氧微环境中的单个胰岛水平的定量和临时控制

Bioengineering

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Summary

微流控氧赋予的不仅仅是方便和速度超过低氧室的生物实验。通过扩散穿过膜实现的,特别是当,微氧可以在微尺度级同时提供液相和气相的调制。这项技术使动态多参数实验的关键学习islet病理生理学。

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Lo, J. F. J., Wang, Y., Li, Z., Zhao, Z., Hu, D., Eddington, D. T., Oberholzer, J. Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level. J. Vis. Exp. (81), e50616, doi:10.3791/50616 (2013).

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Abstract

同时氧化葡萄糖刺激分泌耦合系数在一个单一的技术和监测是模拟胰岛缺氧的病理生理状态的关键,尤其是在移植环境。同时标准的缺氧室技术无法调节两个刺激,也不提供葡萄糖刺激分泌耦合系数的实时监控。为了解决这些问题,我们应用了多层微流控技术,通过扩散膜水性和气相调制集成。这将创建在周围的透明聚二甲基硅氧烷(PDMS)设备的microscaled胰岛刺激夹层,可以监控通过荧光显微镜前述的耦合因素。此外,气体输入由一对微分配器的控制,提供了定量,分分钟之间0-21%氧气的调制。这种间歇性缺氧是适用于调查小岛的一个新现象吨预处理。此外,手持多式联运显微镜,我们能够在这些缺氧事件来看看详细的钙和K ATP通道的动态。我们设想微缺氧,特别是这个同步双相位技术,如胰岛细胞研究以及许多离体组织的重要工具。

Introduction

动态缺氧是很重要的生物学,专为胰岛移植

动态缺氧是一种重要的生理,以及在许多生物组织的病理生理参数。变化中的氧,例如,是在血管生成一种强效的发育信号。此外,在缺氧的空间和时间模式调节HIF1-α,像胰腺癌疾病中发挥作用。缺氧也是影响胰岛移植结果的混杂因素。近日,缺氧,或间歇性低氧(IH)的时间上振荡“预处理”小岛1展示了好处。然而,胰岛生理静态和暂态缺氧的影响还没有得到很好的理解或学习,主要是由于缺乏适当的工具来控制胰岛的微环境。

胰岛血管化以及在体内

胰岛是50-400 56;米球形聚集体内分泌细胞,包括β-细胞和α-细胞是负责葡萄糖稳态。当胰岛在血液中,摄取和糖酵解导致ATP的产生,这带来了ATP敏感性钾离子(K ATP)通道,并导致钙离子内流触发胰岛素颗粒的胞吐暴露于刺激的葡萄糖。氧气是很重要的,以驱动此沉重的代谢过程和胰岛素分泌显著由血流量和氧供应的动力除了葡萄糖梯度的影响。胰岛容易在体内内从毛细血管一个单元格的长度执行此葡萄糖-胰岛素反应,因为它们是高度灌注胰腺,每个。然而,密集的网络intraislet毛细血管被胶原酶期间胰岛分离2,3移除。因此,氧气和养分供应被约束到一个100微米的周长由于扩散限制。

在重建胰岛微环境的步骤“>目前的技术已经成功的限制

重建胰岛的原生氧和葡萄糖动力学,关键建模的生理和病理生理条件下,很难达到与需要复杂的流量和缺乏连续监测的胰岛功能的标准低氧室中。此外,移植治疗I型糖尿病露出分离胰岛缺氧在肝门系统4相比,生理胰腺(5.6%,40毫米汞柱),其具有低得多的氧分压pO 2(<2%,5〜15毫米汞柱)。移植后的胰岛移植需要两个星期或更长时间来吻合血管。它已被证明,低氧损害胰岛的葡萄糖 - 胰岛素偶联机制。其中刺激分泌耦合系数,钙信号,线粒体潜力和胰岛素动力学可以很容易地监测使用微流体。我们以前的微流体技术证明了这一点再人的实时监控与周围单个胰岛5,6水微环境的精确调节。然而,胰岛的缺氧损伤的定量是由缺乏同时刺激和监测技术的阻碍。因此,结合氧和胰岛监测微流体控制可以改善胰岛缺氧的研究。

