Een protocol voor Genetische Inductie en Visualisatie van goedaardige en Invasieve Tumoren in Cephalic Complexen van

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Samenwerking tussen een geactiveerd oncogen zoals RAS V12 en mutaties in cel polariteit genen zoals gekrabbeld, leiden tot tumorgroei in Drosophila waar tumorcellen ook weergeven invasief gedrag. Hier een eenvoudig protocol voor de inductie en observatie van de goedaardige en invasieve tumoren wordt gepresenteerd.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Srivastava, A. A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (79), e50624, doi:10.3791/50624 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Drosophila heeft ons begrip van de genetische basis van de normale ontwikkeling en de ziekte van de afgelopen decennia en vandaag het blijft enorm bijdragen aan ons begrip van complexe ziekten 1-7 verlicht. Progressie van tumoren van een goedaardige van een uitgezaaide staat is een complex evenement 8 en is gemodelleerd in Drosophila om ons te helpen beter inzicht in de genetische basis van deze ziekte 9. Hier presenteer ik een eenvoudig protocol om genetisch te induceren, observeren en vervolgens de progressie van tumoren in Drosophila larven analyseren. De tumor inductie techniek is gebaseerd op het marcm systeem 10 en gebruikt de samenwerking tussen een geactiveerde oncogene Ras V12 en verlies van celpolariteit genen (opgekladde, schijven groot en dodelijke reuze larven) invasieve tumoren 9 genereren. Ik laten zien hoe deze tumoren kan worden gevisualiseerd in de intacte larven enhoe deze kunnen worden ontleed uit voor verdere analyse. De vereenvoudigde protocol hier gepresenteerde moet het mogelijk deze techniek wordt gebruikt door onderzoekers vindt het begrijpen van de rol van een gen in tumor invasie.

Introduction

Progressie van tumoren van een goedaardige naar een metastatische toestand is een stapsgewijze proces dat gekenmerkt wordt door ontwijking van beschermende mechanismen in het lichaam 8. Bijvoorbeeld tumorcellen in het lichaam moet kunnen apoptose en het immuunsysteem te omzeilen, doorbraak gespecialiseerde extracellulaire matrix (ECM) genoemd basaalmembraanziekte en overwinnen eventuele sociale controle die door de omringende cellen 8. Het is door een stapsgewijze progressie die de kankercellen verwerven het vermogen om te migreren en te koloniseren verre plaatsen in een proces genaamd metastase. Ons begrip van hoe de tumorcel overwint de beperkingen die het lichaam barrières is nog in de kinderschoenen, maar de opkomende beeld uit onderzoek gedaan tot nu toe wijst op een herhaald gebruik van normale ontwikkelingsprocessen en signaalwegen door de kankercellen 11-13.

De fruitvlieg Drosophila melanogaster heeft enorm bijgedragen aan onze understanding van de normale ontwikkeling en ziekte door het gebruik van geavanceerde genetische technieken ontwikkeld in de afgelopen tientallen jaren 14-17. Met behulp van mutagenese en overexpressie tools die we zijn aangekomen op een beter begrip van verschillende oncogenen en tumor suppressor genen 18-22. Echter, tumormetastase is een gevolg van de samenwerking tussen verschillende genetische laesies die is voornamelijk bestudeerd in celkweekmodellen 23,24 en verschillende xenograftmodellen 25-27. Deze modellen maar krachtig hebben hun beperkingen omdat zij niet volledig nabootsen omstandigheden in een levend organisme. Bovendien transgene modellen beschikbaar in muizen zijn omslachtig en niet bevorderlijk voor de genetische analyse van invasief gedrag 28,29. Verschillende studies hebben geprobeerd om de invasie van tumorcellen te begrijpen in Drosophila 30,31. Deze technieken voornamelijk gebruik maken van transplantatie van primaire tumoren aan hosts en dan vertrouwen op het volgen van de transplanted tumoren voor invasie van aangrenzende weefsels 32,33. Een krachtige techniek genaamd marcm 10 werd aangepast door Pagliarini en Xu model tumor invasie in Drosophila 9. Dit elegante genetisch model van tumorinvasie benut de samenwerking tussen een geactiveerde oncogen en verlies van celpolariteit. De kracht van deze modellen is het feit dat de invasieve tumoren zijn gemaakt in een intact organisme dus omzeilen de noodzaak voor transplantatie van weefsels. Om de oncogene samenwerking brengen, wordt een geactiveerd Ras oncogen als V12 uitgedrukt in klonen van cellen in het larvale oog antennal disc. Door de marcm techniek deze klonen ook aangeduid met groen fluorescerend eiwit (GFP) voor eenvoudige visualisatie en zijn homozygoot voor celpolariteit mutanten als dodelijk reuze larven, krabbelde en grote schijven gemaakt. Het resultaat GFP gelabeld invasieve tumoren in de Cephalic complex. In dit rapport Idemonstreren hoe te induceren, en visualiseer deze invasieve tumoren, zowel in het kader van een intact larven en in ontleed uit cephalic complex. De tumor inductie gepresenteerde gebruikt reagentia op het tweede chromosoom van Drosophila. In tabel 2 geef ik een overzicht van voorraden X en 3e chromosomen die kunnen worden gebruikt voor hetzelfde doel. Ik geloof dat deze vereenvoudigde protocol deze techniek gemakkelijk toegankelijk voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het begrijpen van de moleculaire basis van de progressie van de tumor zal maken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Inductie van goedaardige niet-invasieve tumoren

