Mont entiers immunofluorescence de la rétine de souris néonatal chargé d'enquêter sur l'angiogenèse

Neuroscience

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Summary

La rétine murin néonatal fournit un modèle physiologique bien caractérisé de l'angiogenèse, qui permet à des enquêtes sur les rôles des différents gènes ou des médicaments qui modulent l'angiogenèse dans un

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Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. J. Vis. Exp. (77), e50546, doi:10.3791/50546 (2013).

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Abstract

L'angiogenèse est le processus complexe de la formation de nouveaux vaisseaux sanguins défini par la germination de nouveaux vaisseaux sanguins à partir d'un réseau de vaisseaux préexistants. L'angiogenèse joue un rôle essentiel non seulement dans le développement normal des organes et des tissus, mais aussi dans de nombreuses maladies dans lesquelles la formation de vaisseaux sanguins est déréglée, comme le cancer, la cécité et les maladies ischémiques. Dans la vie adulte, les vaisseaux sanguins sont généralement repos si l'angiogenèse est une cible importante pour le développement de médicaments nouveaux pour essayer de réguler la formation de nouveaux vaisseaux spécifiquement dans la maladie. Afin de mieux comprendre l'angiogenèse et d'élaborer des stratégies appropriées pour réglementer cela, les modèles sont nécessaires, qui reflètent avec précision les différentes étapes biologiques qui sont impliqués. La rétine de la souris néonatale constitue un excellent modèle de l'angiogenèse, car les artères, les veines et les capillaires se développent pour former un plexus vasculaire au cours de la première semaine après la naissance. Ce modèle a également l'avantage d'avoir un deux-didimensionnelle (2D) la structure qui rend l'analyse directe par rapport à l'anatomie 3D complexe d'autres réseaux vasculaires. En analysant le plexus vasculaire rétinienne à différents moments après la naissance, il est possible d'observer les différentes étapes de l'angiogenèse sous le microscope. Cet article montre une procédure simple pour analyser la vascularisation de la rétine de la souris en utilisant une coloration fluorescente avec des anticorps spécifiques isolectine et vasculaire.

Introduction

L'angiogenèse est un processus complexe du développement définie par la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir d'un réseau de vaisseaux préexistants et est réglementé par plusieurs voies de signalisation. Le plus important d'entre eux est la voie du VEGF. VEGF est libéré par les cellules ischémiques et conduit à l'initiation de la germination angiogénique dans les vaisseaux sanguins avoisinants. Les cellules endothéliales de premier plan à partir d'une nouvelle pousse vasculaire est une cellule «pointe», qui produit filopodes qui atteignent en direction de la source de VEGF, et est suivie par des cellules endothéliales proliférantes "tige". De cette façon, les cellules endothéliales activées migrent et prolifèrent vers une région avasculaire où ils forment de nouveaux tubes vasculaires. Afin de stabiliser ces tubes pour soutenir la circulation sanguine, les cellules endothéliales interagissent avec les péricytes et les cellules musculaires lisses qui entourent les nouveaux vaisseaux sanguins 1. L'angiogenèse est essentielle pour la vascularisation de l'embryon et des tissus en croissance. Cependant, il contribue également à de nombreux pathologiqueques troubles tels que le cancer, tandis que les défauts de l'angiogenèse sont associés à des maladies ischémiques. Le développement de traitements médicamenteux efficaces pour réguler l'angiogenèse comme un moyen de traiter la maladie est donc d'un grand intérêt. Par exemple, les facteurs anti-angiogéniques efficaces réduiront la croissance du cancer, tandis que les stratégies pro-angiogéniques peuvent être utilisés pour traiter la maladie ischémique. Ainsi, les modèles d'angiogenèse sont essentielles pour mieux comprendre la régulation de la formation de nouveaux vaisseaux et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer ou diminuer la croissance vasculaire.

Un élément fondamental de la recherche sur l'angiogenèse est le choix d'un modèle vasculaire approprié. Plusieurs modèles in vitro ont été conçus pour reproduire les étapes de base de l'angiogenèse tels que la migration cellulaire endothéliale, la prolifération et la survie 2,3. Un fréquemment utilisé dans l'essai in vitro est la formation d'un réseau ramifié de cellules endothéliales sur une matrice de Matrigel, même si tson n'est pas spécifique des cellules endothéliales, ni intègrent généralement le soutien de péricytes ou des cellules musculaires lisses. L'évaluation de l'angiogenèse germination ex vivo à l'aide de cultures d'organes de souris telles que le dosage de corps embryoïdes, le dosage de l'anneau aortique et le dosage du métatarse foetal permet l'analyse de l'angiogenèse des cellules endothéliales dans le cadre de cellules de soutien supplémentaires. Cependant, les principales limites de ces essais comprennent le manque de flux sanguin et la régression des navires de plus de temps, ce qui donne une fenêtre limitée pour l'analyse. Par conséquent, pour comprendre la régulation de l'angiogenèse avec plus de précision, dans des modèles in vivo sont nécessaires tels que ceux développés chez la souris en utilisant des éponges sous-cutanée implantés ou des bouchons matrigel, ainsi que le modèle d'ischémie des membres postérieurs. Cependant, ces modèles sont difficiles à analyser en raison de l'architecture 3D complexe du néovaisseaux. En revanche, l'embryon de poisson zèbre s'est avéré un excellent modèle pour l'angiogenèse visualiser dans l'ensembleorganisme 4. Toutefois, la souris est évolutif beaucoup plus étroitement lié à l'homme que le poisson-zèbre, rendant le modèle préféré dans de nombreux cas la souris. Par conséquent angiogenèse de la rétine postnatal de la souris représente une méthode bien caractérisé de choix pour la recherche sur l'angiogenèse. Il fournit non seulement un paramètre physiologique, mais aussi un plexus vasculaire 2D qui peuvent être facilement visualisées en utilisant des colorants fluorescents appropriés. L'architecture du réseau de vaisseaux, de la prolifération endothéliale, la germination, le recrutement des cellules périvasculaires et le remodelage vasculaire peuvent tous être étudiée en utilisant cette technique.

Dans la rétine néonatale de la souris, le développement des vaisseaux sanguins de la rétine se produit dans la première semaine de vie postnatale. Souris, contrairement aux humains, naissent aveugles et les rétines ne deviennent vascularisée après la naissance. Vaisseaux rétiniens surgissent du centre de la fermeture de la rétine au nerf optique à jour postnatal 0 (P0), et se développent par l'angiogenèse pour former un très organisentd plexus vasculaire qui atteint la périphérie de la rétine d'environ 5 P8. Les vaisseaux sanguins se développent d'une manière caractéristique avec le plexus capillaire croissant progressivement vers l'extérieur du disque optique vers la périphérie pour générer un modèle alternatif régulier des artères et des veines avec un réseau capillaire d'intervenir. La vascularisation rétinienne est un modèle idéal pour étudier l'angiogenèse que les navires peuvent être facilement identifiés à mesure qu'ils grandissent dans ce qui est essentiellement un plan 2D, ce qui rend relativement facile d'examiner la vascularisation rétinienne dans les préparations plate-montage 5. Procédé pour isoler la rétine néonatale de la souris pour l'analyse des réponses des cellules endothéliales de bout de plusieurs heures ex vivo a été rapporté 6. Sinon, un examen plus détaillé de l'ensemble du système vasculaire rétinienne et des marqueurs vasculaires associées nécessite immunologique des spécimens de la rétine fixes à différents stades de développement.

Ici, nous fournissonsune description détaillée d'une méthode fiable et techniquement simple que nous utilisons pour toute coloration de montage de la murine rétinienne plexus vasculaire, de l'énucléation initiale de l'œil postnatal (voir aussi 7) à travers les protocoles de coloration à l'imagerie finale sous le microscope.

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Protocol

Toutes les étapes sont réalisées à température ambiante, sauf indication contraire.

1. Énucléation et la fixation des Yeux postnatale

  1. Placez la souris euthanasiés chiot de son côté, enlever la peau qui recouvre l'œil avec des ciseaux.
  2. Utilisez des ciseaux et des pinces pour énucléer l'œil.
  3. Placez les ciseaux sous l'œil énucléé, couper le nerf optique et des tissus environnants et soulever l'œil. Transfert à une plaque de 24 puits contenant du paraformaldéhyde 4% (PFA) constitué en 2x PBS à température ambiante.
  4. Permettre à chaque œil pour fixer pendant 10 - 15 min, puis transfert à froid 2x PBS sur la glace pendant 5 - 10 min. Il est préférable d'échelonner les énucléations et la fixation subséquente à assurer le degré de fixation est égale pour chaque œil.

2. Dissection de rétines murins postnatale

  1. Transfert yeux dans une boîte de Pétri contenant 2x PBS à l'aide d'une pipette Pasteur en plastique qui a été coupé pour élargir l'alésage et le placez sous une dissection du microscope.
  2. Enlevez tout le gras autour de l'œil en utilisant des pinces et ciseaux.
  3. Pierce au bord de la cornée avec des ciseaux pointus et coupez autour de la cornée et de l'iris et le jeter.
  4. Insérez forceps entre la rétine et la sclérotique et enlever la sclérotique en prenant soin de ne pas déchirer la rétine. La couche choroïde peut également être retiré, mais si il ya un risque de dommages à la rétine survenant au cours de cette étape, la couche choroïde peut être laissé sur que cela ne devrait pas affecter de manière significative la qualité de l'immunomarquage.
  5. Retirez la lentille et l'humeur vitrée aide d'une pince.
  6. Retirez les vaisseaux de hyaloids en les rassemblant dans le centre de l'œil avec une pince fine, puis rapidement se détacher du centre de la rétine (alternativement snip à la base des navires hyaloid avec des ciseaux fins).
  7. Rincer la rétine en forme de cuvette avec du PBS dans une boîte de Petri propre.
  8. Ajouter 4 à 5 incisions radiaires atteignant environ 2/3 du rayon de la rétine à l'aide de ressort scissors pour créer une forme de «pétale».
  9. Prélever de PBS à l'aide d'une pipette Pasteur pour aplatir la rétine, puis enlever l'excédent PBS avec un petit morceau de papier absorbant.
  10. Lentement pipette froid (-20 ° C) baisse de méthanol à goutte sur la surface de la rétine jusqu'à totalement couvert puis inondation avec du méthanol supplémentaire. Cela aidera à fixer les rétines et facilitera la perméabilisation. Les rétines deviennent blancs.
  11. Transférer dans un tube de 2 ml à l'aide d'une pipette Pasteur plastique qui a été coupée pour élargir l'alésage.
  12. Laisser rétine dans le méthanol froid pendant au moins 20 min avant de procéder à immunomarquage. Parmi les anticorps utilisés ici, seulement la VE-cadhérine ne peut pas être utilisée avec succès sur des rétines fixes de méthanol. Dans ce cas rétines doivent procéder directement à immunologique après l'étape 9.
  13. Si nécessaire, la rétine peut être stocké dans le méthanol à -20 ° C pendant plusieurs mois avant la coloration.

3. Immuno / coloration isolectine de la rétine Vasculature

  1. Retirez délicatement / versez le méthanol et rincer doucement rétines brièvement dans du PBS (à ce stade, la rétine est toujours dans le même tube de 2 ml de l'étape 11 ci-dessus).
  2. Retirer du PBS et couverture rétines avec 100 pi de solution de Perm / Block (PBS + 0,3% de Triton + 0,2% BSA) + 5% de sérum approprié (voir tableau 1) et agiter doucement pendant 1 heure.
  3. Retirer Perm / Bloquer et incuber rétines en agitant doucement la nuit à 4 ° C avec 100 pi d'anticorps primaires (voir le tableau 1) et / ou IsolectinB4, tous préparés par dilution dans Perm / Block.
  4. Eliminer l'anticorps / isolectine et laver rétines 4 x 10 min dans du PBS + 0,3% de Triton (PBSTx).
  5. Dans certains cas, par exemple après coloration avec IsolectinB4-Alexa488 ou un anticorps primaire directement conjugué, un anticorps secondaire n'est pas obligatoire et la rétine peut être monté directement (étape 7). Quand un anticorps primaire non conjugué a été utilisé dans l'étape 3, puis 100 ml de l'fluor appropriéanticorps secondaire escent (dilué à 1/200 dans PBSTx) est ajouté et laissé à incuber pendant la nuit à 4 ° C ou pendant 4 heures à température ambiante.
  6. Eliminer l'anticorps secondaire et laver rétines 4 x 15 min dans 2 ml PBSTx.
  7. Transfert rétines sur des lames en utilisant un large trou en plastique pipette Pasteur et enlever l'excédent PBSTx avec le tissu absorbant. Mont rétines en ajoutant 50 pl de milieu de montage Prolongez sur une lamelle et la position doucement sur la rétine.
  8. Transfert glisse au réfrigérateur pendant la nuit à 4 ° C, en s'assurant qu'ils sont bien à plat et à l'abri de la lumière, afin de permettre le prolonger milieu de montage pour valider.
  9. rétine de l'image à l'aide d'un microscope confocal ou d'un microscope à épifluorescence.