微流控可以重新和调节水和氧微环境

该标准技术组织和文化缺氧的研究是基于对缺氧室。在一般情况下,低氧室提供单独的氧浓度与平衡时间在〜10-30分钟,用分钟缩放动态缺氧不相容。最近的两项研究中使用自定义的小室用于对全小鼠间歇低氧暴露,对葡萄糖诱导的胰岛素反应7,8相互矛盾的结果。请记住,在整体动物水平,呼出氧气不能直接转录定于胰岛毛细血管氧分压 ,由于呼吸系统的控制。此外,这些研究并没有标准化的氧含量,也没有提供实时措施胰岛的组织水平。

另一方面,氧气微流体可以通过经由气体通道网络控制氧超过这些限制。此外,微流体与实时成像兼容的过程中氧气的调制,一个壮举目前无法与标准缺氧室。许多这些新的微流体方法利用聚二甲基硅氧烷的透气性溶解的氧气浓度成流媒体在靶细胞9-14微通道。这些器件还集成了多个分立的氧浓度,基于荧光氧传感器,甚至化学氧代芯片上。

液体溶剂化 - 基于微流控也很难保持稳定的,连续的梯度,因为我T依赖于对流混合是敏感的流动条件。相比较而言,我们在这里使用的技术专注于降低氧输送的扩散路径。气体溶剂化和剪切流是通过直接扩散穿过接种细胞或胰岛组织膜的氧消除。这消除控制溶剂化需要额外的微流体和防止不必要的剪切应力的小岛,它本身可以引发胰岛素的释放。该平台已经被用来证明活性氧(ROS)的上调在两个高氧和缺氧的极端(2-97%O 2)在细胞培养1,15。因为直接运送氧气和去除剪切流动的,我们的扩散型平台为研究胰岛缺氧的最佳微流体解决方案。

多式联运刺激和监控

基于扩散的微流体时改编为研究胰岛英里也带来了额外的好处crophysiology。通过使用膜作为扩散阻挡层,所述液体可从氧的调制进行分离,使之含水葡萄糖刺激的控制独立地选自缺氧的刺激。这将创建一个类似三明治的同时刺激在空间上针点送货到小岛。此外,由于气体经由计算机化microinjectors时间上调制的,我们可以从21-0%数字短暂时间小于60秒的调节氧气浓度。中的氧和葡萄糖的微环境在显微镜的动态控制允许实时多峰协议使用标准的低氧室那将是不可能的或极其麻烦的。使用这种装置,钙信号(的Fura-AM),线粒体电位(罗丹明123),和胰岛素动力学(ELISA)进行了监测,以提供在缺氧条件下的动态葡萄糖 - 胰岛素反应的全貌。

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Protocol

1。准备小鼠胰岛

  1. 解剖C57BL / 6小鼠,并通过胶原酶消化和Ficoll密度梯度分离孤立小岛。 (参见在2,3 JOVE引用的文章)。
  2. 培养在含有10%FBS,1%青霉素/链霉素,和20mM HEPES在培养皿中的胰岛在RPMI-1640培养基(37℃,5%CO 2)。后分离,培养胰岛实验中使用前24小时。使用1-2天以内的小岛,以确保一致的结果。

2。使得微流体平台

  1. 生成的微观结构几何形状的透明的光掩模对每个器件层:1)的入口和出口,2)葡萄糖微流体层与表面灌流室(直径8毫米×3毫米,150微升),3)200微米的膜具有微孔(500微米的直径, 100微米深),以及4)气体的微流体层。
  2. 为了制造入口和出口层,倒脱气,预混PDMS到为1.5毫米的空白培养皿中并固化在80℃下进行2小时的高度。冲头直径为2毫米的输入/输出端口。
  3. 到制作葡萄糖微流体层,自旋2 350微米层的SU8-2150,以形成一个单一的700微米的层上形成4中的硅晶片。
    1. 通过适当的光掩模暴露紫外光显影后到微通道图案转印到SU8,产生700微米高的主人。
    2. 倾脱气,预混合的PDMS到这个主到3mm的高度和固化在80℃下搅拌2小时。切这个PDMS塑造一个刀片。
    3. 冲头直径为2毫米的输入/输出端口以及将直径8毫米的腔室。
  4. 为了制作出200微米的滤膜微孔,旋SU8-2100为100微米。采用同样的紫外线光刻技术,以微孔图案转移到这个100微米高高手。
    1. 旋转脱气,预混合的PDMS到这个主,在900 rpm离心30秒并固化在80℃下10分钟。 SPI使用相同的条件下在第一顶呐第二层,导致在含有微孔图案的200微米的硅橡胶膜。
    2. 通过此膜打孔直径为2毫米的输入/输出端口
  5. 为了制造微流体气体层,旋SU8-2100为100微米。采用同样的紫外线光刻技术,以煤气微流体图案转印到这100微米高高手。
    1. 倾脱气,预混合的PDMS到这个主到1.5毫米的高度和固化在80℃下搅拌2小时。切割PDMS塑造用刀片。
    2. 通过此层打孔直径为2毫米的输入/输出端口
  6. 粘接的多个层,它们通过清洗用胶带,暴露于电晕放电电弧,然后用手按以下顺序排列的准备。
    1. 粘结膜与微孔朝上底部的气体层。
    2. 债券于微孔膜顶部的葡萄糖微流体。
    3. 结合进口和出口层Õn个极顶,封装整机装配。
    4. 通过在顶部加上1千克的重量,并在100℃烘烤3小时加强粘接。
  7. 通过加载的水进入水层中,然后浸没在水中整个设备泄漏测试完成的器件。然后,通过气体层流空气用空注射器。
  8. 通过将水层,然后冲洗,用PBS缓冲液中,在该装置被储存在4℃直至使用消毒用70%乙醇无泄漏的装置。

3。微型分配器设置

  1. 获得2微分配器,5 V和20 V DC电源和数字I / O板卡构建氧气混合和交付安装。
    1. 该微分配器“控制线连接到包含驱动单元。
    2. 驱动程序连接到数字I / O板在对应于Labview的控制端口。
    3. 5 V和20 V电源连接到相应的驱动器单向接触TS。
    4. 数字I / O连接到一台笔记本电脑来执行Labview的代码气体控制(见附录)。
  2. 1微型分配器连接到氮,而另一个以压缩空气,都以5%的CO 2。设置两种气体为2磅。胡克了掌柜'输出一个丁字路口进入微流体装置前。
  3. 使用泄漏测试设备,通过循环5-21%的氧气之间的微分配器,同时测量水中的溶解氧与光纤氧传感器(见设备清单及代表性成果)表征氧调制的瞬态响应。

4。设置在显微镜

  1. 该装置安装在倒置显微镜加热阶段。
  2. 0%和21%的O 2气体连接到设备和校准用的氧传感器。
  3. 葡萄糖微流体的输出端口连接到馏分收集器。
  4. 准备克雷布斯Ringer碳酸氢盐缓冲液(KRB):129 mM氯化钠,5毫米碳酸氢钠3,4.7毫米氯化钾,1.2 mM的KH 2 PO 4,1毫米氯化钙2·2H 2 O,1.2毫米硫酸镁4·7H 2 O,10毫米的HEPES pH值为7.35-7.40 2毫基础葡萄糖和5%FBS中。
  5. 制备含有2mM和14mM的葡萄糖分别在50ml锥形管中沐浴在37℃水浴中2缓冲溶液。
  6. 连接蠕动泵绘制缓冲区250微升/分钟进油管。进入微流体装置前流管在37℃烤盘。
  7. 染色的小岛,在100%的乙醇添加的Fura-2 AM在DMSO和罗丹明〜2毫升的KRB达到5微米最终的染料浓度和2.5微米。
  8. 拿起胰岛用10微升移液管,在37℃下孵育中的染料30分钟
  9. 通过葡萄糖微通道入口装入约20胰岛到器件中。通过吸缓冲区从插座上回T直拨胰岛进入室他入口。
  10. 灌注在缓冲器中的胰岛10分钟以洗去多余的染料。

5。运行同步氧气和葡萄糖刺激

  1. 递送葡萄糖的刺激脉冲以5分钟的基线由KRB2成立,随后的14 mM的刺激15分钟,然后洗涤15分钟,在KRB2。
  2. 记录三百八十○分之三百四十零nm激发波长的Fura-2和534发射的罗丹明。
  3. 每次实验前进行正常的脉冲(14毫米常氧)的测量。
  4. 对于氧气调制(缺氧/间歇性缺氧),刺激和洗涤步骤和其他步骤没有流动时只适用缓冲流,最大限度地减少对流扰动。
  5. 收集在1分钟的间隔为酶联免疫吸附胰岛素测定葡萄糖出口废水。

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Representative Results

中央到此胰岛缺氧的方法是调节水相和气相的刺激在相同微流体腔室与微小尺度瞬变的能力。 图1是一个)的有代表性的结果胰岛室中测量的双重刺激和b)快速调制。水调制,通过引入荧光素所显示的腔,实现了在三到四分钟混合平衡。此外,氧可以从5-21%会加强与快速瞬变,使氧气与循环周期短至2分钟。不同循环深度和频率也可以实现为如图2所示。

当此循环被施加在胰岛创建间歇性低氧,人们可以观察到预处理胰岛对缺氧的好处相比,有规律的,含氧量正常的脉冲, 图3a。由于细胞内钙离子通量的信号mechanis胰岛素米分泌是在实时监控,缺氧和IH的效果可以在钙瞬变, 图3b的过冲和振荡阻尼被观察到。这些都是有关联的重要参数K ATP通道建议,以控制预处理过程。此外,线粒体的链接,代谢和缺氧可通过监测线粒体电位使用罗丹明可视化。最后,收集微流控废水允许总胰岛素量的酶联免疫吸附测定法。钙,线粒体膜电位,而胰岛素是开始建立缺氧下的瞬态, 图3c中的葡萄糖-胰岛素反应的多式联运视图中的三个参数。

图1
图1。同时氧气和葡萄糖刺激。(一)静态控件。上图:在250微升室介绍FITC分子/分范围内混合时间为3分钟稳定。底部:气体控制提供了稳定的供货5 10,和21%的氧气在膜(B)时序控制。因为无论是在表面上的微孔的气体输送(扩散)和(溶解)测定之间5-21%氧气的循环是可能的1分钟周期。

图2
图2。微流体装置还可以生成其他氧访问。不同IH访问可以通过改变深度(5-10-15%)以及循环的周期(3-6-1分钟)通过气体混合从计算机化microinjectors获得。

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图3。 IH预处理胰岛细胞已提高对缺氧。预处理采用IH(A)代表概述,共计30分钟暴露于5%,显示出较常氧脉搏(同胰岛一批在以前的实验中)增强低氧反应。随后缺氧10多分钟仍保留了预处理。平均常氧,低氧和低氧预适应反应(B)叠加对比。插图显示代表痕迹的振荡行为恢复(三)多模态的Fura-2,胰岛素和罗丹明不同氧和化学条件的反应:21%的氧气,5%的氧,预处理(P 5%),二氮嗪(D + 5%),和5HD(5HD + P 5%)。二氮嗪与预处理一致5HD同时通过打开和blocki否定预处理的好处吴KATP通道,分别为。双尾t-检验:5%与21%,5%与P +5%,D +5%对5HD + P +5%* P <0.05,** P <0.01,*** P <0.001。

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Discussion

集成在这个小岛缺氧技术的多模式现在几点注意这里进行故障排除。首先,分离出的胰岛继续降解,在文化瓦解由于来自腺泡细胞消化酶。后胰岛分离标准化的实验来1-2天,因此,在获得一致的结果至关重要。第二,所述水性流缺氧和间歇性缺氧期间被停止,以防止对流的间隙在层流和扩散之间的边界。这似乎限制了胰岛预处理的持续时间。在水通道的气体交换未来整合可以消除这一微小的间隙,同时还允许快速调制气体在膜。第三,在加载小岛,水管道应仔细按相反的顺序重新连接(出口再进口),以避免捕获气泡。最后,未来的设备可与扇出微流体分配器进行扩展,以帮助分布忒胰岛的簇在整个室中,在底部它可以与捕集器的口袋的阵列图案化。这除了口袋阵列微流分布将有助于创造小岛的位置阵列的高通量实验。

在此之前的微流体胰岛缺氧技术,最快的间歇性缺氧调制分别在一至三个分钟循环次数通过使用小的自定义低氧室与加压气体的高流速来实现。然而,这些只能用于整体动物,而不是在单个胰岛水平。此外,在整个动物的胰腺(呼吸平衡后)达到的实际低氧水平的不确定性也有无法探测葡萄糖胰岛素响应于实时,控制良好的微环境。相比之下,无论是水和气体的刺激被控制到分钟的时间尺度在我们的微流控。这些调制亦直接在显微镜FO安装ř多参数监测。在此之前我们的技术,可重复和良好的特点胰岛前提条件一直没有实现。氧敏感的离体组织,如胰岛最适合这种微流体平台作为他们的microscaled尺寸( 100微米半径)较小的细胞培养平台和更大的腔室装置之间被困。除了 ​​小岛,一些离体组织,包括心脏组织,脑切片和胚胎,可以使用这种技术研究。

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Disclosures

作者宣称,他们有没有竞争的财务权益。

Acknowledgments

这项工作是由卫生部资助R01 DK091526(JO),美国国家科学基金会0852416(DTE)全国学院和芝加哥糖尿病项目的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Spinner Laurell WS-400
SU8 MicroChem SU8-2150/SU8-2100
Digital Hotplate PMC Dataplate 722A
UV Curing Lamp OmniCure S1000
PMDS Dow Chemical Sylgard 184
Corona Wand ETP BD-20AC
Vacuum Chamber Bel-Art 420220000
Microdispensers The Lee Company IKTX0322000A
5 V and 20 V DC Power Radio Shack
NI USB National Instrument NI USB-6501
Thermometer Omega Engineering, Inc.
Peristaltic Pump Gilson Minipulse 2
Oxygen Sensor Ocean Optics NeoFox
Fraction Collector Gilson 203
Pippette Fisher Scientific Finnpipette II 100μl
Inverted Epifluorescence Microscope Leica DMI 4000B
50 ml Conical Tubes Fisher Scientific
Fura-2 Fluorescence Dye Molecular Probes, Life Technologies
Rhodamine 123 Fluorescence Dye Molecular Probes, Life Technologies
Culture Media Sigma-Aldrich RPMI-1640
HEPES Sigma-Aldrich
Glucose Sigma-Aldrich
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich
30 in Silicone Tubings Cole-Parmer 1/16 in x 1/8 in
1.5 ml Eppendorf Tubes Fisher Scientific
Y-connectors Cole-Parmer 1/16 in and 4 mm
Syringe Connectors Cole-Parmer female Luer plug 1/16 in
Straight Connectors Cole-Parmer 1/16 in
Elbow Connector Cole-Parmer 1/16 in

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References

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