En effektiv Manuell utbeining metode for å forberede Intakt Mouse Nasal Tissue med bevart Anatomisk Organization

1Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County
* These authors contributed equally
Published 8/10/2013
1 Comment
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Dunston, D., Ashby, S., Krosnowski, K., Ogura, T., Lin, W. An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization. J. Vis. Exp. (78), e50538, doi:10.3791/50538 (2013).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Pattedyr nese er en multi-funksjonelle organ med intrikate interne strukturer. Nesehulen er foret med ulike epitel som olfactory, luftveiene og plateepitel epitel som avviker markant i andre anatomiske områder, morfologi og funksjoner. I voksen mus, er nesen dekket med ulike skallen bein, noe som begrenser eksperimentell tilgang til interne strukturer, spesielt de i bakre som den viktigste lukteepitelet (MOE). Her beskriver vi en effektiv metode for å skaffe nesten hele og intakte nasal vev med bevart anatomisk organisasjon. Ved hjelp av kirurgiske verktøy under et dissekere mikroskop, vi sekvensielt fjerne skallen bein rundt nasal vev. Denne prosedyren kan utføres på begge paraformaldehyde-faste og ferske dissekert, flådd mus hoder. Hele prosedyren tar utbeiningen omtrent 20-30 min, som er vesentlig kortere enn den eksperimentelle tiden som kreves for konvensjonell kjemisk de-baserteforkalkninger. I tillegg presenterer vi en enkel metode for å fjerne luftbobler fanget mellom nesemusling, som er kritisk for å oppnå intakte tynne horisontale eller koronale eller sagittal seksjoner fra nasal vev forberedelse. Nasal vev fremstilt ved å anvende vår metode kan brukes til hel montere observasjon av hele epitel, samt morfologiske, immuncytokjemisk, RNA in situ hybridisering, og fysiologiske studier, spesielt i studier hvor region-spesifikke undersøkelse og sammenligning er av interesse.

Introduction

Pattedyr nesehulen inneholder ulike typer vev og organer som tjener forskjellige funksjoner. Nesehulen utgjør oppføring delen av øvre luftveier, noe som gjør at flytrafikken inn og ut av lungene. Inhalert luft passerer gjennom nesehulen hvor den gjennomgår temperatur og fuktighet conditioning 1 samt rengjøring eller filtrering for å fjerne irriterende og giftige stoffer og smittsomme mikroorganismer to. Begge behandlingene blir utført av nasal epitel og subepithelial vev, inkludert kjertler og fartøy, og er avgjørende for å beskytte nedre luftveier og lungene. I tillegg til sin rolle i åndedrett og epitelial forsvar, inneholder den nasale vev også perifere sensoriske apparater olfactory og trigeminal systemer, som gjenkjenner en lang rekke kjemiske stoffer i den gjennomstrømmende luft. Avhengig av hvilken systemet er aktivert, kan sensorisk påvisning av kjemikalier i nesen fremkalle entenen følelse av lukt, irritasjon eller smerte 3,4.

Det perifere luktsystemet er sammensatt og består av flere anatomisk atskilt olfactory sensoriske organer i nesehulen. Blant dem er den viktigste lukteepitelet (MOE) den største, som utgjør ca 45-52% av nasal epitel hos gnagere 5, og ligger i den bakre regionen. I anteroventral regionen, er det et par av rørformede strukturer kjent som vomeronasal 6 organ, som sitter langs hver side av neseskilleveggen. Ytterligere to små grupperinger av olfactory sensoriske nevroner, kjent som septal organ Masera 7,8 og Gruneberg ganglion 9, bor langs ventral septum og dorsal oppføring regionen i nesehulen, henholdsvis. Disse perifere organer inneholder neuro-epitel med særpreg i morfologi, celle markør uttrykk, og fysiologiske funksjon. Sammen har de oppdage tusenvis av luktmolekyler med utsøkt følsomhet 10-12.

I tillegg til de olfaktoriske sensoriske organer, huser nesehulen også andre sensoriske systemer. Det er kjent at peptidergic trigeminal nervefibre er til stede i det nasale epitel, spesielt det respiratorisk epitel 13,14. Noen av disse fibrene oppdage irriterende og giftige kjemikalier og er ansvarlig for å initiere beskyttende reflekser som hoste og nysing 4,15. Irriterer illeluktende og bitter forbindelser kan også bli oppdaget av en nylig oppdaget befolkning på ensomme chemosensory celler (SCCS), hvorav mange er innervated av trigeminal nerve fibre 16-19. Disse SCCS er plassert i høyere tetthet i entry-regionen i nesehulen og vomeronasal oppføring kanaler, antydet at de kan også tjene en beskyttende funksjon 16-18. Således kan nasale epitel vesentlig forskjellig i funksjon, morfologi, og celle sammensetning avhengiganatomiske steder.

Selv innen en enkelt og spesialisert epitel, det regionale forskjeller. MOE er et slikt eksempel. MOE linjer ulike nesemusling, som er kompliserte og krøllet strukturer. På grunn av dem, ulike regioner av MOE oppleve forskjellige luftmengder, og dermed forskjellig diffusjon og clearance av luftbårne lukt molekyler 20. Dessuten er det kjent at olfactory sensoriske nevroner (OSNs) uttrykker en gitt lukt reseptor er plassert i en av fire omgått soner av MOE 21,22. Hvordan dette stedet forskjellen påvirker en OSN respons på odorants er i stor grad ikke kjent. I tillegg er noen OSN populasjoner viser regional preferanse. Guanylyl cyclase-D (GC-D)-uttrykker OSNs har sonale distribusjoner favoriserer de Cul-de-sac regioner av ectoturbinates 23,24. Flere nylig, fant vi en undergruppe av kanoniske OSNs som uttrykker transient receptor potential kanal M5 (trPM5) og fortrinnsvis er lokalisert i den laterale og ventrale regioner 25. Disse resultatene indikerer at MOE ikke er ensartet. Men hvordan er disse regionale forskjellene påvirker olfactory koding ikke forstått. Dette er delvis fordi grundig fysiologisk undersøkelse av MOE og nesen har vært begrenset av vanskelighetene med å skaffe intakt nasal epitel med bevart anatomisk organisasjon med dagens metoder.

Nasal epitel er hovedsakelig omgitt av fremre bein i skallen, inkludert nasal, maxilla, palatine, zygomatic, og ethmoid bein. Hos voksne mus og andre gnagere modeller, disse beina er hardt og vanskelig å fjerne uten å skade nært knyttet nasal vev, spesielt den delikate nesemusling. Ofte er kjemisk-baserte decalcification brukes til å myke bein å tillate frysesnitt av nasal vev for morfologiske, immunhistokjemiske, og in situ hybridisering studier, men avhengighetding av alderen på dyret, kan decalcification prosessen vare over natten opptil 7 dager 24,26-28. Denne behandlingen er også begrenset, fordi den krever vev være fiksativ-bevart. I tillegg kan kjemiske decalcification være harde og påvirke immunolabeling av enkelte sensitive antistoffer 29,30. For fysiologiske studier, er levende vev som kreves, og dermed er disse forsøkene ofte utført på isolerte OSNs eller MOE skiver hentet fra nyfødte som skallen bein er tynne og myke 17,31,32. Fysiologiske studier kan også benytte hele montere forberedelser ved å splitte hodet 25,33,34, men vanligvis bare den mediale overflaten av nesen er lett tilgjengelig, noe som begrenser fysiologiske innspillinger på andre områder.

Her beskriver vi en effektiv, manuell utbeining metode for å forberede intakte nasal vev med bevart opprinnelige anatomisk organisasjon og morfologi. Vi sekvensielt fjerne de store bein av fremrehodeskallen under en disseksjon mikroskop for å avsløre en nesten helt intakt nasal epitel samtidig som de tynne turbinate bein intakt med mindre musene er svært gamle og frysesnitt er nødvendig. Vi kan også utvide metoden for å bevare forbindelsen mellom den nasale vev og olfaktoriske pærer, samt resten av hjernen letter således samtidig undersøkelse av både perifere og sentrale kretser. Vår fremgangsmåte kan anvendes for å fremstille para-formaldehyd-fast, så vel som friske, levende nasal vev. Således er vår fremgangsmåte forventes å lette morfologiske, fysiologiske og immunhistokjemisk studier av respirasjon, luktesans, og nasal skade og sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Mus Nose Forberedelse

Vi brukte voksne C57BL / 6 bakgrunn mus i denne studien. Alle dyr omsorg og prosedyrer er godkjent av Animal Care og bruk Committees (IACUC) av University of Maryland, Baltimore County.

1.1 Anskaffelse av nesen fra paraformaldahyde-faste mus

Figur 1
Figur 1. Bein av en mus skallen A:. Dorsal visning av skallen B:. Ventral visning av hodeskallen med kjeven fjernet. Skallen ble utarbeidet fra en 40-dagers gammel mus. Individuelle bein er farget for bedre visualisering. Klikk her for å se større figur .

  1. Perfuse transcardially å fikse individuelle mus etter the protokoll for Lin, et al., (2008) 16. Kort fortalt var mus dypt bedøvet med tribromoethanol (Avertin 250 ug / g kroppsvekt), perfundert transcardially med 0,1 M fosfatbuffer (PB, 30-50 ml), fulgt av en fosfatbufret fikseringsmiddel inneholdende 3% paraformaldehyd, 19 mM L-lysin monohydroklorid, og 0,23% natrium-m-perjodat (ca. 35-50 ml). Man kan også følge trinnene i Jove artikkel for dyr perfusjon 35.
  2. Bruk en saks til å kutte av kjeven (eller underkjeven) og fjerne huden på hodet.
  3. Separer hele hodet fra resten av kroppen.
  4. Fjern ganen. Også, rense og fjerne den gjenværende bindevev og muskel på overflaten av skallen for å oppnå prøven vist i figurene 1A og 1B.
  5. Under en disseksjon mikroskop, fjerne skallen bein som dekker hjernen og olfactory pærer. Skjær av overflødig vev og bein. NeiTE, for den utvidede vev-preparat hvor hjernen og nese forblir tilkoblet, vil kun skallen bein fjernet. For immunhistokjemisk forsøkene var vevet post-løst i 1,5 timer og overført til 0,1 M fosfatbufret saltvann (PBS) med 25% sukrose over natten. Nasal vev bør holdes fuktet gjennom hele disseksjon ved å dyppe den i bufret sukroseløsning flere ganger.

1.2 Anskaffelse av nesen fra ferske euthanized mus

  1. Individuelle mus ble overført til et rent bur og utsettes for CO 2-gass, som ble fulgt ved halshugging 5 min etter den siste ånde. For å redusere blod i nesen vev, bruke en saks for å åpne brystet og kuttet hjerte til å la blodet renne.
  2. Gjenta trinn 1.1.2 til 1.1.5, bortsett fra den post-fiksering og kryobeskyttelse med 25% sukrose. Prøvestykket bør holdes fuktet og vedlikeholdes med Tyrode 's saltvann inneholdende (i mM): 140 NaCl, 5 KCl, MgCl 2 1, 1 2 CaCl, 10 pyruvat Na, 10 D-glukose, og 10 N-2-hydroksyetylpiperazin-N'-2-etansulfonsyre buffer (HEPES, justert ved pH 7,4). Alternativt kan brette et stykke Kimwipes, suge den med Tyrode oppløsning og fast under prøven mens dissekere og av og til dyppe prøven i Tyrode løsning eller slippe noen løsning på vevet for å holde den fuktet for å opprettholde levedyktigheten av celler og vev .

2. Fortann, Fremre Vomer og Maxilla Bone fjerning

  1. Starte fra en ventral synspunkt. Finn vomer bein og bryte vomer bein langs elva ved hjelp av en rongeur eller tang med tennene å bryte ventral meste av benet.
  2. Ved hjelp av taggete tang, fjerne de ødelagte delene av vomer bein ved å forsiktig utøver bein fragmenter fra vomeronasal organ (VNO). Notat, for mus mindre enn en måned gammel, eller om det bare er interessert i MOE, disse to steps kan hoppes over.
  3. Hold hodet fast med tang. Bruk rongeur å bryte den fremre delen av begge fortenner og leddet region av fremre overkjeve mellom de to fortennene og vomer benet.
  4. Bryt den ventrale del av høyre overkjeve ved området bare anteriort for zygomatic bue opp til nivået for den dorsale zygomatic plate.
  5. Flip over nesen for en dorsal synspunkt. Bruk rongeur å bryte høyre maxilla fremre av dorsal zygomatic plate. Hele høyre overkjeve anterior av zygomatic plate skal være løs. Bruk fin pinsett til forsiktig skille noen nasal vev underliggende maxilla, og deretter forsiktig løft bort bein fragment.
  6. Gjenta trinn 2.4 og 2.5 for å løsne venstre fortann og venstre fremre maxilla og fjerne dem etter nasal bein er fjernet.

3. Nasal bein og Dorsal Zygomatic Plate fjerning

  1. Bruk taggete pinsett eller rongeur å reflytte resten av frontpartiet bein bare kaudal til nasal bein. Etter å ha fjernet denne del av benet, kan den caudale delen av Nesebenet skal gripes ved hjelp av tenger.
  2. Bruk rongeur å bryte den fremre delen av zygomatic bue, som er koblet til zygomatic plate.
  3. Ta fine tang på den laterale kanten av dorsal slutten av zygomatic plate og forsiktig snu bein og fjerne det. Hvis benet ikke er løst, bruker den rongeur å klemme den forsiktig for å løsne den for fjerning.
  4. Bruk fin pinsett eller et barberblad for å løsne den mediale sutur mellom høyre og venstre nasal bein.
  5. Bruk taggete tang til å gripe kaudal slutten av nesen høyre bein. Forsiktig flytte bein fra side til side for å skille det fra underliggende vev. Det er nyttig å bevege tangen langs kaudal tredjedel av Nesebenet for bevegelse av benet side til side. Som Nesebenet skiller, sakte løfte beinet fra kaudal slutten.
  6. Mens than nasal bein er litt løftet, vippe benet sidelengs for å avsløre en lateral frembrudd av beinet som er foret med tynn respiratorisk epitel vev. Bruk fin pinsett til å forsiktig løsne denne vev fra nasal bein. Fortsett å løfte nasal bein. Når benet er helt atskilt fra underliggende vev, bruke saks til å klippe av nasal bein på rostral slutten.
  7. Gjenta trinn 3.1, 3.5 og 3.6 for fjerning av venstre nasal bein.
  8. Gjenta trinnene 3,2 og 3,3 for den venstre side av nesen.

4. Lateral Zygomatic Plate fjerning

  1. Fjern zygomatic plate én side om gangen. Enten zygomatic plate kan fjernes først.
  2. Fra en ventral synspunkt, bryte maxilla dårligere til zygomatic arch før pause når zygomatic arch.
  3. Fra en dorsal synspunkt, forsiktig ta tak i zygomatic bue og løft fremover og sideveis. Hvis zygomatic plate er fortsatt knyttet til noen vev, ta den finepinsett og forsiktig kutte forbindelsene mellom vev og bein.
  4. Gjenta for zygomatic plate på den andre side av nesen.

5. Orbit Bone fjerning

  1. Fra en ventral synspunkt, bryte Palantine bein mellom jekslene i nesen.
  2. Bruk rongeur å bryte de 3 jeksler og overkjeve på hver side av nesen.
  3. Bryte og fjerne eventuelle gjenværende tykke stykker av bein ventrale og posteriort for nesemusling på hver side av nesen.

6. Ethmoid Bone fjerning

  1. Bryte noen del av ethmoid bein som stikker kaudal til nesemusling. Dette er nødvendig for å unngå tap av turbinate vev ved fjerning av tynne stykker av ethmoid bein dekker nesemusling.
  2. For høyre side av nesen, plasserer fin pinsett på fremre kant av ethmoid bein og forsiktig ut. Hvis en del av beinet fortsatt, gjenta denne prosedyren til alleden tynne bein dekker nesemusling er fjernet. De turbinate bein trenger ikke å bli fjernet i de fleste av forberedelsene. I eldre mus, blir cribriform plate sprø. Hvis frysesnitt av nasal vev er nødvendig, fjerne små stykker av platen med fin pinsett for å redusere potensiell skade forårsaket av benet.
  3. Gjenta trinn 6.2) for den venstre side av nesen.
  4. Fjern eventuelle gjenværende bein fragmenter før snitting. Merk: i dyr mer enn et år gammel, den posterodorsal regionen av septum bein er litt tykk og hard. Man kan fjerne denne delen bruker fine tang. Før spissen tang inn i begge sider av benet for å separere den dorsale delen av septum ben og slimhinnen epitelvev. Bruk en pinsett til å ta tak i beinet og hold prøven. Bruk en annen pinsett til å bryte den øvre benete delen fra nedre brusk delen av septum og forsiktig fjerne det.

  1. Sett opp vifte vakuumpumpe.
  2. Plasser nesen i en embedding mold. Senk nesen i oktober media.
  3. Bruk en støvsuger for å fjerne luftbobler fanget i nesen vev. Denne prosessen tar opp til 5 min.
  4. Etter fjernelse av luftbobler, sett vev i den ønskede orientering.
  5. Fryse oktober og vev i formen ved hjelp av tørris. Den innebygde vev kan deretter cryosectioned umiddelbart eller lagret ved -80 ° C for fremtidig bruk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjelp av denne metoden kan vi sikkert få nesten helt intakt nasal vev. Figur 2A viser et bilde av voksen nasal prøven fra en Paraformaldehyde-fast hode. I denne prøven, alle fire sub-olfactory sensoriske organer, inkludert MOE, septal organ, Gruneberg ganglion, og VNO, er intakte. Dessuten er det respiratoriske epitel og subepithelial vev, for eksempel kjertler og fartøy, bevart. Vi har med hell brukt denne metoden i en rekke studier der vi undersøkte morfologi, distribusjon, nerve innervasjon, og celle markør uttrykk i ulike spesialiserte sensoriske celle populasjoner 16,17,36-38.

Figur 2B viser et eksemplar med hjernen, olfactory pærer, og nese sammen. Denne utvidede preparatet er spesielt nyttig i studier som krever nerve forbindelse mellom det perifere og sentrale olfactory systemer. Vi laget denne prøven ved å fjerne skallen bein surrounding hjernen før fjerning av benene i ansiktet. Våre utvidede metoden gjør etterforskerne til å utføre eksperimenter på både perifer og sentral luktsystemet i en enkelt forberedelse.

Den nasale vev vist på figur 2 kan brukes til hel-mount observasjon, samt for fremstilling av vevssnitt. Figur 3A viser et horisontalt snitt snitt gjennom både Moe og respiratoriske regioner. Figur 3B viser en seksjon koronale skjære gjennom midten av MOE. Vi farget delene med nøytral rødt for en bedre oversikt over ulike typer epitel og submukøst strukturer på ulike anatomiske steder. Disse resultatene viser at vår teknikk bevarer selv den delikate MOE turbinate struktur og anatomiske organisering av nesen, som gjør omfattende og komparativ undersøkelse av nasal morfologiske og funksjonelle endringer under normale og patologiske forhold.

Figur 2
Figur 2. Isolert nasal og hjernevev A:.. Dorsal visning av intakt nese vev dissekert bruke vår utbeining metode B:. Dorsal visning av en nese og hjerne med nevrale forbindelser mellom sentrale og perifere olfactory systemer intakt Klikk her for å se større figur .

Figur 3
Figur 3. Deler av nasal vev a:.. Viser et horisontalsnitt olfactory og respiratorisk epitel samt andre nasale strukturer B: koronale snitt gjennom turbinates of MOE i det posteriore av nesen. Begge deler var 14 mikrometer tykk og farget med nøytral rød MOE:. Hoved lukteepitelet RE:.. Respiratory epitel Klikk her for å se større figur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her viste vi en trinn-for-trinn prosedyre for å isolere intakt olfactory og respiratorisk vev fra mus nesen ved sekvensielt å fjerne de omkringliggende bein mens sparsom vevet under. Vi viser at forsiktig bein fjerning kan bevare selv de mest delikate vev i sin helhet. Vi deler også innsikt i eventuelle endringer i denne teknikk, der vi isolerer både i hjernen og nese vevet sammen for å bevare nerve forbindelsen. Denne nye metoden gir et middel for å isolere hele olfactory og respiratorisk vev i et enkelt eksemplar for videre bearbeiding i immunhistokjemisk, RNA in situ hybridisering, og fysiologiske eksperimenter.

Fordeler med Bone fjerning

Før vår metode, ble avkalkingspreparater vanligvis brukes til å myke bein for vev seksjonering og immunhistokjemi. Imidlertid, avhengig av størrelsen av benet og alderen til dyrene, avkalkingkan være en langvarig prosess som krever vev inkubasjon i bein decalcifiers i timer eller flere dager 29,30. Agentene brukte også inneholder syrer, som kan ha effekter på vev som kan endre eller hindre immunolabeling 29,30. For å bekjempe dette, noen forskere bruker etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) løsning for å beslaglegge kalsiumioner fra beinet 24,26-28. Denne metoden for decalcification krever også dager. Disseksjonen vist her kan utføres i omtrent 20-30 min og krever ikke anvendelse av noen kjemiske løsninger som kan endre stainability av vev.

Vår fremgangsmåte kan også brukes for å oppnå intakt nasal vev fra ferskt dissekert neser, og gir en fordel for oppnåelse av levende vev for fysiologiske opptak. For eksempel nese skiver ofte brukt for Ca 2 + avbildning av OSNs og støtte celler i lukteepitelet 31,32. Disse sektorene må værefremstilt av neonatal mus før bein rundt vev herdet. Men neonatal prøver er ikke identisk med voksne fordi lukteepitelet fortsetter utvikling og modning fødselen. Ved hjelp av vår metode, kan forskerne få intakt olfactory vev fra mus eldre enn neonatal aldre. Dette utgjør et betydelig fordel, spesielt i studier av aldersavhengige endringer.

Modifikasjoner og feilsøking

Vi viste en effektiv fremgangsmåten for å fjerne omkringliggende bein. Men det er andre sekvenser av bein fjerning for å få intakte nasal vev, og den trinnvise prosedyren kan endres avhengig av individuelle behov forsker og vev av mest interesse. For eksempel, hvis VNO er ​​nødvendig, bør vomer ben fjernes tidlig i prosessen fordi det er flere ben-dekkede områder for å ta tak for å holde vevet i ønsket sted under fjerning. Ved tilpasningting prosedyren for hver applikasjon, vev av interesse er mer sannsynlig å forbli intakt for videre behandling. Den nasale ben har også en tendens til å være vanskelig å fjerne, som vevet under klynger seg til ben og vil ofte rive som bein blir løftet bort. I tillegg til å vrikke nasal bein som vist i videoen, kan små tang være forsiktig inn mellom Nesebenet og det underliggende vevet for å bidra til å bevege vevet ned og bort fra skjelettet under fjerning.

Disseksjon varierer også noe avhengig av alder av musene. I unge mus, bein tendens til å være mykere, mens bein av eldre mus er mer sprø og sterkt smeltet til nabolandet bein i enkelte regioner. Mykt ben er lettere å skille og å fjerne i små biter hardere enn ben. Denne forskjellen kan lett overvinnes ved hjelp av pinsett å score eller skrape på sammenhenger mellom beina til hjelp i deres separasjon og fjerning. I eldre dyr, posterodorsal region av septum er litt tykk og hard og bør fjernes før frysesnitt. Den ben-delen av septum kan fjernes som beskrevet i fremgangsmåte 6.4. Selv om det er små forskjeller i disseksjon for eldre og yngre mus, er alder ikke en begrensende faktor. I våre studier har vi lykkes forberedt intakt nasal vev fra mus som strekker seg fra 14 dager til to år gammel.

Det er ingen vesentlig forskjell mellom de dissekere trinnene som brukes for festing-fast nese og for frisk nese selv om den friske vevet er mykere og krever mer forsiktig manipulasjon. I begge preparater, holde vevet fuktes under disseksjonen er viktig. Det er ikke nødvendig å utføre den friske vev disseksjon i bufret saltløsning imidlertid periodisk dyppe vevet i Tyrode løsning eller drypper oppløsningen på vevet samtidig dissekere er kritisk som det vil holde vevet fuktes og næringsstoff tilføres opprettholde sin viability.

Fremgangsmåten presentert her kan bli ytterligere modifisert for å inkludere ben fjerning som forlater både hjerne og nese intakt i en enkelt prøve (figur 2B). Denne endringen sparer nerve forbindelser mellom hjernen og nese som passerer gjennom cribriform plate. Mer tekniske ferdigheter og tid er nødvendig for dette disseksjon enn nesen alene. Imidlertid bevare forbindelsene fra periferien til hjernen gir flere forskjellige anvendelser av denne fremgangsmåte.

Begrensninger

Vi har brukt denne metoden til å forberede nasal vev for en rekke studier, inkludert immunhistokjemisk merking og mRNA in situ hybridisering analyse, og har nå merket mange proteiner i signalveier, farget celle markører i ulike celle populasjoner, og undersøkt morfologiske funksjoner og celle distribusjon gjennom nesehulen 16,17,36-39. Vi gjorde ikke experience begrensninger i frysesnitt og immunolabeling. For studier som krever frysesnitt av den utvidede forberedelse som holder hjernen og nasal vev koblet i et enkelt eksemplar, anbefaler vi å bruke mus yngre enn fire måneder siden i eldre mus den skjøre cribriform plate kan lage vev skade under seksjonering. Men for frisk vev beregnet for elektrofysiologiske opptak, mediale vev mellom nesemusling er ikke lett tilgjengelig i hele mount forberedelse. Fjerning av små biter av vev eller splitting i diskrete regioner kan overvinne problemet. Fordi konvensjonell elektro-olfactogram er gjort på den mediale overflaten av endo-nesemusling 25,33,34, kan vår vev forberedelse tillate opptak fra andre regioner med lite manipulasjon.

Applikasjoner utover Immunohistochemistry

Mange anvendelser av prosedyren finnes for de som har mestret teknikken. Mulig applicationer inkluderer sonale studier på olfactory og luftveier vev som, ved hjelp av andre metoder, har vært vanskelig å få intakt og i sin opprinnelige anatomisk konfigurasjon. Søknader også finnes for elektrofysiologi ved å tillate samtidige flere-opptak på hele, friske vev. Noen av disse anvendelser, som var vanskelig å utføre ved hjelp av eksisterende teknikker, som er gjort mulig ved vår utbeiningen metode. Videre kan denne protokollen også tilpasses biokjemiske, genomisk og proteomikk studier som krever konsekvent prøvetaking på ulike områder for kritisk sammenligning.

Oppsummert har vi utviklet en prosedyre for å raskt og pålitelig tilgang til olfactory og luftveier vev i musen nesen ved å fjerne de omkringliggende bein. Denne fremgangsmåte har betydelige fordeler fremfor vanlige teknikker slik som avkalking. Videre krever vår metode ingen kjemisk behandling, og derfor er vev ikke er begrenset til bruk i immunohistochemistry eksperimenter, men kan også være aktuelt for in situ hybridisering og fysiologiske studier. Dermed er vår metode en raskere, mer direkte måte å forberede musen nese for videre behandling. Vi forventer vår metode vil lette olfactory og luftveier studier i nasale regioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler (NIH / 009269 NIDCD, 012831 og Arra administrative supplement NIH tilskudd) til Weihong Lin. Vi vil spesielt takke Mr. Tim Ford på UMBC for sin teknisk bistand i videoopptak og bearbeiding. Vi ønsker også å takke Dr. Daphne Blumberg, Ms Chere Petty på UMBC og Mr. Nicholas McCollum fra Olympus America Inc. for deres utstyr assistanse i videotaping.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection
Rongeur, 1.0 mm Jaw width World Precision Instruments (WPI) 501333
Fine forceps, Dumont 3 WPI 503235
Fine forceps, Dumont 55 WPI 14099
Fine forceps, Dumont AA Fine Science Tools (FST) 11210-20
Specimen forceps, Serrated VWR 82027-440
Operating scissors WPI 501753
Iris scissors, Straight Miltex V95-304
Dissection microscope Olympus SZ40
Name Company Catalog Number Comments
Tissue embedding
Optimum cutting temperature (OCT) compound Sakura Finetek 4583
Plastic embedding mold VWR 15160-215
Aspirator vacuum pump Fisher Scientific 09-960-2
Name Company Catalog Number Comments
Section staining
Neutral red ACROS Organic CAS 553-24-2 Nuclei staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naclerio, R. M., Pinto, J., Assanasen, P., Baroody, F. M. Observations on the ability of the nose to warm and humidify inspired air. Rhinology. 45, 102-111 (2007).
  2. Bjermer, L. The nose as an air conditioner for the lower airways. Allergy. 54, Suppl 57. 26-30 (1999).
  3. Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
  4. Bryant, B., Silver, W. L. Chemisthesis: The common chemical sense. 2nd, Wiley-Liss. (2000).
  5. Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice. J. Anat. 135, 83-88 (1982).
  6. Halpern, M. The organization and function of the vomeronasal system. Annu. Rev. Neurosci. 10, 325-362 (1987).
  7. Rodolfo-Masera, T. Su l'esquoestizenza di un particulare organo olfacttivo nel setto nasale della cavia e di altri roditori. Arch. Ital. Anat. Embryol. 48, 157-212 (1943).
  8. Levai, O., Strotmann, J. Projection pattern of nerve fibers from the septal organ: DiI-tracing studies with transgenic OMP mice. Histochemistry and Cell biology. 120, 483-492 (2003).
  9. Storan, M. J., Key, B. Septal organ of Gruneberg is part of the olfactory system. J. Comp. Neurol. 494, 834-844 (2006).
  10. Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice. Horm. Behav. 46, 247-256 (2004).
  11. Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell Mol. Life Sci. 63, 1465-1475 (2006).
  12. Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).
  13. Finger, T. E., St Jeor, V. L., Kinnamon, J. C., Silver, W. L. Ultrastructure of substance P- and CGRP-immunoreactive nerve fibers in the nasal epithelium of rodents. J. Comp. Neurol. 294, 293-305 (1990).
  14. Papka, R. E., Matulionis, D. H. Association of substance-P-immunoreactive nerves with the murine olfactory mucosa. Cell Tissue Res. 230, 517-525 (1983).
  15. Baraniuk, J. N., Kim, D. Nasonasal reflexes, the nasal cycle, and sneeze. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 105-111 (2007).
  16. Lin, W., Ogura, T., Margolskee, R. F., Finger, T. E., Restrepo, D. TRPM5-expressing solitary chemosensory cells respond to odorous irritants. J. Neurophysiol. 99, 1451-1460 (2008).
  17. Ogura, T., et al. Cholinergic microvillous cells in the mouse main olfactory epithelium and effect of acetylcholine on olfactory sensory neurons and supporting cells. J. Neurophysiol. 106, 1274-1287 (2011).
  18. Finger, T. E., et al. Solitary chemoreceptor cells in the nasal cavity serve as sentinels of respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8981-8986 (2003).
  19. Gulbransen, B. D., Clapp, T. R., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. Nasal solitary chemoreceptor cell responses to bitter and trigeminal stimulants in vitro. J. Neurophysiol. 99, 2929-2937 (2008).
  20. Zhao, K., Dalton, P., Yang, G. C., Scherer, P. W. Numerical modeling of turbulent and laminar airflow and odorant transport during sniffing in the human and rat nose. Chemical Senses. 31, 107-118 (2006).
  21. Ressler, K. J., Sullivan, S. L., Buck, L. B. A zonal organization of odorant receptor gene expression in the olfactory epithelium. Cell. 73, 597-609 (1993).
  22. Vassar, R., Ngai, J., Axel, R. Spatial segregation of odorant receptor expression in the mammalian olfactory epithelium. Cell. 74, 309-318 (1993).
  23. Fulle, H. J., et al. A receptor guanylyl cyclase expressed specifically in olfactory sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 3571-3575 (1995).
  24. Juilfs, D. M., et al. A subset of olfactory neurons that selectively express cGMP-stimulated phosphodiesterase (PDE2) and guanylyl cyclase-D define a unique olfactory signal transduction pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 3388-3395 (1997).
  25. Lin, W., Arellano, J., Slotnick, B., Restrepo, D. Odors detected by mice deficient in cyclic nucleotide-gated channel subunit A2 stimulate the main olfactory system. The Journal of Neuroscience: The Official journal of the Society for Neuroscience. 24, 3703-3710 (2004).
  26. Ishii, T., Omura, M., Mombaerts, P. Protocols for two- and three-color fluorescent RNA in situ hybridization of the main and accessory olfactory epithelia in mouse. J. Neurocyt. 33, 657-669 (2004).
  27. Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X., Ma, M. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chemical Senses. 34, 695-703 (2009).
  28. Packard, A., Schnittke, N., Romano, R. A., Sinha, S., Schwob, J. E. DeltaNp63 regulates stem cell dynamics in the mammalian olfactory epithelium. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 8748-8759 (2011).
  29. Matthews, J. B., Mason, G. I. Influence of decalcifying agents on immunoreactivity of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Histochem J. 16, 771-787 (1984).
  30. Athanasou, N. A., Quinn, J., Heryet, A., Woods, C. G., McGee, J. O. Effect of decalcification agents on immunoreactivity of cellular antigens. J. Clin. Pathol. 40, 874-878 (1987).
  31. Hegg, C. C., Irwin, M., Lucero, M. T. Calcium store-mediated signaling in sustentacular cells of the mouse olfactory epithelium. Glia. 57, 634-644 (2009).
  32. Spehr, M., et al. Essential role of the main olfactory system in social recognition of major histocompatibility complex peptide ligands. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 1961-1970 (2006).
  33. Ma, M., Chen, W. R., Shepherd, G. M. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J. Neurosci. Methods. 92, 31-40 (1999).
  34. Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording. J. Vis. Exp. (37), e1850 (2010).
  35. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  36. Lin, W., Margolskee, R., Donnert, G., Hell, S. W., Restrepo, D. Olfactory neurons expressing transient receptor potential channel M5 (TRPM5) are involved in sensing semiochemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2471-2476 (2007).
  37. Lin, W., Ezekwe, E. A., Zhao, Z., Liman, E. R., Restrepo, D. TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium. BMC Neurosci. 9, 114 (2008).
  38. Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells. PLoS One. 5, e11924 (2010).
  39. Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. Expression profile of G-protein βγ subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).

Comments

1 Comment

  1. dear David dunston,
    I would appreciate to be able to visualize your dissection method.Thanking you by advance, best regards, Patricia Duchamp-Viret

    Reply
    Posted by: Patricia D.
    February 4, 2014 - 5:31 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats