740-743 (2008).
  5. Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. 3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum. Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).
  6. Hayashi-Nishino, M., et al. A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation. Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).
  7. Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).
  8. Mizushima, N., et al. Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells. The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).
  9. Itakura, E., Mizushima, N. Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins. Autophagy. 6, 764-776 (2010).
  10. Axe, E. L., et al. Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).
  11. Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue. Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics