小鼠小肠上皮类器官与先天性淋巴细胞的共培养

该协议为研究肠道免疫细胞与上皮之间的相互作用以及剖析这些相互作用如何调节肠道稳态和炎症提供了重要工具。该技术的主要优点是通过体外还原模型促进的精细的实验控制量，可用于解决上皮和免疫生物学中的问题。该系统已被用于确定ILC1在CD44阳性上皮隐窝扩张中的作用，并有可能进一步推进我们对炎症介导的胃肠道疾病的理解。

首先，将热交联基底细胞外基质放在冰上，通过将标准组织培养处理的24孔板置于37摄氏度的培养箱中来解冻和预热。然后，从培养箱中取出含有类器官的板，并从要通过的孔中丢弃培养基。然后，向孔中加入500微升冰冷的高级DMEM F12，并使用P-1000尖端，将所有孔中的类器官收获到15毫升管中。

用250至300微升冰冷的高级DMEM F12冲洗孔的底部，确保井中没有类器官残留在井中，并汇入含有收获的类器官的15毫升管中。将一到两天前收获的类器官颗粒重悬于一毫升冰冷的先进DMEM F12中。用PBS2预涂覆一个1.5毫升管，每个先天淋巴细胞复制样品，然后使用预先包被的PBS2尖端，将大约100至200个类器官分配到管中。

使用PBS2涂层的P-1000吸头，将分选步骤计算得出的体积不少于500 ILC1s添加到含有类器官的PBS2涂层1.5毫升管中。在4摄氏度下以300 G旋转ILC1和类器官五分钟，并确保避免小直径台式离心机，因为它们会沿着管内部的边缘拉动细胞，而不是在管的尖端产生沉淀。然后，缓慢而轻柔地除去上清液而不干扰沉淀并将样品放在冰上。

将管保持在冷表面上时，将类器官和ILC重悬于30微升热交联基底细胞外基质中至少10至15次，以确保均匀分布。将热交联基底细胞外基质中的每孔30微升ILC类器官施加到预热的24或48孔板上以形成单个圆顶。之后，将板直接放在培养箱中，在37摄氏度和5%二氧化碳下10至20分钟。

然后，每孔加入550微升完整的ILC1培养基，加入任何所需的实验细胞因子或封闭抗体，并在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育24小时。24小时后，轻轻地从培养箱中取出板，让板在组织培养罩中静置一分钟，以确保淋巴细胞沉降。取出200至250微升培养基，并将其放入24孔板的空孔中。

使用倒置显微镜检查上清液以确保没有淋巴细胞被移除。如果上清液是透明的，则在原始孔中向共培养基中加入300微升新鲜ILC1培养基。如果上清液中存在淋巴细胞，则在4摄氏度下以300至400 G离心3至5分钟，并将沉淀重悬于300微升新鲜ILC1培养基中。

然后，将细胞悬浮液加入原始孔中剩余的200至250微升培养基中。使用免疫荧光、流式细胞术或 FACS 纯化目标群体到裂解缓冲液中进行下游分析，以便通过单细胞或本体 RNA 寻道或 RT-qPCR 进行基因表达分析，如文中所述。成功完成传代后，健康和健壮的类器官培养表明，新鲜分离的隐窝应在两到四天内形成萌芽的隐窝结构。

进行流式细胞术分析，从ROR γ-T小鼠转基因报告系中分离出小肠ILC1，发现预期的ILC计数范围为350至3， 500个分离细胞。在接种类器官后，可以通过免疫化学细胞化学可视化共培养物。共聚焦显微镜检查揭示了单独培养并在ILC1存在下培养的小肠类器官的图像。

免疫细胞化学染色显示，在类器官 ILC1 共培养物中，在 Zonula 闭塞蛋白-1 阳性上皮细胞附近存在 CD45 阳性 ILC1。流式细胞术表明，上皮细胞粘附分子标记类器官中的肠上皮细胞，而CD45标记ILC1s。流式细胞术图和免疫化学显示，当与ILC1共培养时，肠上皮细胞中CD44的表达增加。

RT-qPCR 研究表明，ILC1 共培养特异性上调 CD44 变体 6，其被 TGF-β 1、2、3 中和抗体抑制，并在仅小肠类器官培养物中被重组 TGF-β 1 上调。在操纵类器官期间保持温和以确保整个结构得到维护并检查结构在离心后是否充分沉淀是很重要的。通过添加其他免疫和非免疫成分来增加系统复杂性，这种体外系统可用于解决肠道生物学中的进一步问题。