打印温敏反向模具图案创作的双组分水凝胶的三维细胞培养

Immunology and Infection

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Summary

àbioprinter被用于创建图案的水凝胶的基础上牺牲的模具。泊洛沙姆模具与第二水凝胶回填,然后洗脱,留下空隙充满了三分之一的水凝胶。此方法使用快速的洗脱和良好的印刷泊洛沙姆产生复杂的生物大分子结构。

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Müller, M., Becher, J., Schnabelrauch, M., Zenobi-Wong, M. Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (77), e50632, doi:10.3791/50632 (2013).

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Abstract

生物印刷是一项新兴技术,在快速原型制造行业有它的起源。不同的印刷工艺可分为接触生物印刷1-4(挤出,蘸笔,软光刻技术),非接触式生物印刷5-7(激光的正向转 ​​移,喷墨沉积)和基于激光的技术,例如双光子光聚合8。它可用于许多应用,如组织工程9-13,14-16生物传感器的微细加工作为一种工具,回答基本的生物学问题,如影响共培养不同的细胞类型17。与常见的光刻或软光刻的方法不同的是,挤出生物印刷具有的优点在于,它不要求一个单独的掩模或印戳。使用CAD软件,可以快速地改变结构的设计和调整,根据运营商的要求。这使得生物印刷更灵活,比基于光刻的做法。

在这里,我们展示了印刷的牺牲模具来产生多材料的三维结构内的水凝胶,例如,使用一个数组支柱。这些支柱可以代表一个血管网或管内神经导向导管的空心结构。所选择的材料的牺牲模具是泊洛沙姆407,温度敏感型聚合物具有优异的印刷性能,这是液体在4℃,固体其胶凝温度以上〜20℃时为24.5%w / v的溶液18。这个属性允许基于泊洛沙姆牺牲模具洗脱需求在缓慢溶解的固体材料,尤其是狭窄的几何形状具有优势。泊洛沙姆印在显微镜载玻片创建牺牲模具。琼脂糖移液到模具中并冷却,直至凝胶化。泊洛沙姆在冰冷的水洗脱后,在琼脂糖模具的空隙被填充与藻酸盐丙烯酸甲酯藻IKED FITC标记的纤维蛋白原。填充空隙,然后交与UV落射荧光显微镜成像和结构。

Introduction

组织工程方法已经在过去几年取得了很大的进步,对于人体组织和器官的再生19,20。然而,到现在为止,已组织工程的焦点往往是有限的组织,具有简单的结构,或小的尺寸,如膀胱21,22或皮肤23-25。人的身体,但是,包含许多复杂的三维的组织,细胞和细胞外基质被布置在空间定义的方式。为了制造这些组织中,这种技术是必需的,可以放置在指定位置上的一个三维的结构内的细胞和细胞外基质的脚手架。生物印刷有潜力成为这样一种技术,制造复杂的三维组织的愿景,可以实现10,11,26-28。

生物印刷被定义为“材料转让过程使用的图案和组装生物相对埃文特材料-分子,细胞,组织,和可生物降解的生物材料-规定的组织来完成一个或多个生物功能“,它包含了几种不同的技术,工作在不同的分辨率和长度尺度,从亚微米分辨率的两个光子聚合29分辨率为150微米至420微米挤压印刷1,12,30。不是单一材料或材料组合将满足要求每个方法31。挤出印刷,关键参数是粘度和凝胶时间32,高粘度和快速凝胶化是可取的。

3D打印是一种技术,它允许创建复杂的几何形状30,33,34牺牲模具很容易的创建。这个过程是基于模具的建设,利用快速原型技术,如挤压bioprinter。使用创建的牺牲模具难以印刷由于其低的粘度和凝胶时间慢的材料,这些材料以形成复杂的结构。这里介绍的方法涉及到创建一个牺牲模具的材料组成的,在低温下迅速溶解,并可以准确地被挤压。的嵌段共聚物聚(乙二醇)99-聚(丙二醇)67-聚(乙二醇)99(也被称为的Pluronic F127或泊洛沙姆407)满足这些要求。它已经被用于在挤压印刷1中的修改后的版本,但据我们所知,从未被使用未修改的版本,由于它的不稳定性,在液体环境中的打印。泊洛沙姆407还示出了逆热响应行为18 它从凝胶在冷却时的溶胶。最重要的是,它可以打印任意弯曲成复杂的结构具有非常高的保真度。这允许创建一个结构化的水凝胶从低粘度的材料,在这种情况下慢胶凝琼脂糖,该溶液通过移液到印刷的牺牲模具。具有高的保真度和快速洗脱从铸造的结构化的水凝胶,使得它快速和灵活的方法来创建不同的几何形状的模具,无需使用的平版印刷方法,因为它往往是必需的掩模或邮票打印的牺牲模具的组合。铸造后的结构化的水凝胶,可以进一步与另一种材料是不适合用于挤出印刷由于其低粘度填充。这是在我们的情况下,一个低粘度海藻酸钠丙烯酸甲酯的解决方案。在这里,我们提出的方法反向温敏凝胶图案牺牲模具使用支柱数组的例子。

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Protocol

1。下游的泊洛沙姆407的解决方案

如果可用,泊洛沙姆溶液进行准备在寒冷的房间(4℃)。如果没有可用的,一个玻璃瓶放置在烧杯中,用冰冷的水填充。在较高的温度下,将泊洛沙姆凝胶点以上,因此无法正确地溶解。

  1. 加入60毫升冰冷的PBS溶液倒入玻璃瓶中,并用磁力搅拌器剧烈搅拌。
  2. 称取24.5克泊洛沙姆,并将其添加少量的冷PBS。等待,直到泊洛沙姆部分溶解后再加入更多的。
  3. 搅拌溶液,直到所有的泊洛沙姆溶解。
  4. 达到,直到最终体积为100ml,加入冷PBS。的最终浓度为24.5%(重量)/ v的
  5. 停止搅拌溶液,让它休息在4℃下,直到在溶液中的气泡和泡沫已经消失。被困在凝胶内的气泡,将被转移到的p子Rinter盒,将导致印刷牺牲模具缺陷。
  6. 过滤器(0.22μm的滤膜)的溶液以去除任何不需要的颗粒可能堵塞针直接进入打印墨盒。滤波步骤应在冷室中进行(或如果不与冷却的提示,过滤器 ),以避免在过滤器中的泊洛沙姆凝胶化。加载的墨盒保持在4℃,直到在实验前30分钟。

2。三维打印机的下游

在这项工作中所用的3D打印机从regenHU“生物工厂”。挤出系统的一部分,由几部分组成。下压在上面的盒被安装到连接器通过一个路厄锁定适配器。该连接器的桥梁在盒的出口和入口的电磁阀之间的空间。在出口处的电磁阀,具有不同直径的针都可以使用。素材是挤压到一个子施特拉特真空移动阶段举行。 图1中所示的系统的主要部分。其他挤出的系统可用于打印过程中,需要做的优化过程中,为每个系统。

  1. 电磁阀(喷嘴直径0.3毫米)和针(内径0.15毫米)放置在单独的1.5毫升试管中充满超纯水,将它们放置在一个加热的超声波浴中清洗30分钟。冲洗阀用乙醇清洗和干燥氮气枪。
  2. 安装在打印机中的阀和针以及一个空的,干净的墨盒。
  3. 3巴的压力系统应用和安装阀针用压缩空气吹出来的任何残余液体。对于小直径的针,它是建议有一个过滤器(共同的注射器过滤器,孔径0.45μm),以避免安装在出口处的压缩空气的小颗粒可能堵塞针的条目。 关闭压力和安装墨盒装有泊洛沙姆。墨盒应该从冰箱取出墨盒安装前约30分钟,所以泊洛沙姆可以达到室内温度和凝胶。
  4. 3巴的压力下应用的系统和分配泊洛沙姆,直到它到达针尖和被挤压在一个连续的链。

3。印刷参数的优化

要创建精确的三维结构,在印刷过程中进行优化选择的材料和浓度。根据每种材料的粘度和三维打印系统将产生一个特定的分注量和线的厚度为一组固定的参数。

  1. 有了一个合适的CAD软件(能够从图纸创建ISO文件),绘制一个线长度大致相同的结构,你打算打印。
  2. 放置在显微镜载玻片25毫米×75毫米×1毫米或在打印机中的任何另一方的基板,然后将它固定,打开真空。
  3. 在打印机软件中,设置高频率为50赫兹,并设置3巴的高压电磁阀。
  4. 打印一层的单个行,速度为300mm /分钟的阶段。
  5. 降低压力,直到达到所需的线路宽度。您也可以控制音量,通过阀门的开口时,被挤出。
  6. 降低频率的阀,直到没有连续的线可以被再印刷。选择的频率高于此值。

注意:一旦所需的线的宽度和连续线实现的,确定最佳的阶段的速度和针的升程,即后一个印刷层的层厚度。

  1. 打印彼此顶部几层,经过多次印刷层,如果针是在正确的位置上一层以上。调节层的厚度(针阀升程),以使每一层被印在顶部的下一个( 图3)。
  2. 降低的阶段的阶段速度300 mm / min的阶梯状,使挤压层的以前的相同的位置上( 图4)的开始和结束。过高的阶段速度导致舞台移动的挤压材料之前已经触及上一层。
  3. 打印的支柱结构遵循的步骤3.1.-3.8,但是,而不是绘制单行绘制一个点。参数,把重点放在打印时,支柱的压力(调节层的厚度和泊洛沙姆的柱直径),阀的打开时间(挤出量),并在打印头中的停留时间应存放的支柱上面的位置。
  4. 当参数进行了优化,打印几层线应该导致在一个坚实的墙,或在案件之分,一个支柱。减参数,供以后使用。

使用过程中发现从这点上的优化过程参数。

  1. 一个显微镜载玻片上打印的内部结构(这里是一个支柱阵列),并让它干通宵。这是一个)降低的结构的尺寸和厚度,和b)提供了更好的结构和衬底之间的粘附,因此提离回填期间可避免。
  2. 随着CAD软件绘制的结构,由外壁周围的结构,你打算洗脱,充满。打印与泊洛沙姆的结构。墙上的印刷将采取6分钟。

注意:要打印的壁具有至少为3.5毫米的内部结构,由于针的尺寸相差的。否则,印刷的外壁会破坏内部结构

  1. 准备解决方案,您要回填SACR的ificial模具(这里是在去离子水中的1%琼脂糖)。琼脂糖溶液应具有在35℃和45℃之间的温度下下方此温度下,在琼脂糖固化速度太快,高于此温度下,它可能会破坏印刷支柱,因为的泊洛沙姆结构将软化。
  2. 慢慢填补牺牲模具回填的解决方案,用吸管。这应该缓慢地进行,以避免破坏内部的壁的结构。
  3. 让的回填溶液凝胶或交联,这取决于所用的聚合物。在琼脂糖固化的情况下发生在4℃下10分钟。
  4. 将回填牺牲模具中,在冰浴中10分钟,以洗脱泊洛沙姆结构。
  5. 结构回填用纸巾吸干,并把它放在一个新的显微镜载玻片。按该结构,小心地将显微镜载玻片之间的空间内的第三水凝胶的空隙,以避免漏回填结构和玻璃显微镜载片上。

5。填补空隙

  1. 为了填补留下的洗脱的泊洛沙姆的空隙,填充到配备了30 G针的注射器预期的聚合物溶液。在这个例子中,我们使用的是1%的海藻酸钠甲基丙烯酸酯在0.15M NaCl的溶液中,加入0.05%w / v的锂苯基-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate的(LAP)和2.5%(体积/体积)的Alexa-488的共轭纤维蛋白原。 Alexa的-488共轭纤维蛋白原增加可视化的目的。
  2. 光聚合的聚合物具有高强度UV灯(100瓦,365纳米,与衬底的距离是3.5厘米)5分钟,图像构造使用的落射荧光或共聚焦显微镜。