  1. Gebruik in tabel 2 vermelde voorraden voor de inductie van goedaardige tumoren.
  2. Bereid een starter cultuur voor de "tester" voorraad van de volgende genotype: y, w, ey-FLP1; Tub-GAL80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP
  3. Bereid een starter cultuur voor de "getest" voorraad van de volgende genotype: w; FRT40A, UAS-Ras V12 / cyo
  4. Verzamel tien vrouwelijke maagden uit de "tester" voorraad en tien mannen uit de "getest" voorraad.
  5. Steek de mannetjes en vrouwtjes uit de "tester" en "getest" voorraad door ze beide in een flacon met vlieg voedsel.
  6. Plaats het kruis in een 25 ° C incubator en laat de mannetjes en vrouwtjes te paren en eieren leggen voor 24-48 uur.
  7. Controleer de flesjes voor voldoende ei afzetting en op de aanwezigheid van larven eerste instar ervoor te zorgen dat de cultuur niet uitdroogt.
    1. Voeg een paar druppels van een autoclaafgedestilleerd water aan de cultuur om het vochtig te houden (als de cultuur wordt uitdroging).
    2. Blijven toezien op de cultuur en stap 1.7.1 herhalen als nodig is.
  8. Observeer zwervende derde instar larven onder een fluorescentie stereomicroscoop als beschreven in punt 3.

2. Inductie van invasieve tumoren

  1. Gebruik in tabel 2 vermelde voorraden voor de inductie van invasieve tumoren.
  2. Gebruik de starter cultuur uit stap 1.2 van de volgende genotype: y, w, ey-FLP1; Tub-GAL80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP
  3. Bereid een starter cultuur voor de "getest" voorraad van de volgende genotype: w; LGL 4, FRT40A, UAS-Ras V12 / cyo
  4. Verzamel tien vrouwelijke maagden uit de "tester" voorraad en tien mannen uit de "getest" voorraad.
  5. Steek de mannetjes en vrouwtjes uit de "tester" en "getest" voorraad door ze beide in een flacon met vlieg food.
  6. Plaats het kruis in een 25 ° C incubator en laat de mannetjes en vrouwtjes te paren en eieren leggen voor 24-48 uur.
  7. Controleer de flesjes voor voldoende ei afzetting en op de aanwezigheid van larven eerste instar ervoor te zorgen dat de cultuur niet uitdroogt.
    1. Voeg een paar druppels geautoclaveerd gedestilleerd water aan de kweek om het vochtig te houden (wanneer de kweek uitdroging).
    2. Blijf de cultuur monitor voor droogte en herhaal stap 2.7.1 als dat nodig is.
  8. Observeer derde instar larven onder een fluorescentie stereomicroscoop als beschreven in punt 3.

3. Observatie van goedaardige en invasieve tumoren

  1. Gebruik derde instar larven voor goedaardige tumor isolatie en visualisatie.
    1. Bevochtig een verfborstel in gedestilleerd water en met behulp van deze kwast schrapen een paar larven derde instar van de wand van de cultuur flacon.
    2. Plaats larven in een depressie glijbaan met 1X PBS en vervolgens met behulp van een natte kwast schroote eventuele voedsel materiaal uit de larvale opperhuid.
    3. Plaats de larven in een Petri schaal en laat bij -20 ° C vriezer gedurende 30 minuten om de larve immobiliseren.
      1. Alternatieve methode om de larven te immobiliseren met behulp FLYNAP.
      2. Plaats een FLYNAP toverstok gedoopt in FLYNAP aan het flesje uit 3.1.3.2 en na het inpluggen van de flacon te laten aangesloten flacon met larven gedurende 30 tot 40 minuten.
    4. Plaats de geïmmobiliseerde larve op een glasplaatje, voeg een druppel licht halogene olie, dek af met een deksel glas en observeren onder een fluorescentie stereomicroscoop met de mogelijkheid om Green Fluorescent Protein (GFP) te visualiseren.
    5. De goedaardige tumor lager larven groen fluoresceren in de anterieure regio waar de cefalische complex aanwezig is.
  2. Selecteer dag 10 larven (na inductie) van de in stap 2 hierboven voor observatie van invasieve tumoren cultuur. Dag 10 larven worden geselecteerd omdat invasieve tumor dragende larven hebben een uitgebreide lArval podium en in het algemeen niet aan pupariate.
  3. Volg de stappen 3.1.1 tot en met 3.1.4, behalve in plaats van derde instar larven gebruik dag 10 larven.
    1. De dag 10 invasieve tumor dragende larven groen fluoresceren in de anterieure regio waar de cefalische complex aanwezig is.
  4. Als de fluorescentie microscoop is uitgerust met een digitale camera dan foto's maken van de fluorescerende goedaardige en invasieve tumor lager larven.

4. Dissectie van de Cephalic Complex en verdere observatie van goedaardige en invasieve tumoren

De doorschijnende epidermis van de larve maakt het moeilijker waarneembaar mate van invasie van tumoren. Dus de mate van invasie is beter gevisualiseerd door het ontleden van de cefalische complex uit de larve. De volgende stappen moeten worden gebruikt om de cefale complex ontleden.

  1. Met een natte kwast selecteren derde instar larven (voor goedaardige tumoren) en dag 10 larven (voor invasieve tumoren) from de betreffende cultuur flesjes.
  2. Plaats larven in een putje van een dissectie schotel met koud 1X PBS. Gebruik kwast af te schrapen geen voedsel deeltjes uit het larvale opperhuid.
    1. Transfer schoon larven om een ​​nieuwe put van de dissectie schaaltje met koud 1X PBS.
    2. Controle van de aanwezigheid van GFP-fluorescentie met behulp van een stereomicroscoop opsporen van fluorescentie. Gooi niet-GFP dragende larven.
  3. 1,0 ml koud 1X PBS toe te voegen aan een frisse goed op de dissectie schotel en met behulp van een pincet de overdracht van een larve dragen ofwel de goedaardige of invasieve tumoren (de dissectie protocol blijft hetzelfde voor deze twee soorten van tumoren).
  4. Houd de larve naar beneden met behulp van een pincet ongeveer 2/3e van het voorste einde.
    1. Gebruik de andere pincet en slim scheiden het achterste 1/3e van de larve en gooi deze weg.
    2. Laat de voorste 2/3e van de larve. Aangezien de druk in de larve vrijkomt de inhoud van hetlarve zal sijpelen uit de lichaamsholte.
    3. Gebruik een tang om de darm, vet lichaam en andere inwendige inhoud van de larve die vloeide uit de lichaamsholte te verwijderen.
    4. Gebruik een pincet om de mond haak van de larve te houden en duw het in het larvale opperhuid en het gebruik van het andere paar tang volledig keren de larve.
    5. Gebruik de tang om voorzichtig en verwijder voorzichtig de dikke lichaam, speekselklieren, gut, de vleugel schijf complex en eventuele tracheale buizen. De Cephalic complex moet nu zichtbaar bevestigd aan de monding haak van de omgekeerde larve. De hemisferen en buikzenuwkoord (VNC) nog steeds worden aangesloten op de larvale epidermis door de zenuwen die uit de VNC.
    6. Gebruik een pincet om voorzichtig breken de verbindingen tussen de cefalische zenuwen en het larvale opperhuid.
    7. Als de zenuw verbindingen tussen de VNC en de larvale epidermis zijn gebroken en overtollig vet lichaam en ander weefsel verwijderd, de cefalische complex zou duidelijk zichtbaar en wordt bevestigd aan het larvale epidermis alleen de mond haken.
    8. De Cephalic complex kan worden overgelaten bevestigd aan het larvale epidermis als de complexe behoeften voor downstream toepassingen zoals antilichaamkleuring of voor latere visualisatie worden vastgesteld.
    9. Indien geen toepassingen later dan zou worden uitgevoerd de cefale complex kan worden losgemaakt van het larvale epidermis en in een druppel van een glycerol gebaseerde fixeermiddelen voor verdere observatie en analyse. Gebruik Vectashield als de montage media.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Als gevolg van het protocol hier gepresenteerde zal de gebruiker in staat zijn om goedaardige tumoren te induceren door overexpressie een geactiveerd oncogen in het larvale oog antennal imaginaire disc. De gebruiker zal ook invasieve tumoren induceren in het oog antennaal disc overexpressie een geactiveerde oncogen in klonen van cellen mutant ook een celpolariteit gen. De tumoren kan gemakkelijk worden gevisualiseerd met behulp van een fluorescerende stereomicroscoop als "groen fluorescerend" weefsel in het geheel larven of cephalica complexen die zijn uitgesneden van het larvale lichaamsholte (figuur 1). De goedaardige tumoren worden gelokaliseerd in het oog antennaal schijf complex als klonen van GFP positieve cellen, terwijl de invasieve tumoren leidt tot massale overgroei van tumoren en latere migratie van GFP-positieve invasieve tumoren naar de VNC en andere aangrenzende organen. In> 10 dagen oude larven (afgeleid van de invasieve tumor genotype) GFP positieve en vrijstaande secundaire tumoren Floating in het larvale lichaamsholte kan ook worden waargenomen. Bovendien, terwijl de larven met het goedaardige tumoren pupariate op tijd, degenen met het invasieve tumoren hebben een langere larvale periode en niet om pupariate. Deze invasieve tumor dragende larven kunnen gemakkelijk worden waargenomen als "giant larven" met vloeistof gevulde lichaamsholte.

Figuur 1
Figuur 1. . Goedaardige en invasieve tumoren in Drosophila AB linkerpaneel: Groen fluorescerende larve met goedaardige en invasieve tumoren, respectievelijk AB rechter paneel:. Dissected cephalic complexen van larven dragen zowel goedaardig of invasieve tumoren respectievelijk A) Goedaardige tumoren zijn gelokaliseerd aan het oog-antennaal. schijf, waar zij worden geïnduceerd. Merk op dat de GFP-gelabelde weefsel niet is gemigreerd naar aangrenzende organen zoalsde buikzenuwkoord (VNC). Vergelijk dit met B. B) Cephalic complex lager invasieve tumoren uit een dag 10 larve. Let op de sterke groei van tumorweefsel (groen) en ook invasie van aangrenzende organen zoals de VNC en de mond haken door het tumorweefsel (aangegeven met een rode pijl). De invasie van de aangrenzende organen door de invasieve tumor weefsel wordt aangegeven met een pijl. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2
Figuur 2. Een classificatiesysteem voor invasieve tumoren gebaseerd op de mate van migratie over de VNC. Het schema van de VNC wordt getoond met de omvang van de tumor migratie afgebeeld met groene kleur vulling. Het is gekoppeld aan deernst van migratie boven elke schema gegeven.

Chromosoom # Tester stam genotype Getest stam genotype Verwijzing
Goedaardige tumoren Invasieve tumoren
1 w, bad-GAL80, FRT19A; ey-FLP5, Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP w, FRT19A; UAS-Ras V12 DLG m52, FRT19A/FM7C; UAS-Ras V12 Pagliarini en Xu, 2003
2 y, w, ey-FLP1; Tub-GAL80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP w, FRT40A, UAS-Ras V12 / cyo w, LGL 4, FRT40A, UAS-Ras V12 / cyo Pagliarini en Xu, 2003
3 y, w, ey-FLP1; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP;FRT82B, bad-GAL80 w, UAS-Ras V12; FRT82B w, UAS-Ras V12; FRT82B, Scrib 1 / TM6Tb Pagliarini en Xu, 2003

Tabel 2. Het genotype van de voorraden nodig zijn goedaardige en invasieve tumoren induceren. Alle voorraden zijn beschreven in de vermelde referentie. Voorraden moeten worden aangevraagd bij het laboratorium van Tian Xu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kanker is een complexe ziekte met een veel beter inzicht om dan in het verleden. Er moet echter nog veel worden geleerd en uitgelegd voordat we een volledig beeld van de onderliggende mechanismen. De eenvoudig protocol hier gepresenteerde maakt het mogelijk om genetisch induceren goedaardige en invasieve tumoren in een geheel organisme en bestuderen biologie geassocieerd met de progressie van tumoren in dit model. De meeste bestaande technieken Drosophila en andere organismen of gebruiken een celcultuur gebaseerde systeem tumorigenese en metastase of een systeem dat transplantatie van primaire tumorweefsels telt tot volwassen gastheren 23-27 begrijpen. Zowel de cellen gebaseerde en-transplantatie technieken hebben hun beperkingen. Bijvoorbeeld, de transplantatie techniek is omslachtig en tijdrovend en kan leiden tot transplantatie van niet-tumorweefsels in de gastheer. Dit kan leiden tot productie van experimentele artefacten. Bovendien cel culture gebaseerde systemen zijn slechts benaderingen van de werkelijke omgeving die bestaat in een hele organisme. Deze beperking maakt het moeilijk om de zeer belangrijke tumor en de interactie micro-omgeving die een kritieke rol bij tumorgroei en metastase 34 speelt na te bootsen. De hier gepresenteerde techniek is met succes toegepast door verschillende onderzoeksgroepen om de genetische en moleculaire basis van de progressie van de tumor in Drosophila onderzoeken. Bijvoorbeeld, het gebruik van deze techniek werd aangetoond dat de JNK route zowel opgereguleerd in invasieve tumoren en is ook noodzakelijk voor de progressie van tumoren 35,36. In een andere studie van de rol van matrixmetalloprotease in tumorprogressie is aangetoond in deze genetische model 12,37.

De kritische stappen in verband met het protocol hier gepresenteerde beginnen met de juiste genotype van de voorraden die voor inductie van goedaardige en invasieve tumoren. Zorg moeten worden genomen om ervoor te zorgen dat dezevoorraden zijn niet "breken". De voorraden kan periodiek worden gecontroleerd op de aanwezigheid van gele (y -) vliegt die indicatief zijn voor een voorraad panne zou zijn. Dit zou erop wijzen dat de FLP-Out cassette in de marcm tester voorraad spontaan is geflipt en zou dus constitutief uiten Gal4. Dit kan worden voorkomen door dubbele bestanden in flesjes en bij 18 ° C. Ook, als de tumoren worden geïnduceerd, de dag waarop de larven moeten worden gecontroleerd op goedaardige en invasieve tumoren is ook kritisch. Terwijl goedaardige tumor dragende larven volgen een ontwikkelingsstoornis tijdslijn die in hoge mate overeenstemt met wild type larven, het verhaal met larven lager invasieve tumoren is anders. De invasieve tumor dragende larven scherm uitgebreid larvale stadium en sommige niet pupariate. Inderdaad deze eigenschap van verpopping versus niet verpopping is gebruikt als een maat voor invasieve tumorsuppressie door Menut et al.. 38 Vanwege het uitgebreide larvalestadium van invasieve tumor dragende larven is het essentieel om invasieve tumoren observeren rond dag 8-10 na inductie voor de beste resultaten. Op dag 8-10 genoeg tumor migratie gebeurde op de VNC, zodat het gemakkelijk waarneembaar onder een stereo microscoop. Voorbij dag 10, terwijl de tumor kan worden waargenomen, begint het volledig overspoelen de VNC waardoor het moeilijk de cefale complex oriënteren ontleed specimens. Een andere belangrijke stap geassocieerd met visualisatie van tumoren geheel larven is de mogelijkheid om de larven te immobiliseren. Zowel FlyNap en lagere temperaturen kunnen worden gebruikt om de larven te immobiliseren zoals beschreven in de gedetailleerde protocol. Tenslotte de ontleed cefalische complexen moeten worden gekleurd met een antilichaam dan de dissecties worden op ijs uitgevoerd en complexen moeten binnen dertig minuten worden vastgesteld.

De hier gepresenteerde techniek kan worden gebruikt door onderzoekers om de bijdrage van genen verdacht een rol spelen bij tumorprogressie begrijpen.Met deze genetische model van regulatie van een gen kan worden bestudeerd in situ door antilichaam kleuring technieken of door middel van RT-PCR. Men kan ook proberen te begrijpen of een gen noodzakelijk is voor tumorgroei door gebruik dit model in combinatie met mutanten van het gen in kwestie of RNAi reagentia. Bijvoorbeeld kan een RNAi reagens voor een gen te worden getest tumorsuppressie aanwezig op de 3e chromosoom. In dit geval is de tester en getest voorraad combinatie voor chromosoom 2 kon worden (Tabel 2) nadat de RNAi richting 3e chromosoom werd gekruist in de geteste voorraad. Zodra dit is dan bereikt de tester en getest voorraad voor chromosoom 2 kan worden gekruist en onderdrukking van invasieve tumoren getest. Een onderdrukking van invasieve tumor fenotype zou de betrokkenheid van een gen in het invasieve proces suggereren. Echter, de onderdrukking van de invasieve fenotype niet volledig penetrant en het is om deze reden dat ikvormen een classificatiesysteem voor invasieve tumoren gebaseerd op de mate van migratie van de tumoren via VNC (figuur 2). Gebruik makend van deze classificatie schema kan men gemakkelijk invasieve tumoren in vergelijking met invasieve tumoren waar een gen verdacht betrokken te zijn bij invasie is neergehaald. Analyse van een aantal cephalic complexen kan een beter inzicht in de omvang van invasief gedrag onderdrukking geven.

Hoewel de hier gepresenteerde protocol kan worden gebruikt in combinatie met het uitschakelen van een of twee genen effect van de genen op tumorprogressie te bestuderen, zou gelijktijdige neerhalen van meer dan twee genen technisch moeilijk te bereiken. Tenslotte een modificatie van deze techniek werd gebruikt door Wu et al.. 39 de effecten van naast elkaar geactiveerde oncogen tot expressie brengen tegen cellen die mutant celpolariteit genen begrijpen. De techniek door Wu et al.. Was een modificatie op het niveau van genetische reagentia however het experiment gebruikt dissectie van cephalic complexen voor visualisatie van tumoren. Dus de methode cefale complexen hier gepresenteerde ontleden kan nuttig zijn voor wetenschappers proberen gewijzigde techniek door Wu et al. gebruiken zijn. Ook.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ik heb niets te onthullen.

Acknowledgments

Onderzoek in mijn laboratorium wordt ondersteund door de WKU departement Biologie opstarten fondsen, WKU Research Foundation RCAP-Ik geven # 11-8032 en door een KBRIN-AREA subsidie ​​gefinancierd door een ouder subsidie ​​van het Nationaal Instituut van Algemene Medische Wetenschappen van de National Institutes van Volksgezondheid onder nummer award 5P20GM103436-13. Ik zou ook graag Dr Tian Xu in wiens laboratorium ik werd voorgesteld aan deze techniek en dr. Raymond Pagliarini die als eerste deze techniek in de Xu laboratorium erkennen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution Invitrogen, Sigma Aldrich
Chilled 1X PBS pH7.2 working solution Invitrogen, Sigma Aldrich Make fresh and refrigerate, can be used up to a week
Flynap Carolina Biologicals Fly anesthesia needed to anesthetize larvae
Fixative 0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde Needed to fix the dissected cephalic complex
Ice Bucket Several Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube
1.7ml Eppendorf tube Various
Glass slides, cover glass Fisher Scientific
Vectashield Mounting Media or any other mounting media Vector Laboratories
Halocarbon 200 or 700 Oil Polysciences Inc. or Halocarbon.com Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope
Sally Hansen "Hard as Nails" nail polish Can be found at any general merchandise store Needed to seal the edges of Coverslip
A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope Leica and others Needed to observe the GFP fluorescence in larvae
Dumont #5 forceps Fine Science Tools
Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish Sigma Aldrich
Paint Brush Can be found at any general merchandise store
Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bale, A. E. Hedgehog signaling and human disease. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 47-65 (2002).
  2. Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
  3. Coombs, G. S., Covey, T. M., Virshup, D. M. Wnt signaling in development, disease and translational medicine. Curr Drug Targets. 9, 513-531 (2008).
  4. Gistelinck, M., Lambert, J. C., Callaerts, P., Dermaut, B., Dourlen, P. Drosophila models of tauopathies: what have we learned. Int J Alzheimers Dis. 2012, 970980 (2012).
  5. Marsh, J. L., Thompson, L. M. Drosophila in the study of neurodegenerative disease. Neuron. 52, 169-178 (2006).
  6. Reiter, L. T., Bier, E. Using Drosophila melanogaster to uncover human disease gene function and potential drug target proteins. Expert Opin Ther Targets. 6, 387-399 (2002).
  7. Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. The many faces and functions of beta-catenin. EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).
  8. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  9. Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science. 302, 1227-1231 (2003).
  10. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1, 2583-2589 (2006).
  11. Boccaccio, C., Comoglio, P. M. Invasive growth: a MET-driven genetic programme for cancer and stem cells. Nat Rev Cancer. 6, 637-645 (2006).
  12. Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2721-2726 (2007).
  13. Wang, W., Eddy, R., Condeelis, J. The cofilin pathway in breast cancer invasion and metastasis. Nat Rev Cancer. 7, 429-440 (2007).
  14. Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
  15. Brand, A. H., Dormand, E. L. The GAL4 system as a tool for unravelling the mysteries of the Drosophila nervous system. Curr Opin Neurobiol. 5, 572-578 (1995).
  16. Vidal, M., Cagan, R. L. Drosophila models for cancer research. Curr Opin Genet Dev. 16, 10-16 (2006).
  17. Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nat Genet. 36, 288-292 (2004).
  18. Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130, 5065-5072 (2003).
  19. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
  20. Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121, 1053-1063 (1995).
  21. Rebay, I., et al. A genetic screen for novel components of the Ras/Mitogen-activated protein kinase signaling pathway that interact with the yan gene of Drosophila identifies split ends, a new RNA recognition motif-containing protein. Genetics. 154, 695-712 (2000).
  22. Therrien, M., Morrison, D. K., Wong, A. M., Rubin, G. M. A genetic screen for modifiers of a kinase suppressor of Ras-dependent rough eye phenotype in Drosophila. Genetics. 156, 1231-1242 (2000).
  23. Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Res. 47, 3239-3245 (1987).
  24. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J Cell Sci. 99, (Pt 4), 769-775 (1991).
  25. Fidler, I. J. New developments in in vivo models of neoplasia. Cancer Metastasis Rev. 10, 191-192 (1991).
  26. Mueller, B. M., Romerdahl, C. A., Trent, J. M., Reisfeld, R. A. Suppression of spontaneous melanoma metastasis in scid mice with an antibody to the epidermal growth factor receptor. Cancer Res. 51, 2193-2198 (1991).
  27. Konantz, M., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).
  28. McIntyre, R. E., vander Weyden, L., Adams, D. J. Cancer gene discovery in the mouse. Curr Opin Genet Dev. 22, 14-20 (2012).
  29. Mattison, J., vander Weyden, L., Hubbard, T., Adams, D. J. Cancer gene discovery in mouse and man. Biochim Biophys Acta. 1796, 140-161 (2009).
  30. Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4, 753-761 (2011).
  31. Stefanatos, R. K., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38, 431-438 (2011).
  32. Beaucher, M., et al. Drosophila brain tumor metastases express both neuronal and glial cell type markers. Dev Biol. 301, 287-297 (2007).
  33. Beaucher, M., Hersperger, E., Page-McCaw, A., Shearn, A. Metastatic ability of Drosophila tumors depends on MMP activity. Dev Biol. 303, 625-634 (2007).
  34. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
  35. Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16, 1139-1146 (2006).
  36. Uhlirova, M., Jasper, H., Bohmann, D. Non-cell-autonomous induction of tissue overgrowth by JNK/Ras cooperation in a Drosophila tumor model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13123-13128 (2005).
  37. Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25, 5294-5304 (2006).
  38. Menut, L., et al. A mosaic genetic screen for Drosophila neoplastic tumor suppressor genes based on defective pupation. Genetics. 177, 1667-1677 (2007).
  39. Wu, M., Pastor-Pareja, J. C., Xu, T. Interaction between Ras(V12) and scribbled clones induces tumour growth and invasion. Nature. 463, 545-548 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics