Visualisatie van endogene Mitophagie complexen in situ in humane pancreas Bètacellen met behulp van proximity Ligatie test

Dit protocol stelt ons in staat om endogene mitofobe complexen in menselijke weefsels zoals bètacellen te controleren, waardoor mitofagyonderzoek in cruciale translationeel-relevante weefsels wordt vergemakkelijkt. Een voordeel van deze techniek is het vermogen om belangrijke mitophagy complexen in vivo te visualiseren in weefsels met een zeldzame beschikbaarheid of in kleine steekproefnummers. Na isolatie volgens standaardprotocollen, cultuur vier tot zes keer 10 tot de derde menselijke eilandje equivalenten in 10 milliliter van volledige pancreas eilandje medium voor ten minste een dag bij 37 graden Celsius.

De volgende dag, gebruik maken van een dissectie lichtmicroscoop op een drie keer vergroting om individuele menselijke eilandjes tellen binnen de cultuur. Kies 40 eilandjes per behandeling of staat van belang in 1,5 milliliter buizen van eilandjes medium. Sediment de eilandjes door centrifugatie en resuspend de pellet in een milliliter PBS aangevuld met 50 micromolar PR619.

Keer de buis om en verzamel de eilandjes door centrifugatie voor een tweede wasbeurt in verse PBS plus deubiquitinase remmer. Na de tweede centrifugatie, dissociale de eilandjes in enkele cellen met 125 microliters van 0,25% trypsine plus remmer gedurende drie minuten bij 37 graden Celsius met periodieke zachte pipetting. Aan het einde van de incubatie, arresteer de reactie met een milliliter van 37 graden Celsius opgewarmd alvleesklier eilandje medium aangevuld met PR619.

Verzamel de eilandjes door centrifugatie voor twee wasbeurten in verse PBS plus remmer per wasbeurt. Na de tweede wasbeurt worden de gescheiden eilandjes opnieuw opgetrokken in 150 microliter verse PBS plus remmer. Voor de hechting en fixatie van de afzonderlijke eilandjes, cytospin de celoplossing op mat geladen microscoop dia’s en schetsen het cellulaire gebied met een hydrofobe pen.

Bevestig vervolgens de omcirkelde cellen met 4% paraformaldehyde en PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voor immunohistochemische analyse van de eilandjesmonsters, was de cellen met twee wasbeurten van vijf minuten in PBS bij kamertemperatuur, gevolgd door niet-specifieke bindingsblokkering met 10% ezelserum en PBS plus 0,3% wasmiddel gedurende een uur bij kamertemperatuur. Aan het einde van de blokkerende incubatie, coincubate de cellen met primaire muis antilichaam tegen ubiquitine-specifieke peptidase 8, primaire konijn antilichaam tegen neuregulin receptor afbraak eiwit-1, en een marker specifiek voor bètacel identificatie die niet werd verhoogd in muis of konijn om niet te interfereren met de nabijheid ligation test signaal ‘s nachts bij vier graden Celsius.

De volgende ochtend, was de monsters met twee vijf minuten wasbeurten in PBS op een rocker. Voeg anti-geit Cy5 secundair antilichaam toe aan een vers bereide nabijheidsligatietestoplossing. Na de tweede wasbeurt, label elk eilandje monster met 20 microliters van sonde oplossing en herstel de dia’s met plastic folie voor een incubatie van een uur bij 37 graden Celsius.

Aan het einde van de incubatie, was de cellen met twee vijf minuten wasbeurten in buffer A op een tuimelschakelaar, gevolgd door incubatie met 20 microliters van vers bereide ligatieoplossing aangevuld met 0,25 eenheden per microliter ligase per dia voor een 30-minuten incubatie bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de ligatie, was de cellen twee keer met buffer A gedurende twee minuten per wasbeurt. Bedek elk monster met 20 microliter versterkingsoplossingen aangevuld met polymerase voor een incubatie van 100 tot 120 minuten bij 37 graden Celsius.

Om de cellen voor te bereiden op beeldvorming, was de monsters twee keer in verse buffer A gedurende 10 minuten per wasbeurt op een tuimelschakelaar, gevolgd door een wasbeurt in 0,1x buffer B gedurende twee minuten op de tuimelschakelaar. Na de laatste wasbeurt, monteer de dia’s met een druppel montagemedium met DAPI en plaats voorzichtig een coverslip over elk monster met behulp van een scalpel om eventuele bubbels uit te drukken. Sluit vervolgens de coverslips af met duidelijke nagellak rond de randen.

Als u de monsters wilt weergeven, plaatst u een dia op het podium van een microscoop die meerdere brandpuntsvlakken kan vastleggen en selecteert u de 100 keer vergroting. Stel de hoogte van de Z-stack in op ongeveer 0,45 micrometer en de juiste vlek-, tegenvlek- en live-celsignaalexcitatie- en emissieparameters. Verkrijg ten minste negen verschillende beeldfoto’s van het brandpuntsvlak.

Om ervoor te zorgen dat de fluorescentiebeeld achtergrondsignalen en strooilicht worden geminimaliseerd, proces van de beelden met behulp van een twee-dimensionale deconvolutie dichtstbijzijnde buurman algoritme met behulp van een standaard beeldverwerking software van keuze. Als u de nabijheidsligatie-testinteracties wilt kwantificeren, opent u ImageJ en opent u het afbeelding van de nabijheidsligatietest. Klik vanaf de eerste scherp in-focusafbeelding op Afbeelding en selecteer Aanpassen en Drempelwaarde.

Pas de drempelwaarde aan om alle niet-specifieke nabijheidsligatietestsignaal te verwijderen en noteer de drempelaanpassing om te proberen het signaal consistent te houden tijdens de analyse. Klik op Verwerken en selecteer Binair en Binair maken. Controleer of grootte is ingesteld op nul tot oneindig, Circulariteit is ingesteld op nul op één, Toon is ingesteld op Contouren en controleer de vakken Weergaveresultaten en Resultaten wissen.

Let op het aantal deeltjes dat wordt geanalyseerd in een spreadsheet waarin het monster en de Z-stackpositie worden aangegeven. Klik vervolgens op Deeltjes analyseren en analyseren om de deeltjes te meten. Wanneer alle in-focus Z-stacks voor het monster zijn geanalyseerd, stuurt u het totale aantal deeltjes voor het monster in de spreadsheet om het totale aantal interacties te kwantificeren.

De antilichamen die in de nabijheidstest worden gebruikt, zijn specifiek voor de liganden en vertonen geen overlapping. Zoals waargenomen, is het dispersieprotocol zeer efficiënt bij het verkrijgen van enkele cellen in het gezichtsveld van de microscoop voor downstream-analyse en wordt de bètacelkenntering behouden na nabijheidsligatie-testkening in primaire menselijke eilandjes. Met behulp van de aangetoonde technieken kan worden vastgesteld dat de interactie van neureguline receptor afbraak eiwit-1 en alomtegenwoordige peptidase 8 wordt verminderd na een blootstelling van 48 uur aan palmitaat, waarbij de haalbaarheid van deze test voor het beoordelen van belangrijke endogene mitofagyfactoren na diabetogene stimuli wordt benadrukt.

De efficiënte en zachte verspreiding van menselijke eilandjes is essentieel om de kwantificering van de juiste celpopulaties stroomafwaarts te waarborgen. PLA maakt het mogelijk voor de beoordeling van belangrijke mitophagy complexen in menselijke eilandjes monsters waardoor de analyse van mitophagy en biologisch belangrijke menselijke patiënt monsters verplaatsen van het gebied van diabetes onderzoek vooruit.