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Representative Results

代表性的结果表明的倒模技术( 图2中所示)将创建结构化的第二材料,可填充有凝胶。在每次印刷过程中的开头的印刷参数首先优化。分步进行调整参数将导致在描绘在图3图4单行打印时打印的多层构造。如果层厚度(后一个印刷层的针阀升程)过低时,人们会发现,针触摸前述层。如果针太高,出现波纹的表面上印刷的构造,将出现。此可以看出,在图3A-3D,在所有被测试的层的厚度过大,对于给定的阶段速度。因为高阶段速度降低层的厚度,集之间的微小差异,实际层厚度的积累和波模式开始显示为构建体的高度增加。通过降低层的厚度的差异变小,波图案出现在比以前更高的位置(由图3C图3D中的虚线表示)。对于一个固定的层的厚度,如果阶段的速度太快,这会导致无论是在一个波模式或结构,窄的朝上方和在构建体(右边缘的印刷结构的开头有一个隆起),如图图4A-4C。泊洛沙姆的优化参数分别为0.2毫秒的打开时间,频率为31.14 Hz,层厚度为0.15毫米,1.5巴的压力和75毫米/分钟的速度。打印这些参数如图4D光滑坚实的墙壁。然而,100毫米/分钟的速度,更高的阶段的过程中选择的壁,以减少生产时间。

与PI参数优化LLAR印刷(开放时间为0.2毫秒,频率为31.14赫兹,层厚度为0.08毫米,压力1.5巴,阶段速度200毫米/分钟,滞留时间0.3秒),我们创建了一个数组支柱所示, 图5A。柱阵列的干燥的影响导致的弯曲向中心支柱。这种效应可以减少,但不能避免,通过进一步彼此分开放置的支柱。 如图5B所示的墙绕柱子,然后打印。

洗脱后,在冷水中的牺牲泊洛沙姆模具,如在图5C中所示的结构化的琼脂糖凝胶被创造了。荧光的藻酸盐甲基丙烯酸溶液和随后的交联,如一种新型的水凝胶的水凝胶柱阵列填充空隙后,在图6中所示的可制成。 3D的Z-Stack重建清楚地说明了荧光支柱,创建图7 STRONG>说明这种技术的可能性,还可以创建任意弯曲模具。

图1
图1。 [描写bioprinter A)图片的bioprinter“生物工厂”。针和阀在此图像中不可见的,但被描绘在B)。它允许一个快速改变材料之间的一个转折点炮塔上安装多达8个打印头。打印完成阶段,可以移动到移动X,Y和Z方向。 点击这里查看大图

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图2。牺牲模具结构化的水凝胶的制造过程中的生产计划。

图3
图3。层的厚度的优化,泊洛沙姆层印刷在一个固定的阶段速度(250毫米/分钟)随着层厚度的减小。当层的厚度过高,出现了一波模式。这降低层厚度逐渐消失。红色实线表示印刷的结构的底部,而红色的虚线表示的无缺陷部分的高度印刷的构造。层厚度是A)0.18毫米,B)0.16毫米)0.15毫米和D)0.13毫米。红色条表示2毫米。

“> 图4
图4。阶段速度优化。泊洛沙姆印刷层与层厚度为0.15mm的具有不同速度的阶段A)250毫米/分,B)的 200毫米/分钟,C)150毫米/分和D)75毫米/分钟。通过降低阶段的速度,对于所有层的打印处理的起点是相同的,可打印的坚实的墙。红色条表示2毫米。

图5
图5。生产图案凝胶。)柱阵列的干泊洛沙姆支柱彼此分离的1.75毫米。的支柱的弯曲所造成的干燥效果。 乙)柱阵列的壁所包围前泊洛沙姆移液的琼脂糖。)结构化琼脂糖凝胶取出后牺牲模具。

图6
图6。 3D重建的Z-Stack的荧光标记的支柱嵌入式在琼脂糖脚手架。

图7
图7。打印同心圆,泊洛沙姆单层可见。红色条表示2毫米。

设计标准 打印参数
更精细的层厚度
  • 压力↓
  • 第一阶段速度↑
  • 开馆时间↓
  • 频率↓
较小的线条粗细
  • 压力↓
  • 第一阶段速度↑
  • 开馆时间↓
  • 频率↓
连续挤压
  • 压力↑
  • 第一阶段速度↓
  • 开馆时间↑
  • 频率↑
加快建设速度
  • 压力↑
  • 第一阶段速度↑
  • 开馆时间↑
  • 频率↑

