Quantitative und zeitliche Steuerung der Sauerstoff-Mikromilieu in der Einzel-Islet Niveau

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Bioengineering

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Lo, J. F. J., Wang, Y., Li, Z., Zhao, Z., Hu, D., Eddington, D. T., Oberholzer, J. Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level. J. Vis. Exp. (81), e50616, doi:10.3791/50616 (2013).

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Abstract

Gleichzeitige Sauerstoffversorgung und Überwachung der Glucosestimulus-Sekretion Kopplungsfaktoren in einer einzigen Technik ist entscheidend für die Modellierung von pathophysiologischen Zuständen von Insel Hypoxie, vor allem in der Transplantations-Umgebungen. Standard-hypoxischen Kammer Techniken können nicht beide Reize modulieren gleichzeitig noch eine Echtzeit-Überwachung des Glucosestimulus-Sekretion Kopplungsfaktoren. Um diese Schwierigkeiten zu begegnen, haben wir mit einer mehrschichtigen Mikrofluidtechnik, sowohl wässrige und Gasphasenmodulationen über eine Diffusionsmembran integrieren. Dies erzeugt einen Stimulations Sandwich um die mikroskalierte Inseln innerhalb des transparenten Polydimethylsiloxan (PDMS)-Vorrichtung, um so die Überwachung der genannten Kopplungsfaktoren über Fluoreszenzmikroskopie. Zusätzlich wird die Gaszufuhr durch ein Paar von Mikrodispenser gesteuert wird, eine quantitative, Unter Minute Modulationen von Sauerstoff zwischen 0-21%. Diese intermittierende Hypoxie wird angewendet, um ein neues Phänomen der Insel zu untersuchent Präkonditionierung. Außerdem mit multimodalen Mikroskopie bewaffnet, waren wir in der Lage, auf detaillierte Kalzium und K ATP-Kanal Dynamik in diesen hypoxischen Ereignissen zu suchen. Wir haben die Vision mikrofluidischen Hypoxie, vor allem diese simultane Dualphasen Technik, die als ein wertvolles Instrument bei der Untersuchung Inseln sowie viele Ex-vivo-Gewebe.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Spinner Laurell WS-400
SU8 MicroChem SU8-2150/SU8-2100
Digital Hotplate PMC Dataplate 722A
UV Curing Lamp OmniCure S1000
PMDS Dow Chemical Sylgard 184
Corona Wand ETP BD-20AC
Vacuum Chamber Bel-Art 420220000
Microdispensers The Lee Company IKTX0322000A
5 V and 20 V DC Power Radio Shack
NI USB National Instrument NI USB-6501
Thermometer Omega Engineering, Inc.
Peristaltic Pump Gilson Minipulse 2
Oxygen Sensor Ocean Optics NeoFox
Fraction Collector Gilson 203
Pippette Fisher Scientific Finnpipette II 100μl
Inverted Epifluorescence Microscope Leica DMI 4000B
50 ml Conical Tubes Fisher Scientific
Fura-2 Fluorescence Dye Molecular Probes, Life Technologies
Rhodamine 123 Fluorescence Dye Molecular Probes, Life Technologies
Culture Media Sigma-Aldrich RPMI-1640
HEPES Sigma-Aldrich
Glucose Sigma-Aldrich
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich
30 in Silicone Tubings Cole-Parmer 1/16 in x 1/8 in
1.5 ml Eppendorf Tubes Fisher Scientific
Y-connectors Cole-Parmer 1/16 in and 4 mm
Syringe Connectors Cole-Parmer female Luer plug 1/16 in
Straight Connectors Cole-Parmer 1/16 in
Elbow Connector Cole-Parmer 1/16 in

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References

  1. Lo, J. F., Wang, Y., et al. Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia. Anal. Chem. 84, (4), 1987-1993 (2012).
  2. Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp.. e1125 (2009).
  3. Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp.. e1343 (2009).
  4. Shapiro, A. M., et al. Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen. N. Engl. J. Med. 343, (4), 230-238 (2000).
  5. Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device. J. Vis. Exp.. e1649 (2010).
  6. Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
  7. Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period. AJP - Regu Physiol. 303, (7), 700-709 (2012).
  8. Lee, E. J., et al. Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia. Eur. J. Appl. Physiol. (2012).
  9. Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).
  10. Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator. Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).
  11. Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures. Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).
  12. Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomed. Microdev. 9, (2), 123-134 (2007).
  13. Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium. Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).
  14. Chen, Y., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).
  15. Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).

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