Metabólica Labeling e Membrana Fracionamento para Comparative Analysis proteômica de

Biology

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Summary

Aqui, descrevemos um método robusto para o fraccionamento das membranas plasmáticas de plantas solúveis em membranas resistentes a detergente e do detergente baseado numa mistura de não marcado e in vivo totalmente 15 n marcadas culturas de células de Arabidopsis thaliana. O procedimento é aplicado para estudos de proteômica comparativas para compreender os processos de sinalização.

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Szymanski, W. G., Kierszniowska, S., Schulze, W. X. Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures. J. Vis. Exp. (79), e50535, doi:10.3791/50535 (2013).

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Abstract

Microdomínios de membrana de plasma são características baseadas nas propriedades físicas do ambiente de lípido e de esteróis e tem funções particulares em processos de sinalização. Extraindo microdomínios de membrana enriquecidos com esteróis a partir de células de plantas para análise proteômica é uma tarefa difícil, devido principalmente a várias etapas de preparação e fontes de contaminação de outros compartimentos celulares. A membrana plasmática consiste apenas cerca de 5-20% de todas as membranas de uma célula de planta, e, por conseguinte, o isolamento da fracção de membrana de plasma altamente purificado é um desafio. Um método frequentemente utilizado envolve a partição aquosa em duas fases em polietileno-glicol e dextrano, que produz vesículas da membrana de plasma com um grau de pureza de 95% 1. Microdomínios membrana rica em esteróis na membrana plasmática são insolúveis mediante tratamento com detergentes não iónicos a frio a um pH alcalino. Esta fracção membranar resistente a detergente podem ser separados a partir da membrana do plasma por ultracentrifugação, em grandes quantidades, comogradiente ucrose 2. Subsequentemente, as proteínas podem ser extraídas a partir da banda de baixa densidade do gradiente de sacarose por precipitação de metanol / clorofórmio. Proteína extraída irá então ser digerido com tripsina, dessalinizada e finalmente analisadas por LC-MS/MS. Nosso protocolo de extração de microdomínios ricos em esteróis é otimizado para a preparação de frações de membrana detergente limpa-resistente de culturas de células de Arabidopsis thaliana.

Usamos a marcação metabólica completa de Arabidopsis thaliana as culturas de células em suspensão com K 15 NO 3 como a única fonte de nitrogénio para os estudos de proteómica comparativa quantitativa após o tratamento biológico de interesse 3. Ao misturar proporções iguais de culturas de células marcadas e não marcadas para extração de proteínas conjunta a influência de etapas de preparação no resultado quantitativo final é mantido a um mínimo. Além disso a perda de material durante a extracção vai afectar o controlo e as amostras de tratamento da mesma forma, umad por conseguinte, a proporção de luz e péptido alçada irá permanecer constante. No método proposto quer marcado ou não marcado de cultura de células é submetido a um tratamento biológico, enquanto a outra serve de controlo 4.

Introduction

Em 1972, Jonathan Singer e Garth Nicolson propôs o modelo de mosaico fluido um modelo de estrutura das membranas celulares, substituindo o modelo sanduíche proteína-lipídio-proteína que foi geralmente aceite no início de 1960. Singer e Nicolson postulado que a membrana biológica pode ser considerada como um líquido bidimensional em que todas as moléculas de lípidos e de proteínas difundem-se livremente e facilmente 5. Desde essa altura, o modelo de estrutura da membrana do plasma e do conhecimento da composição de membrana tornaram-se ainda mais complexo. Particularmente, dentro da membrana do plasma, tais como estruturas de complexos de proteínas e de lípidos com base / esterol microdomínios estruturalmente desordenados pode ser observada. Em membranas modelo artificiais 6,7, esteróis e sphingolipids pode lateralmente segregar de outras espécies de lipídios para formar regiões com características físicas alteradas. Esta segregação no interior da membrana celular é causada principalmente pelas propriedades de auto-associação entre esteróis e altamente sacadeias de hidrocarbonetos de turated phopsho-esfingolípidos e 8. Particularmente, os anéis de esteróis rígidas favorecem as interações com mais aguerrida e espécies de lipídios reto saturadas e essas interações forçar vizinhos cadeias de hidrocarbonetos em mais conformações prolongadas, aumento da espessura da membrana e dureza.

Uma das características comumente observados de esterol enriquecido microdomínios membrana era a sua insolubilidade no tratamento com detergentes não-iónicos de Triton X-100 ou como Brij 35. Essas frações foram pensados ​​para ser idêntico ao microdomínios de membrana e foram chamados de membranas resistentes detergente (DRM) com base em seu método de preparação bioquímica 2. O uso de detergentes não iônicos durante a extração DRM recebeu algumas críticas como a preparação DRM bioquímico podem não corresponder diretamente a qualquer compartimento de membrana específico dentro da célula viva 9. Particularmente, a proporção de detergente para a proteína parece ser essencial em tais preparações, umas diferentes detergentes, bem como diferentes quantidades de detergentes pode produzir diferente composição da fracção de membrana resistente a detergente 10. No entanto, há evidências de que certas espécies de proteína associar especificamente com esses domínios de membrana rica em esteróis celulares, e que estas proteínas são bem enriquecido em preparações bioquímicos das fracções de membrana resistente a detergente 11. O núcleo de proteínas que foram encontrados na fracção DRM planta, e para as quais a presença de DRM foi esterol dependente, eram particularmente proteínas ancoradas por GPI, tais como proteínas, como a fasciclina-arabinogalactano (AVL) e membros da família de proteínas de SKU. Além disso, algumas proteínas sinalizadoras, como quinases ou fosfolipases receptores do tipo foram encontrados 11. Estes resultados são consistentes com vários estudos de proteômica em microdomínios de membrana de mamíferos 12,13. Também em plantas há cada vez mais evidências para o papel de microdomínios de membrana no contexto da resposta ao estresse 14 -16.

O protocolo aqui descrito proporciona um método robusto para fraccionamento de microdomínios da membrana do plasma e em particular utiliza uma proteína com a concentração de detergente que permite descrever as alterações induzidas pelo stress do compartimento da membrana rica em esteróis 4,11,14.

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Protocol

PROCEDIMENTO

Reagentes e tampões comuns utilizados no protocolo de extracção:

  1. Médio JPL para Arabidopsis thaliana culturas de células em suspensão
    • 3 uM H 3 BO 3
    • 3 uM MnSO4 x H2O
    • 1,1 iM ZnSO4 x 7 H2O
    • 0,15 mM KJ
    • 0,03 uM de Na 2 MoO 4 x 2 H2O
    • 3 nM de CoCl 2 x 6 H 2 O
    • 3 nM de CuSO4 x 5 H2O
    • 0,9 mM de CaCl2 x 2 H2O
    • 0,5 mM de MgSO4 x 7 H2O
    • 0,5 uM de FeSO4 x 7 H2O
    • 0,5 uM de Na2EDTA x 2 H2O
    • 0,12 uM de HCl tiamina
    • 0,16 uM de ácido nicotínico
    • HCl piridoxina 0,097 mM
    • 0,107 mM NAA
    • KH 2 PO 0,375 mM 4
    • NaH 0,061 mM2 PO 4 x 2 H2O
    • 0,039 mM de Na 2 HPO 4
    • 0,027 mM de glicina
    • 0,56 mM de mio-inositol
    • 1,5% de sacarose
    • 10 mM de K 14 NO 3 ou 10 mM de K 15 NO 3

NOTA: o pH do meio JPL deve ser ajustado para 5,7 com KOH. O meio deve ser esterilizado por filtração ou por autoclave antes do uso.

  1. Tampão H
    • 100 mM de HEPES-KOH (pH 7,5)
    • 250 mM de sacarose
    • 10% (w / v) de glicerol
    • 5 mM de EDTA
    • Ácido ascórbico 5 mM
    • 0,6% (w / v) de PVP K-25 ou K-30
    • DTT 5 (Adicionar novo)
    • PMSF 1 mM (adicionar fresco)
    • inibidores da protease e fosfatase (adicionar fresco)
      • NaF 50 mM
      • 1 mM Na 3 VO 4
      • 1 mM de benzamidina
      • 0,3 uM mikrocystin
      • 4 uM de leupeptina
      • cocktail inibidor de protease
  2. Tampão de R
    • Fosfato de potássio 5 mM
    • 0,33 M de sacarose
    • KCl 3 mM
    • EDTA 0,1 mM
    • DTT 1 mM (adicionar fresco)
  3. Tampão TNE
    • 25 mM Tris-HCl, pH 7,5
    • 150 mM de NaCl
    • 5 mM de EDTA
  4. Sistema de duas fases (6 g-sistema é adequado para até 15 g de peso fresco da amostra) método de preparação
    Em 15 ml Falcon misturar ingredientes tubo listados abaixo e misture bem:
    • 20% (w / w) dextrano T500 - 2,6 g
    • 40% (w / w) de poli (etileno glicol) (PEG 3350) - 1,3 g
    • sacarose - 0,678 g
    • 0,2 M de fosfato de potássio, pH 7,8-0,15 ml
    • 2 M de KCl - 0,014 ml
    • adicionar água até que a massa total do sistema de duas fases é de 6 g.
  5. Soluções de sacarose em tampão TNE
    • 2,4 M, 1,6 M, 1,4 M, 0,15 M
  6. Reagentes para a digestão de tripsina
    • UTU: 6 M de ureia, 2 M tioureia (pH 8,0 com 10 mM Tris-HCl) Tampão de redução (1 ug / uL de DTT em água e 6,5 mM)
    • Tampão de alquilação (5 ug / uL de iodoacetamida em água, 27 mM)
    • LysC Endopeptidase (0,5 ug / uL)
    • Tripsina, grau de sequenciação modificado (0,4 mg / mL)
  7. Reagentes para péptido dessalinização mais C 18
    • solução ressuspensão: 2% de ácido trifluoroacético (TFA), 5% de acetonitrilo em água
    • solução A: 0,5% de ácido acético
    • solução B: 80% acetonitrilo, 0,5% de ácido acético
  8. Reagentes para fosfopéptido enriquecimento
    • Solução A: 0,1% de TFA, 5% acetonitrilo
    • Solução B: 0,1% de TFA, 80% de acetonitrilo
    • TiO 2 10 um
    • Amônia (solução estoque 25%)
    • Piperidina (estoque 100%)

PROTOCOLOS

1. Marcação metabólica de Arabidopsis thaliana As culturas de células em suspensão

  1. Crescer Arabidopsis Col-0 celularculturas em suspensão derivadas de folhas 17 em pleno 14 de médio N-JPL, e um conjunto de culturas (18 secção "reagentes comuns e buffers" ver) em 15 de médio N-JPL em frasco estéril em condições de luz constante em 80 a 100 mmol / m 2 s, 23 ° C, sob agitação constante a 120 rpm.
  2. Para manter as culturas de células, inocular 400 ml de meio fresco JPL com 40 ml de cultura de células de sete dias de idade em frascos de 1 L.
  3. A colheita de culturas de células ocorre através de sucção por vácuo através de um funil de vidro com uma largura de malha de aço inoxidável. As células se acumular no prato de malha e no funil e pode ser facilmente recolhido a partir daí. As células são recomendados para serem congelados a -80 ° C ou em azoto líquido antes da moagem.

NOTA: Para o 15 N culturas de células marcadas metabolicamente usar o K 15 NO 3 como a única fonte de azoto, durante, pelo menos, duas passagens de 19, durante duas semanas. Em experiments para proteômica comparativas, use a 15 N rotulada de cultura de células e também manter uma cultura sem rótulo em meio normal. O tratamento biológico, em seguida, ser aplicado à cultura ou marcado ou não marcado, enquanto a outra serve de controlo (Figura 1). Para a preparação de proteína, ambas as culturas são combinados 20. Ao planejar a instalação experimental, recomendamos considerando uma configuração de rotulagem recíproca 4, no qual o mesmo tratamento é aplicado uma vez aos 15 células N-rotulados e uma vez para as células não marcadas e respectiva sem rótulo ou 15 células N-rotulados servir como controles. Neste caso, são necessários os montantes duplos de culturas de células.

2. Plasma Membrane Purificação

Observação: Todas as outras etapas são realizadas na câmara fria e / ou no gelo, a menos que seja indicado de outra forma.

  1. Homogeneizar células de cerca de 1 L de culturas de células em suspensão sete dias de idade em nitrogênio líquido.O material pode ser armazenado a -80 ° C até à sua utilização.
  2. Misturar as mesmas quantidades de culturas de células marcadas e não marcadas congelados com base no peso fresco num copo e adicionar 2 volumes de tampão H imediatamente. No caso da preparação microdomínio membrana é sugerida a utilização de, pelo menos, 7 g de peso fresco de ambas as células marcadas e não marcadas.
  3. Colocar o copo num agitador e agitar até que o material é fundido e a solução é um líquido e, sem cristais de gelo.
  4. Filtrar o homogeneizado através de uma camada de Miracloth em 50 ml de tubos de centrífuga.
  5. Saldo amostras com tampão H e centrifugar a 10.000 xg por 8 min.
  6. Carregue o sobrenadante em tubos ultra-centrífugas pré-refrigerados (por exemplo, para o rotor Beckman Coulter SW31Ti), com volume de cerca de 32 ml
  7. Amostras de equilíbrio com tampão H e sedimentar as microssomas por centrifugação a 100.000 x g a 4 ° C durante 30 min, utilizando Beckman SW32Ti rotor.
  8. Retirar o sobrenadante, após a centrifugação.

    NOTA: O sobrenadante contém proteínas solúveis. Uma pequena quantidade desta fração pode ser guardado para posterior precipitação de proteínas e análise posterior, também de proteínas solúveis.

    1. Ressuspender o sedimento de membrana de cada amostra na respectiva quantidade de tampão R e carregar na parte superior de U1 sistema de duas fases (Figura 2). Se a 6 g do sistema de duas fases é utilizado, carregar exactamente 2 g de sedimento de membrana ressuspenso.

    NOTA: O volume final de tampão de R depende do tamanho do sistema de duas fases, que vai ser utilizado (~ 1,6 mL de tampão R é necessário quando se utiliza sistema 6 g). Recomenda-se a utilização de menos de tampão de ressuspensão de modo tampão puro pode ser adicionado no sistema de duas fases para se obter o peso exigido, em vez de usar muito tampão de solubilização e não ser capaz de carregar o conjunto da amostra para o sistema de duas fases.

    1. Carregar o mesmo volume de tampão R puro que é utilizada para the amostra ressuspensão para U2.
    2. Misture lentamente tubos de U1 e U2, invertendo-lhes 30x (aproximadamente 1 inversão / seg).

    NOTA: Não agite vigorosamente o sistema de duas fases. Isso pode provocar uma falta de separação de fases no passo de ultracentrifugação.

    1. Centrifugar as amostras a 1500 xg, a 4 ° C durante 10 min.
    2. Retirar o sobrenadante, após a centrifugação.
    3. Transferir a fase superior de U1 em U2 e repetir a centrifugação a 1500 xg, a 4 ° C durante 10 min.
    4. Mova a fase superior do U2 nos tubos de ultracentrífuga SW41Ti e diluir com cinco volumes de tampão R e misture bem.

    NOTA: A fase superior final, pode ter que ser dividida em tubos de ultracentrífuga separados antes que possa ser diluída cinco vezes.

    1. Centrifugar as amostras a 200.000 x g a 4 ° C durante uma hora, utilizando o rotor SW41Ti.
    2. Pellet membrana Ressuspender em small quantidade de tampão TNE (tipicamente 200 ul de tampão é utilizado) para o isolamento de membranas resistentes a detergente.

    NOTA: Uma pequena quantidade desta fração pode ser salvo para a análise da membrana plasmática não fracionada.

    NOTA: A fracção de membrana de plasma podem ser armazenadas a 4 ° C durante a noite antes de fraccionamento em membranas resistentes a detergente e as fracções solúveis em detergente.

    3. Detergente resistente Preparação da Membrana

    1. Verificar a concentração da fracção de membrana de plasma por ensaio de Bradford.
    2. Adicionar Triton X-100 para a fracção de membrana plasmática. A concentração final de detergente deve ficar entre 0,5-1%. O detergente para peso proteína em relação ao peso deve ficar entre 13-15.
    3. Agitar as amostras em cerca de 100 rpm a 4 ° C durante 30 min.
    4. Adicionar três volumes de 2,4 M de sacarose para um volume de membrana de plasma tratado para se obter 1,8 M de concentração final de sacarose. </ Li>
    5. Prepare o gradiente de sacarose em tubos de ultracentrífuga SW41Ti por carregar as respectivas soluções de sacarose em cima da fracção 1,8 M, como ilustrado na Figura 3.
    6. Centrifugar as amostras a 250.000 x g a 4 ° C durante 18 horas usando o rotor Beckman SW41Ti.
    7. Remova cuidadosamente os tubos de ultracentrífuga do rotor para evitar a interrupção da banda de baixa densidade, que pode ser visível como um anel leitoso na interface de 0,15 M/1.4 M de sacarose. Às vezes, nada pode ser visto, mas a fração ainda contém a fração de proteína resistente detergente.
    8. Retirar fracção de volume de 0,75 ml a partir do início do gradiente. As fracções 2 e 3, que cobrem o volume de cerca de 1,5 ml acima do anel de interfase e 0,5 ml que se seguem representam a fracção de membrana resistente a detergente. Coletar essas frações em tubos de 15 ml Falcon. As fracções 9 e 10 contêm a fracção de membrana solúvel em detergente e podem também ser recolhidos, para comparação. Para uma análise mais aprofundada, piscina fractiões de 2 e 3, bem como as fracções 9 e 10.

    4. A extracção de proteínas a partir da fracção resistente detergente por metanol / clorofórmio

    Nota: Todos os passos são realizados na temperatura ambiente.

    1. Adicionar 4 volumes de metanol para as fracções recolhidas e de vórtice completamente.
    2. Adicionar 1 volume de clorofórmio, de vórtice completamente.
    3. Adicione 3 volumes de água, vórtice completamente.
    4. Centrifugar as amostras a 2000 xg durante 5 min, utilizando uma centrífuga de bancada (por exemplo, Eppendorf 5417R).
    5. Remover a fase aquosa acima da camada de proteína na interfase.
    6. Adicionar 3 volumes de metanol, vórtice completamente.
    7. Centrifugar as amostras a 4000 xg durante 10 min.
    8. Remover o sobrenadante e secar o sedimento. O sedimento seco é preparado por digestão em solução.

    5. Na solução de digestão com tripsina

    NOTA: Neste procedimento, todas as etapas são feitas notemperatura ambiente para reduzir o indesejado de derivação de cadeias laterais de aminoácidos por desnaturantes.

    1. Dissolver amostra em pequeno volume de 6 M uréia, 2 M thiurea, pH 8 (UTU). Uso como baixo volume como é compatível com a amostra (habitualmente cerca de 40 uL).
    2. As amostras solubilizadas em rotação UTU em 5000 xg numa centrífuga de bancada (por exemplo, Eppendorf 5417R) durante 10 min para sedimentar qualquer material insolúvel.
    3. O pH da solução final deve ser próximo de 8,0 para a digestão de tripsina óptima. Verifique com tiras de pH.
    4. Adicionar 1 mL de tampão de redução para cada 50 ug de proteína de amostra e incubar 30 min a temperatura ambiente.

    Nota: Somente uma estimativa aproximada do conteúdo de proteína é necessário. Quando quantidade da amostra é limitado, é melhor sacrificar a precisão em vez de desperdiçar amostra em um ensaio de proteína.

    1. Adicionar 1 mL de tampão de alquilação para cada amostra de proteína de 50 ug e incubar 20 min a temperatura ambiente na obscuridade.
    2. Adicionar 0,5 mL de LysC por 50 ug de proteína da amostra e incuba-se durante três horas à temperatura ambiente com agitação constante a 700 rpm. Se necessário, a digestão pode ser realizada durante a noite. Entretanto, o tempo prolongado em altas temperaturas não é recomendada, pois pode aumentar a perda de peptídeo devido à adsorção de material de tubo de plástico sob aquosas pH 8 condições.
    3. Diluir a amostra com quatro volumes de 10 mM Tris-HCl, pH 8.

    NOTA: Este passo é absolutamente necessária para diluir a concentração de ureia, como a tripsina é muito sensível a sal elevado.

    1. Adicionar 1 mL de tripsina por 50 mg de proteína de amostra e incubar durante a noite à temperatura ambiente com agitação constante a 700 rpm.
    2. Acidifica-se as amostras com 0,2% de TFA concentração final até atingir o pH 2 (adicionar cerca de 1/10 do volume de ácido trifluoroacético 2%).

    NOTA: As amostras podem ser armazenadas a - 20 ° C até ser utilizado mais, mas é melhor para armazenarlos em StageTips a 4 ° C, se é para um curto período de tempo (uma semana) ou armazená-los após StageTips dessalinização.

    6. Fabricação de C-18 StageTips

    1. Coloque um disco Empore C18 sobre uma superfície plana e limpa, tal como um plástico descartável placa de Petri.
    2. Perfurar um pequeno disco usando uma agulha hipodérmica de ponta romba com diâmetro de 1,5 mm. O disco adere no interior da agulha e pode ser transferido para uma ponta de pipeta.
    3. Empurre o disco para fora da agulha e corrigi-lo no afilamento de uma ponteira por um pedaço de sílica ou tubulação encaixe no interior da agulha fundido.

    NOTA: StageTips pode ser armazenado a seco a temperatura ambiente 21.

    7. Uso de 18-C para StageTips Peptide dessalinização e concentração

    1. Condição de um C-18 StageTip colocando 50 ml de solução B para o StageTip preparado. Gire a ponta na centrífuga a 2.000 rpm por 2 min em uma bancada centrifuge (ex. Eppendorf 5417R).

    NOTA: Use adaptadores para girar StageTips em uma centrífuga Eppendorf, líquido será coletado em um tubo de reacção de 2 ml. Para as preparações de maior escala, dicas de palco também pode ser colocado em um rack de ponta com 96 das 200 dicas ul e líquido pode ser coletado em uma placa de microtitulação.

    NOTA: Nunca utilize velocidades superiores a 3.000 xg em uma centrífuga de bancada (ex. Eppendorf 5417R), devido ao risco de girar o disco C 18 a partir da ponta.

    1. Equilibrar o StageTip usando 100 mL solução A. Gire a ponta na centrífuga a 5.000 xg em uma centrífuga de bancada (ex. Eppendorf 5417R).
    2. Repita o passo 2.
    3. Amostra de carga no disco pipetando cuidadosamente a amostra para a ponta da pipeta com o disco dentro.

    NOTA: Um disco pode ligar aprox. 100 ug de proteína.

    1. Gire as dicas no centrifuge até que todo o volume da amostra passa através do disco de C 18.
    2. Lavar as StageTips duas vezes com 100 ul de solução A. Gire as pontas na centrífuga.

    NOTA: As StageTips lavados e carregados podem ser armazenados a 4 ° C durante até uma semana.

    1. Eluir amostra com 40 ml de solução B. Recolher o eluato num fresco de 1,5 ml tubo de reacção.
    2. Concentre-se a amostra no vac velocidade. Em condições ideais, parar o processo de desidratação, como há apenas cerca de 1 ou 2 mL de líquido esquerda.

    NOTA: As amostras secas podem ser armazenadas em -80 ° C durante anos.

    1. Adicionar um volume final de 9 mL da solução para a ressuspensão de amostra e transferi-lo para a placa de microtítulo, por análise de espectrometria de massa.

    NOTA: O volume final do tampão de ressuspensão utilizados é dependente das necessidades do experimentador e a sensibilidade do espectrómetro de massautilizado.

    8. Protocolo alternativo para phosphopeptide Enriquecimento

    NOTA: Para o enriquecimento de fosfopéptidos, extracção da proteína no passo 2 deve ser realizado na presença de inibidores de fosfatase.

    NOTA: A concentração de proteína exacta não precisa de ser determinada pelas seguintes etapas. É o suficiente para ter uma estimativa do teor de proteína para evitar a perda de amostra desnecessário

    1. Prepare a C 8-StageTips (seguem o mesmo protocolo para a preparação de C-18 StageTips no passo 6).
    2. Transferência de 1 mg de TiO 2-esferas para o início de C preparado 8-StageTips (utilização de 1 mg de TiO 2 por 100 ug de proteína).
    3. Equilibrar as TiO 2-dicas com 100 ul de solução C, rotação de 2.000 xg durante 5 minutos numa centrífuga de bancada (por exemplo, Eppendorf 5417R).
    4. Misturar 100 ug de péptidos digeridos e dessalinizada a partir da etapa 7.7 (deve ser em 100 ul de solução deB) com 100 ul de solução A.
    5. Carregar amostra mista para as equilibradas TiO 2 colunas; rotação em 1000 xg, 5 min.
    6. Recolher o flow-through e carregá-lo para a mesma ponta de novo (manter o fluxo através após segunda passagem).
    7. Lave ponta com 100 ml de solução A; rotação a 2.000 xg, 5 min em uma centrífuga de bancada (ex. Eppendorf 5417R).
    8. Eluir amostra com 50 ul de 5% de amónia.
    9. Eluir amostra com 50 ul de 5% de piperidina (ambos os produtos de eluição pode ser combinado).
    10. Acidificar imediatamente a amostra com 50 ul de ácido fosfórico a 20%. O pH deve ser de cerca de 2.

    NOTA: Guarde os TiO 2 pontas e recuperar o pó. Pode ser lavado com solução B e utilizado de novo para mais uma ou duas voltas.

    1. Novamente dessalinizar amostras acidificadas sobre C 18 dicas (veja o passo 8).

    9. LC-MS/MS Análise do Péptido Misturas

    1. Ressuspender fosf dessalinizadaopeptides em tampão de ressuspensão.
    2. Carga ressuspenso amostra em sistema LC-MS/MS de escolha e aquisição de espectros no modo de dados dependente de resolução sugerida de 60.000 larguras à meia altura.

    NOTA: Para a fragmentação ideal, ou a digitalização de perda de neutro deve ser aplicado 22, ou, se disponível a ativação de vários estágios 23. Se ETD está disponível que irá permitir a fragmentação peptídeo backbone sem perda de ácido fosfórico 24.

    NOTA: As listas de pico a partir de dados brutos precisa ser extraído e submetido a identificação de banco de dados, bem como para a quantificação. Aqui, descrevemos as configurações para o uso da mascote e MSQuant, o que funciona para os arquivos de dados brutos do LTQ, LTQ-Orbitrap e instrumentos de LTQ-FT (Thermo Scientific).

    1. Extrair lista de pico usando DTAsupercharge dentro do Menu "Helper" em MSQuant. Use as configurações padrão.
    2. Enviar resultando arquivo de lista de pico a mascote motor de busca. Crconfigurações itical: precursoras íon massa tolerância de 10 ppm, a tolerância massa MS / MS 0.5 Da. Modificações fixos: carbamidomethylation de cisteínas, modificações variáveis: oxidação de metionina, a fosforilação de serina, treonina, tirosina. Modo de quantificao: 15 N marcação metabólica.
    3. Salve resultado da mascote como arquivo de página web.
    4. Carregar arquivo de resultado da mascote e do arquivo bruto em MSQuant. Selecione todas as proteínas de interesse e executar "quantificação automática". O programa irá ler espectros de varrimento total do arquivo RAW e fazer a integração de pico para parceiros rotulados e não rotulados de cada peptídeo.
    5. Resultados Exportação de quantificação para um programa de planilha ou em um arquivo de texto delimitado por tabulação. Os dados podem então ser submetidos a uma análise mais aprofundada estatística no Excel ou usando outros pacotes de software, tais como Statquant 25 ou biscoito 26.

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Representative Results

Com o protocolo apresentado por meio de culturas de células marcadas metabolicamente Arabidopsis é possível isolar as membranas de plasma a partir de tecidos de plantas (passo 2, as Figuras 2 e 4), e enriquecer por fracções de membrana resistente a detergente no interior da membrana plasmática (passo 3, as Figuras 3 e 5). Subsequentemente, o protocolo permite a extracção de proteínas a partir destas fracções de membrana resistente a detergentes (passo 4) e de digestão da proteína por análise de proteómica comparativa (passo 5). Finalmente, o enriquecimento opcional de fosfopéptidos (passo 8) é particularmente interessante no estudo de processos de sinalização celular. O último passo é, então, a análise quantitativa dos dados (passo 9, Figura 6) de razões de abundância de proteína em fracções de membrana a partir de cultura de células marcado e não marcado.

Os resultados típicos após a mistura do sistema de duas fases (passo 2) e centrifugação subsequente são uma fase superior de cor clara e umcor verde fase inferior (Figura 2). Vesículas da membrana de plasma, preferencialmente associar com a fase de PEG superior, enquanto que as vesículas de membrana a partir de cloroplastos verdes e de outras membranas interiores são incorporados na fase de dextrano inferior. Se a separação de cor não pode ser observado, o passo 2 não foi efectuada correctamente e as membranas de plasma vai ser contaminado com quantidades significativas de membranas internas. O enriquecimento de proteínas de membrana de plasma pode ser mostrado por análise proteoma de pequenas alíquotas de fracções de membrana de plasma e proteínas na fase inferior de sistema de duas fases. A fase inferior contém as membranas internas da célula. Por exemplo, as proteínas de membrana de plasma conhecidos particularmente típicas, tais como as proteínas do receptor de quinase apresentaram grande abundância na fracção de membrana de plasma (PM) e baixa abundância na fracção de fase mais baixa (Figura 4A), contendo as membranas internas (IM). Por sua vez, as proteínas conhecidas do retículo endoplasmático show de altaabundância na fracção da membrana interior, e não foi observada na fracção da membrana plasmática (Figura 4B).

A subsequente enriquecimento das fracções de membrana resistente detergentes (passo 3) será, em casos ideais resultar na formação de um anel leitosa de baixa densidade da membrana de vesículas a aproximadamente 1/5 da altura do tubo (figura 3). Se o ajustamento da concentração ou o Triton X-100 detergente proteína (passo 3.2) é óptima para a separação em fracções solúveis detergentes resistente e detergentes, os anéis adicionais pode ser observado na parte inferior do gradiente e haverá também aglomerados de membrana na banda de baixa densidade. Nestes casos, a proporção de detergente de proteína ou quantidade total de detergente é diferente da concentração micelar crítica necessária para a separação reprodutível das duas fracções de domínio de membrana. Usando a concentração de detergente final e detergente a proporção de proteína descrita aqui, Enrichment de proteínas microdomínio típicos, tais como remorina (AT3G61260) 27 pode ser confirmada através de uma análise comparativa por espectrometria de massa da fracção de DRM, fracção solúvel em detergente (passo 3.8), bem como a membrana de plasma não fraccionada e as membranas internas. A maior abundância da proteína remorina foi encontrado nas fracções de DRM como esperado (Figura 6A). As proteínas que não estão presentes nos microdomínios de membrana, tais como a AT1G59870 ABC-transportador (Figura 6B), não apresentam uma maior abundância na fracção de DRM. Também contaminantes típicos, tais como uma proteína mitocondrial (AT2G07707) a partir do complexo F0 da ATPase (Figura 6C) e proteína ribossomal (At1G001100) do ribossoma 60S (Figura 6D) não mostram uma abundância enriquecido na fracção DRM, embora quantidades mínimas pode ainda ser identificada.

Após abundâncias análise por espectrometria de massa, proteína rácios de estado de fosforilação de proteínas no plasmaAs fracções de membrana de culturas de células marcadas e não marcadas possam ser distinguidos quantitativamente (Figura 6). Os resultados típicos do MSQuant ( msquant.alwaysdata.net janela quantificação) deverá apresentar uma taxa de intensidade de iões de um para um para a maioria dos péptidos identificados (Figura 6A). Esses peptídeos com um rácio de intensidade de iões desviar significativamente de 1:1 são consideradas como diferencial regulada entre a cultura celular marcado e não marcado, e são candidatos à correspondente às proteínas afectadas pelo tratamento aplicado (Figura 6C). Um bom controlo de qualidade de marcação metabólica bem sucedido é o de co-eluição de ambas as versões rotuladas e péptidos não marcados, como um único pico na separação nano-HPLC (passo 9), conforme ilustrado nas Figuras 6B e D.

Figura 1 Figura 1. Representação estratégia experimental marcação metabólica. Esquemático de duas variantes do projeto experimental quando se utiliza culturas de células sem rótulo A. thaliana totalmente metabólica e rotulados. O experimentador pode decidir usar 14 N células (sem rótulo) como controle e 15 N células (marcadas metabolicamente) que passam por tratamento biológico, ou vice-versa. Em um delineamento experimental recíproca ambas as variantes são realizadas em paralelo.

Figura 2
Figura 2. Fluxo de trabalho para a separação das vesículas de membrana em planta de um sistema de duas fases aquosas com base em polietileno glicol (PEG) e dextrano. Vesículas de membrana do plasma separado na fase de PEG superior enquanto cloroplasto e outras membranas interior associado com a Bottfase de dextrano om após centrifugação. Com a lavagem adicional da fase superior melhor a purificação pode ser alcançada, mas também a perda de material é aumentada.

Figura 3
Figura 3. Enriquecimento de frações de membrana de baixa densidade. Representação do gradiente de sacarose para o enriquecimento de detergente resistente frações de membrana de baixa densidade. É indicada a localização esperada após a centrifugação durante a noite da densidade da membrana banda baixa vesícula.

Figura 4
Figura 4. O enriquecimento de proteínas da membrana plasmática, após a purificação no sistema de duas fases. Normalizadointensidades de íon de proteína para as proteínas medidos em membrana plasmática (PM) e membranas internas fração (IM). (A) constituintes típicos conhecidos da membrana plasmática mostrar muito maior abundância na fração PM que em fração IM. componentes conhecidos (B) Natural de membranas internas mostra o comportamento oposto. Para a normalização, as somas de iões de intensidade para cada proteína foram expressos como uma fracção da intensidade total de iões por cada amostra e, em seguida, em média entre réplicas. Fração de intensidades totais de íons foram posteriormente expressas em relação à média entre os dois tratamentos. As barras de erro representam o desvio padrão de três preparações de culturas de células cultivadas de forma independente. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 5 Figura 5. . Abundância de marcadores de proteína padrão dentro fracção medida Terrenos representar a distribuição de intensidades de íons proteína normalizados dos marcadores escolhidos proteína para determinados compartimentos subcelulares (DRM - microdomínios ricos em esteróis, PM - membrana plasmática, IM - membranas internas, SP - proteínas solúveis). Padrões de abundância de (A) remorina como um marcador para microdomínios de membrana ricos em esteróis, (B) tipo ABC proteína família transportador como um representante de uma proteína não esterol-dependentes, (C) subunidade do complexo F0 mitocondrial, (D) 60S subunidade dos ribossomos como um contaminante típico co-purificação. Para a normalização, as somas de iões de intensidade para cada proteína foram expressos como uma fracção da intensidade total de iões por cada amostra e, em seguida, em média entre réplicas. Fração de intensidades totais de íons foram posteriormente expressas em relação à média entre os dois tesourotimentos. As barras de erro representam o desvio padrão de três preparações de culturas de células cultivadas de forma independente. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 6
Figura 6. Os resultados esperados de proteína quantitativa espectrometria de massa. Tiro Tela de MSQuant mostrando a relação de 1:1 a intensidade de iões esperado de um péptido a partir de uma mistura 1:1 de extractos de proteína a partir de células de Arabidopsis marcado e não marcadas. (A) Espectro de varrimento total de péptido DNNLLGK claramente separando marcado (pico direito) e versão não marcado (pico à esquerda) dos péptidos no eixo m / z. A massa monoisotópico eo primeiro isótopo são indicadas por marcas azuis. (B) rotulada (azul) umad versões não marcados (vermelho) do péptido co-eluir como um único pico durante a cromatografia de nano-HPLC. (C) espectro de varrimento total de um péptido com a relação da intensidade de iões de 1:5 como um candidato para uma proteína diferencialmente regulado (D. ) Também proteínas com diferentes proporções de 1:1 co-eluição em cromatografia de fase reversa. Clique aqui para ver maior figura .

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Discussion

O protocolo apresentado neste artigo contém muitas etapas e todos eles são cruciais para a obtenção de fracionamento pura e representante da membrana plasmática da planta em membranas resistentes detergente e frações solúveis detergentes. Portanto, é importante seguir cada passo as instruções.

O tratamento da fracção da membrana de plasma com um detergente não-iónico (passo 3.2) tem a maior influência sobre a qualidade da membrana microdomínio fraccionamento. Para obter resultados reprodutíveis entre diferentes preparações, e para ser capaz de comparar diferentes amostras da mesma experiência, o que é muito importante para avaliar com precisão a concentração de proteínas na membrana do plasma e para aplicar o detergente sempre na mesma proporção em relação ao conteúdo de proteínas e sempre com a mesma concentração final. Praticamente, isto significa que, por vezes, é necessário diluir as amostras com uma elevada concentração de proteínas ou para usar estoques de concentração diferentesde Triton X-100.

Em estudos bioquímicos, recentemente tem havido uma tendência entre os pesquisadores de usar um método livre de detergente para o isolamento de microdomínios de membrana 28-30. Estes métodos baseiam-se em uma ruptura mecânica da membrana plasmática por corte por meio de uma pequena agulha, em analogia com a prensa de célula de pressão Francesa. Estes procedimentos foram aplicados com sucesso em culturas de células de mamíferos ricos em microdomínios de membrana, mas a sua aplicação à parede celular contendo os organismos (de levedura, células de plantas), não foi relatado. Usando proteómica quantitativos em conjunto com agentes disruptores de esteróis, tais como a metil-beta-ciclodextrina, verificou-se que as fracções de DRM preparadas a partir da membrana plasmática da planta que contêm proteínas que são marcadores para microdomínios de membrana 11.

Em relação aos resultados finais da quantificação por espectrometria de massa, os resultados típicos mostrados na Figura 6 representam a situação ideal emque a intensidade de iões para a maioria dos péptidos marcados e não rotulados encontram-se perto de idênticos. No entanto, em alguns casos, um certo grau de variação biológica entre os conjuntos de culturas de células marcadas e não marcadas possam ser observados. Assim, antes do tratamento biológico ou de cultura de células rotuladas ou não marcado é realizada, a análise de uma mistura de células de controlo marcadas e não marcadas, quer sem qualquer tratamento, permite a identificação de péptidos com um rácios divergentes do ideal para uma situações. Estas proteínas com relações divergentes são indicações para variação biológica. Para superar o desafio de distinguir os efeitos do tratamento da variação biológica, nós, portanto, propor a utilizar a rotulagem recíproca em experiências emparelhadas 20. Na montagem experimental recíproco, ambas as variantes da experiência são realizadas tal como proposto na figura 1 e os passos do protocolo são seguidos como descrito. Então, comparando os índices de intensidade de íons de proteins de ambas as experiências recíprocas, podem distinguir-se as diferenças entre as taxas de intensidade de iões são, devido à variação biológica ou como um efeito do tratamento aplicado.

Outro método para resolver o problema de diferenciar entre os efeitos do tratamento e variação biológica é a utilização de um padrão marcado interno como referência para todos os tratamentos de 31. Nessa abordagem, o controlo não marcado e células não marcadas que se submetem a tratamento biológico são misturados com a mesma quantidade de células de controlo marcadas pesados, provenientes do mesmo lote. Ele permite eliminar a influência da variação biológica em relação péptido, porque as proteínas são considerados como significativos, se as relações de iões de intensidade de 14 N-controlo / 15 N-controlo e 14 N-tratamento / 15 N-controlo são significativamente diferentes. Isto é possível, tal como o padrão marcado é exatamente o mesmo em todos os casos.

Um dos drawbacks do processo de DRM enriquecimento descrito aqui estão as proteínas co-purificação que pode ser identificado na fracção de membrana resistente a detergente. Na lista de proteínas identificadas a partir da fracção de membrana resistente a detergente de baixa densidade, pode-se observar regularmente um grande número de proteínas ribossomais. Devido à densidade relativamente baixa das proteínas ribossomais, migram na mesma fracção na forma de proteínas de membrana dependentes de esteróis no gradiente de sacarose. Mostrou-se, sem qualquer dúvida que as proteínas ribossomais claramente não são constituintes de microdomínios de membrana 11. Para excluir essas e outras proteínas co-purificação de verdade não associados aos de baixa densidade frações de membrana detergente resistente, nos propomos a analisar também a composição proteômica das membranas intracelulares (IM) que podem ser extraídos a partir da fase de dextrano menor dos dois- sistema de fase e para comparar os índices de abundância de contaminantes putativas entre a membrana interna e a DRMfracção (ver exemplos na Figura 5). Proteínas DRM-co-purificação deve ter abundâncias semelhantes em ambas as frações (IM e DRM).

Fracionamento de extratos celulares e microdomínios de membrana é uma estratégia comum para reduzir a complexidade em uma amostra para análise proteômica 32. Portanto, o protocolo aqui descrito é útil para todos os estudos de sinalização de processos na membrana plasmática de células de plantas. Aplicações biológicas estão em estudar as respostas de stress, bem como infecções de agentes patogénicos que toda a um grande grau de induzir alterações na composição da membrana do plasma e modificação de proteínas de membrana de 14,15. Além de estudar as respostas ao estresse, a quantificação da abundância de proteínas em diferentes frações de membrana pode ajudar muito anotação de proteínas desconhecidas Ainda 33 34,35.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O autor, Witold Szymanski, é um funcionário do Instituto Max Planck de Biologia Molecular Plant Physiology. O autor, Waltraud Schulze é um funcionário da Universidade de Hohenheim, na Alemanha.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise
Ammonia (stock 25 % solution) WAKO 010-03166
TiO2 10 μm GL-Science 5020-75010
Empore Disk C18 Varian 12145004
Polyethylene glycol(PEG 3350) Sigma 88276
Dextran T500 Roth 9219.2
Trypsin Promega V5113
Protease inhibitor cocktail (PIC) Sigma P9599
K15NO3 Cambridge Isotope Laboratories NLM-765-PK
EQUIPMENT
Optima L-80 XP Ultracentrifuge Beckman
Plate reader BioTek
EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph Thermo Scientific
LTQ-Orbitrap mass spectrometer Thermo Scientific
Centrifuge 5810R Eppendorf
Centrifuge 5417R Eppendorf
Thermomixer Eppendorf
Speed Vac RVC 2-25 Christ
Shaker Unimax 2010 Heidolph

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