表1中。四个设计参数的挤出的泊洛沙姆线,它们可以由不同的印刷参数的影响。

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Discussion

这里,我们提出,在第一次,使用牺牲模,可在冷水中迅速溶出,由于约20℃的泊洛沙姆凝胶 - 溶胶转变温敏聚合物快速创建生物大分子结构不能有足够的分辨率打印速度的全过程,使泊洛沙姆有趣。这里描述的技术可以用于图案形成的水凝胶,水凝胶或在另一个先前已报告的其他材料35的微流体通道的创建。泊洛沙姆作为牺牲模具的优点是,它可以被印在任意的几何形状为固体层由层构造,可以在随后的填充和洗脱。

我们在这里描述的过程中,创建一个牺牲模具创建结构化水凝胶的第二水凝胶泊洛沙姆随后回填。的结构化的水凝胶的材料可以是通道OSEN问候的粘度和温度的点填充的限制。 41-43常用的聚合物如聚乙二醇二丙烯酸酯36,37,38,39海藻酸钠,琼脂40和甲基丙烯酸酯的生物聚合物的低粘性的易制毒化学解决方案是合适的填充材料只是几个例子。然而,高粘性材料可以不填窄的几何形状或可能破坏的情况下牺牲模具薄脆弱的结构,如这里印刷的支柱。因此,选择一个低百分比的琼脂糖溶液回填。用琼脂糖与泊洛沙姆的组合的另一个优点是,它通过冷却凝胶化。因此,当浸没在冷水中,琼脂糖保留的凝胶状态,一种状态,准确地反映了逆印刷泊洛沙姆模式。

在此过程中的重要步骤涉及印刷参数的优化,牺牲模具的填充和填充的空隙。打印参数进行了优化,阀门,压力,阶段的速度和层厚度的频率和开放时间。层的厚度被定义为每一个印刷层后的针的升程。支柱的情况下,居留时间, 时间材料被挤压到某一点不动阶段,也不得不进行调整。优化的过程可能非常耗时,因为一个参数的变化可以挤出线的几个设计参数产生影响。为不同的设计标准在表1中描述的关键参数

在这个过程中的第二个重要步骤是牺牲模具的填充。所述牺牲模具的填充物是一种微妙的步骤。狭小的结构需要仔细填写,经常是人工,铸造简单的解决方案可能并不总是可能的。

仔细填写的S因此,用100微升的移液管,以避免破坏的支柱与琼脂糖acrificial模具。所需的最后一个步骤,填充空隙,配备了30 G针注射器使用。应小心,以避免在灌装过程中气泡的形成。

这里提出的构造中的不同的凝胶还可以包含细胞。通过将一种细胞类型的空隙内,另一种类型细胞内的结构化的水凝胶中的水凝胶,在空间上定义的共培养的设置可以被创建。 Miller 等人的出版物中,相互连接的三维网络30 ,血管或神经网络也是可能的。这种网络的一个可能的办法。将打印的周围壁内的线,与第二水凝胶,交联的第二水凝胶填充空隙,并继续打印下一个层旋转90°,。作为牺牲模印刷泊洛沙姆的优点是,它既不要求母模或口罩。它也不需要加热的打印头挤出,在我们的实验中没有被观察到的材料和系统的堵塞。

这里介绍的构造,如,可能会在将来使用的作为空间组织三维共培养,以研究基于扩散的细胞 - 细胞相互作用,或用于药物开发的。然而,这里提出一个完全自动化的程序版本,需要开发成为成功的在药物筛选领域。

总之,我们已经提出了一种方法,使可填充有水凝胶和洗脱之后的任意几何形状的印刷。通过这种方式,结构水凝胶在水凝胶的架构可以创建一个简单的和具有成本效益的方式。

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Disclosures

作者无关申报。

Acknowledgments

我们感谢德博拉·STUDER的帮助与bioprinter。

这项工作是由欧盟第七框架计划(FP7/2007-2013)根据赠款协议Ñ°NMP4-SL-2009-229292。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Poloxamer (Pluronic F127) Sigma P2443
PBS Invitrogen 10010-015
CAD software regenHU BioCAD
Alginate methacrylate Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate Invitrogen F13191
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Agarose Lonza 50004
EQUIPMENT
Bioprinter regenHU Biofactory
Valve regenHU 300 μm Nozzel Diameter
Needle regenHU 150 μm Inner Diameter
Zeiss Axioobserver with ApoTome Zeiss
UV Light Source UVP Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp 100 W

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