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Representative Results

Après dissection de la rétine devrait ressembler à une fleur plat (Figure 1). En utilisant le protocole décrit ci-dessus, les cellules endothéliales peuvent être vus à l'aide isolectine coloration B4-Alexa488 et en soutenant les cellules musculaires vasculaires sont visualisés à l'aide anti-alpha actine musculaire lisse (Figure 2). Le point de vue de faible puissance utilisant un objectif 5X dans la figure 2 permet une vue d'ensemble de l'organisation vasculaire de la rétine. En outre, en utilisant une combinaison différente d'anticorps donnés dans le protocole ci-dessus, les cellules endothéliales peuvent être vus à l'aide immunomarquage anti-CD31 et pericytes appui sont vu en utilisant des anticorps contre NG2 (figure 3) ou desmine (Figure 4). Coloration anti-desmine est utile pour visualiser le doigt comme processus de péricytes et déterminer si elles sont étroitement associées aux cellules endothéliales. En revanche, la coloration anti-NG2 décrit les noyaux de chaque pericyte, ce qui est utile lorsquequantifier le nombre de cellules péricytes sur le système vasculaire. Cela se ferait par le nombre de cellules par champ de vision avec une puissance élevée (par exemple 60X) objectif de comptage. Si nécessaire, d'autres combinaisons d'anticorps peuvent également être utilisés (voir tableau 1), par exemple, anti-collagène IV est utile pour visualiser la membrane basale vasculaire. Rétines qui ont été colorés pour les cellules endothéliales peuvent être analysés pour principales caractéristiques de l'angiogénèse telles que la progression de la vascularisation du centre vers le bord de la rétine, la densité vasculaire et le récipient fréquence de ramification.

Figure 1
Figure 1. Apparition d'une rétine néonatale immédiatement après la dissection et l'addition de méthanol. Cette image est prise en utilisant un Zeiss Stemi SV6 et Axiocam RH appareil photo c.

Figure 2
Figure 2. Immunocoloration de toute la montagne rétines (âge P7) avec isolectine B4-Alexa488 (vert) (A), anti-alpha-actine musculaire lisse Cy3 (rouge) (B) ou fusionnée (C). Ces images sont prises avec un axioimager Zeiss et caméra Axiocam HRm l'aide d'un objectif 5x. Notez que le modèle alternatif des artères et des veines. Les artères sont reconnus par la zone franche capillaire qui les entoure immédiatement, et sont revêtues de cellules musculaires lisses qui se colorent positif (rouge) pour l'alpha actine musculaire lisse. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Figure 3 Double immunomarquage de toute la montagne rétines (âge P6) avec l'anticorps primaire anti-CD31 (détecté avec IgG anti-rat conjugué à Alexa488, vert, A);. Et anticorps primaire anti-NG2, détectée avec IgG anti-lapin conjugué à Alexa 594 (rouge, B). Ces images confocale ont été prises avec un objectif 60X combinant laser numérisation d'images à partir de 13 z tranches, chacune de 0,47 um d'épaisseur. Une superposition d'images dans C montre des cellules endothéliales CD31-positifs (vert) et pericytes NG2-positif (rouge). Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 4
Figure 4 Double immunomarquage de toute la montagne rétines (âge P6) avec l'anticorps primaire anti-CD31 (détecté avec IgG anti-rat conjugué à Alexa488, vert, A);. Et anticorps primaire anti-desmine, détectée avec IgG anti-lapin conjugué à Alexa 594 (rouge, B). Ces images confocale ont été prises avec un objectif 60X combinant laser numérisation d'images à partir de 21 z tranches, chacune de 0,24 um d'épaisseur. Une superposition d'images dans C montre des cellules endothéliales CD31-positifs (vert) et pericytes desmin positif (rouge). Cliquez ici pour agrandir la figure .

<td> Bloc de Perm seulement
Anticorps primaire Dilution de travail Une solution de blocage (sérum + Perm / Block) Anticorps secondaire
Anti-NG2 (chondroïtine sulfate protéoglycanes) 1:250 De sérum de chèvre de 5% Chèvre anti-lapin Alexa 594
Anti-GFAP 1:500 De sérum de chèvre de 5% Chèvre anti-souris Alexa 488
Anti-Desmin 1:500 De sérum de chèvre de 5% Chèvre anti-lapin Alexa 594
Anti-collagène IV 1:200 De sérum de chèvre de 5% Chèvre anti-lapin Alexa 594
Anti-Endoglin 1:100 De sérum de chèvre de 5% Chèvre anti Alexa 594 rat
Anti-CD31 1:500 De sérum de chèvre de 5% Chèvre anti Alexa 488 rat
Anti-VE-cadhérine 01:10 De sérum de chèvre de 5% Chèvre anti Alexa 594 rat
Anti-Alk1 01:25 5% âne sérum Âne anti chèvre Alexa 594
Anti-ASMA-Cy5 1:100 N / A

Tableau 1. Des exemples d'anticorps primaires pour immunofluorescence de montage rétines entières.

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Discussion

La méthode présentée ici offre un moyen simple et efficace pour obtenir des images de préparations colorées de montage entières de rétines de souris néonatales, ce qui en fait un modèle facilement quantifiable et physiologiquement pertinents de l'angiogenèse. Initialement, l'œil de la souris peut être assez difficile à disséquer en raison de sa petite taille et la forme du globe, alors un peu de pratique et de bons outils de dissection sont nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Dissection des yeux préparés 2x concentration de PBS est important car cela provoque une petite quantité de perte d'eau à partir de l'œil et réduit la pression intra-orbitaire, ce qui facilite la dissection. Une bonne préparation de la rétine est important pour plusieurs raisons. D'abord, il maintient l'intégrité du système vasculaire. Deuxièmement, si la vascularisation hyaloid n'est pas bien éliminé, il réduit l'efficacité de la coloration des anticorps, conduisant à des niveaux élevés de fond et la résolution diminue. Ce problème peut également se produire si le temps de fixation PFA de la rétine est trop long. Cependant,avant la coloration, le stockage à long terme de plusieurs mois de méthanol dans le congélateur à -20 ° C est approprié avant la coloration isolectine et pour la plupart des anticorps dans le tableau 1. Bien coloration isolectine est rarement problématique, il ne macrophages tache en plus de cellules endothéliales. Pour une bonne immunomarquage de toute la montagne rétines, le choix des anticorps est critique et le protocole de coloration doit être adaptée en fonction de la spécificité des anticorps et de la concentration, qui peuvent varier d'un lot lorsque les anticorps polyclonaux sont utilisés. Haut fond peut généralement être réduite en diminuant la concentration d'anticorps, ce qui augmente le temps de lavage ou en ajoutant plus de détergent pour les étapes de lavage. Les anticorps sont aliquotées à l'arrivée et stockés comme indiqué par le fabricant. Pour ceux qui sont stockés à -20 ° C, une aliquote de travail est conservé dans le réfrigérateur pour éviter des cycles répétés de gel dégel. Si des taches fluorescentes lumineux apparaissent sur l'échantillon taché, surtout si c'est également présentsdans la région autour du tissu, ce qui suggère agrégats précipités d'anticorps sont présents qui doit être enlevé dans toutes les expériences ultérieures par centrifugation de l'anticorps pour 10.000 rpm pendant 5 min avant de les utiliser. Certains des anticorps utilisés actuellement par nos laboratoires sont dans la liste des matériaux avec la dilution appropriée (tableau 1). Le choix d'une combinaison compatible d'anticorps est très important pour éviter une réaction croisée entre les anticorps indésirables primaires et secondaires. La prolifération cellulaire peut être surveillé par injectant à des souris une solution de BrdU environ deux heures avant de récolter le tissu. Cet analogue thymine est incorporée dans l'ADN et la prolifération peut être détectée en utilisant un anticorps anti-BrdU spécifique, comme décrit précédemment 8.

Chaque rétine est très fragile, mais peut être teinté pour différents marqueurs vasculaires en traitant le tissu doucement tout en travaillant à travers le protocole. Un certain nombre de contrôles sont inclus danschaque expérience pour montrer la spécificité de la coloration. Rétines non traités se révéler le degré d'auto-fluorescence dans le tissu, ce qui devrait être minime. Un pas de contrôle de l'anticorps primaire va permettre la détermination de la liaison non spécifique de l'anticorps secondaire par rapport au tissu. Rétines qui ont été accidentellement déchiré lors de la dissection peuvent fournir des tissus utile pour les contrôles. Après le montage, la coloration fluorescente est conservée pendant plusieurs jours, tant que les lames sont conservées à 4 ° C dans l'obscurité. L'imagerie par microscopie à épifluorescence est améliorée par l'utilisation d'un ApoTome, qui enlève de la lumière de mise au point. Alternativement, la microscopie confocale permet imagerie spécifique des cellules précises (figures 3 et 4).

Cette méthode a de nombreuses applications possibles. Il peut être appliqué à des souris dont les gènes clés qui régulent l'angiogenèse sont épuisées, y compris le travail qui utilise inductible Cre-loxP génétique 8-10. Sinon angiogenèse rétinienne peut êtretraitements médicamenteux suivants interrogés livrés par voie systémique ou intra-oculaire d'enquêter sur leurs effets pro-ou anti-angiogénique 11. Il est également possible de tirer parti des outils transgéniques et à utiliser la GFP ou des souris transgéniques DP pour visualiser des éléments clés de la vascularisation rétinienne 11,12. (Notez que la fixation à l'aide PFA 4% en PBS pendant 1 heure à température ambiante est utilisé à la place du méthanol pour l'étape 2.12 du protocole préalable à l'imagerie endogène GFP ou DP dans les rétines de souris transgéniques.) En outre, afin d'étudier la signalisation moléculaire mécanismes, il est utile de visualiser l'expression de l'ARNm de gènes spécifiques dans le plexus rétine à l'aide de l'hybridation in situ 13.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par le Wellcome Trust et la British Heart Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Plastic pipettes 3 ml Scientific Laboratory Supplies PIP4210 Remove tip with scissors to create a wide bore
BD Falcon 24-well plates Scientific Laboratory Supplies 353226
Select Petri dishes TV 90 mm Scientific Laboratory Supplies SLS2002
Histobond slides VWR 631-0624
Coverslips 22 x 22 mm VWR 631-1336
Dumont Tweezers #5 World precision instruments 14095
Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades World precision instruments 501235 Used for enucleation
Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 500086 Used for dissecting retina
Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 501778 Used for dissecting retina
crystal clear’ tubes 2 ml Starlab E1420-2000
Reagents
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876 PBS reagent
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655 PBS reagent
Sodium chloride Sigma S9625 PBS reagent
Paraformaldehyde Sigma P6148 Make up in 2x PBS and store at -20 °C
BSA Sigma A7638
Triton X-100 Sigma T9284
Donkey serum Sigma D9663
Goat serum Vector S-1000
Prolong Gold anti-fade reagent Invitrogen P36930 Mounting reagent
Isolectin GS-IB4-alexa 594 Invitrogen I21413 Use at 1:200 dilution
Isolectin GS-IB4-alexa 488 Invitrogen I21411 Use at 1:200 dilution
Primary Antibodies
Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) Millipore AB5320 Detects pericytes
Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) Millipore MAB360 Detects astrocytes
Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) Millipore 04-585 Detects pericytes
Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) Chemicon AB756P Detects vascular basement membrane
Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) Sigma C6198 Detects vascular smooth muscle cells.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) BD Pharmingen 550546 Detects endothelial cells
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) BD Pharmingen 553370 Detects endothelial cells
Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) BD Pharmingen 550548 Detects endothelial cell junctions
Anti-Alk1 (goat polyclonal) R&D Systems AF770 Detects endothelial cells
Secondary Antibodies
Goat anti-rabbit-Alexa594 Invitrogen A11012 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa488 Invitrogen A11006 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa594 Invitrogen A11007 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-mouse-Alexa488 Invitrogen A11029 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Donkey anti-goat-Alexa594 Invitrogen A11058 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Microscopes
Dissection microscope Zeiss Stemi SV6
Camera Zeiss Axiocam HRc Camera for dissection microscope
Epifluorescent Microscope Zeiss Axioimager with Apotome
Camera Zeiss Axiocam HRm Camera for Axioimager
Confocal Microscope Nikon A1R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, (7347), 298-307 (2011).
  2. Staton, C. A., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J. Exp. Pathol. 85, (5), 233-248 (2004).
  3. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, (2-3), 172-183 (2007).
  4. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, (2), 307-318 (2002).
  5. Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10, (2), 77-88 (2007).
  6. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat. Protoc. 5, (10), 1659-1665 (1038).
  7. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. J. Vis. Exp. (57), e3184 (2011).
  8. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat. Protoc. 5, (9), 1518-1534 (2010).
  9. Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system. PLoS One. 7, (9), e39336 (2012).
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  11. Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nat. Med. 16, (4), 420-428 (2010).
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  13. Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nat. Protoc. 7, (6), 1086-1096 (2012).

Comments

5 Comments

  1. Thank you for an excellent tutorial on whole mounting of neonatal mouse retina!

    I was wondering: when you are mounting the dissected retina on the object glass after several steps of washing/staining, how can you tell that you mount it the correct way and not upside down?

    Thank you!

    Best regards,

    Tora Sund Morken, NTNU, Norway

    Reply
    Posted by: Tora m.
    May 5, 2015 - 4:49 AM
  2. Thanks for your comment. There are two ways to know that mounting of your retina is correct. First, the side of the retina in contact with the choroid layer is always darker than the inside of the retina. Second, most of the time the flattened retina will have a slight curve and a cup morphology. This will help you to decide if your retina is correctly mounted.”

    Reply
    Posted by: Helen A.
    May 5, 2015 - 7:33 AM
  3. Hello, the protocol was really excellent for retina staining of neonatal pups when I have tried !
    Here I have some questions that confuse me.1: if I want to dissect the retina for western blot or real time PCR,whether I can use the 2X PBS, will it affect the mRNA or the protein? 2: The eyes followed by the 2x PBS after fixation usually will stay more than 10 minutes, because I fixed eyes in the 4% PFA after euthanasia in the vivarium room,which often means eight or ten eyes meantime, it takes a maybe 1 hour to dissect all the retinas. how I can deal with the issue?or just put the eyes which I cannot dissect meantime in the 1XPBS (cold) first ,when I need to dissect it ,then transfer the eye into 2XPBS 5-10 minutes ahead .3:Recently I have done lots of whole mount retina staining ,but the protein like GIT1 or VEGFR3 or ERG almost can not be stained ,I prolonged the time of primary antibody included the secondary antibody ,but still fails.I was wondering the co-staining of two or three primary antibody will interference each other or I need increase the concentration of Triton? I am struggling with the issue,and I have already avoided the interact of secondary antibody.

    thank you

    your sincerely

    Guofu zhu

    Reply
    Posted by: Zhu, G.
    December 13, 2015 - 1:01 AM
  4. 1. For RNA extraction, I dissected unfixed retinas in 1xHBSS + 0.1%BSA +2mM EDTA on ice .

    2. I staggered the enucleations by 1 min per eye, so that all eyes were fixed for exactly 10 min. The eyes are held in 2XPBS on ice during the rest of the removals.

    3.Often it is the fixation or the methanol storage which interferes with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after retina dissection rather than storing in the freezer

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 9:51 AM
  5. 1. For qPCR, I have dissected the retinas in: 1xHBSS +0.1%BSA +2mM EDTA on ice, without fixation of the eyes.

    2. I staggered the dissections of each pup by 2min ( or however long it takes to remove the eyes), so all the eyes have exactly 10 min fixation. After this, the eyes can stay in cold 2XPBS on ice during the retina dissections.

    3. Often it is the fixation step or the methanol storage steps which can interfere with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after dissection, rather than store in the freezer.

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 6:05 AM

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