Udskrivning termoresponsive Reverse forme til Oprettelse af Mønstret To komponent Hydrogeler til 3D Cell Culture

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En bioprinter blev brugt til at skabe mønstrede hydrogeler baseret på en opofrende støbeform. Poloxamer Formen blev tilbagefyldt med en anden hydrogel og derefter elueret, hvilket efterlader hulrum, som blev fyldt med en tredje hydrogel. Denne metode bruger hurtig eluering og god trykbarhed af poloxamer at generere komplekse arkitekturer fra biopolymerer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Müller, M., Becher, J., Schnabelrauch, M., Zenobi-Wong, M. Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (77), e50632, doi:10.3791/50632 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bioprinting er en ny teknologi, der har sin oprindelse i rapid prototyping industrien. De forskellige grafiske processer kan opdeles i kontakt bioprinting 1-4 (ekstrudering, dip pen og blød litografi), kontaktløs bioprinting 5-7 (laser fremad overførsel, ink-jet deposition) og laser-baserede teknikker såsom to foton fotopolymerisation 8.. Den kan bruges til mange applikationer såsom tissue engineering 9-13, biosensor microfabrication 14-16 og som et redskab til at besvare grundlæggende biologiske spørgsmål såsom påvirkninger af co-dyrkning af forskellige celletyper 17.. I modsætning fælles fotolitografiske eller blød litografiske metoder har ekstrudering bioprinting den fordel, at det ikke kræver en særskilt maske eller stempel. Ved hjælp af CAD-software, kan udformningen af ​​strukturen hurtigt ændres og justeres i henhold til kravene for den enkelte operatør. Dette gør bioprinting mere fleksibelt end litografi-baseredetilgange.

Her viser vi trykning af en opofrende støbeform til at skabe en multi-materiel 3D struktur ved hjælp af en vifte af søjler inden for en hydrogel som et eksempel. Disse søjler kunne repræsentere hule strukturer til en vaskulær netværk eller rørene i en nerve guide ledning. Det valgte materiale til det hellige formen var poloxamer 407, en termoresponsiv polymer med fremragende trykegenskaber som er flydende ved 4 ° C og en fast over sin geleringstemperatur ~ 20 ° C i 24,5% w / v opløsninger 18. Denne egenskab giver poloxamer-baserede blote støbeform til elueres på efterspørgsel og har fordele i forhold til langsom opløsning af et fast materiale, især for smalle geometrier. Poloxamer var trykt på mikroskop objektglas til at skabe det hellige mug. Agarose blev pipetteret ind i formen og afkøles indtil gelering. Efter eluering af poloxameren i iskoldt vand, blev hulrummene i agarose formen fyldt med alginat methacrylat spiked med FITC mærket fibrinogen. De fyldte hulrum blev derefter tværbundet med UV og konstruktion blev afbildet med en epi-fluorescensmikroskop.

Introduction

Tissue engineering tilgange har gjort store fremskridt i de seneste år med hensyn til regenerering af humane væv og organer 19,20. Men indtil nu har fokus for tissue engineering ofte blevet begrænset til væv, som har en simpel struktur eller små dimensioner såsom blæren 21,22 eller huden 23-25. Det menneskelige legeme, indeholder imidlertid mange komplekse tredimensionale væv, hvor celler og ekstracellulære matrix er arrangeret i et rumligt defineret måde. At fremstille disse væv, er en teknik, kræves der kan placere celler og ekstracellulær matrix stilladser i en tredimensional konstruktion ved specificerede positioner. Bioprinting har potentialet til at være sådan en teknik, hvor visionen om fremstilling komplekse tre-dimensionelle væv kan realiseres 10,11,26-28.

Bioprinting defineres som "brug af materiale overførsel processer for mønstret og montage biologisk relvante materialer - molekyler, celler, væv og biologisk nedbrydelige biomaterialer -. med en fastsat organisation til at udrette et eller flere biologiske funktioner "4 Det omfatter flere forskellige teknikker, der arbejder på forskellige opløsninger og længde skalaer, der spænder fra sub-micron opløsning på to -foton polymerisering 29 til en opløsning på 150 um til 420 um for ekstrudering udskrivning 1,12,30. Ikke en eneste, materiale kombination vil opfylde kravene i hver metode 31.. til ekstrudering udskrivning de vigtigste parametre er viskositet og gelering tid 32, hvor høj viskositet og hurtig gelering er ønskelige.

3D-print er en teknik, der gør det muligt nemt at oprette offer forme til at skabe komplekse geometrier 30,33,34. Denne proces er baseret på konstruktionen af ​​en støbeform med en rapid prototyping teknik, såsom en ekstrudering bioprinter. Den oprettede opofrende støbeform anvendesat danne komplekse strukturer af materialer, som er vanskelige at udskrive pga. deres lave viskositet og langsom gelering tid. Fremgangsmåden præsenteres her indebærer etablering af en opofrende støbeform bestående af et materiale, der opløses hurtigt ved lav temperatur og kan ekstruderes præcist. Blokcopolymeren poly (ethylenglycol) 99-poly (propylenglycol) 67-poly (ethylenglycol) 99 (også kendt som Pluronic F127 eller poloxamer 407) opfylder disse krav. Det er allerede blevet anvendt i en modificeret udgave i ekstrudering udskrivning 1, men til vores viden, er aldrig blevet brugt til udskrivning i sin umodificerede udgave på grund af sin ustabilitet i flydende miljøer. Poloxamer 407 viser også en invers termisk reagerende opførsel 18 dvs. det skifter fra en gel til en sol ved afkøling. Vigtigst er det, kan den trykkes i komplekse vilkårligt buede strukturer med meget stor nøjagtighed. Dette giver mulighed for etablering af et struktureret hydrogel fra enlav viskositet materiale, i dette tilfælde langsomme gelering agarose. ved pipettering af opløsningen i den trykte offer skimmel Kombinationen af ​​at udskrive opofrende formen med high fidelity og dens praktiske eluering fra støbt strukturerede hydrogel gør det en hurtig og fleksibel metode til at skabe forme med forskellige geometrier uden brug af en maske eller et stempel som det ofte kræves i litografiske metoder. Den støbt strukturerede hydrogel kan yderligere fyldes med et andet materiale, der ikke er egnet til ekstrudering trykning på grund af sin lave viskositet. Dette er i vores tilfælde en lav viskositet alginat methacrylate løsning. Her præsenterer vi metoden til termoresponsiv reverse offer forme til hydrogel mønstret ved hjælp af eksempel på en søjle array.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Fremstilling af Poloxamer 407 Løsning

Hvis det er tilgængeligt, skal du udføre forberedelsen af ​​poloxameren opløsning i et koldt rum (4 ° C). Hvis det ikke er tilgængelig, skal du placere en glasflaske i et bæger fyldt med iskoldt vand. Ved højere temperaturer poloxameren vil ligge over gelpunktet og ikke vil blive opløst.

  1. 60 ml iskold PBS-opløsning i en glasflaske og omrøres kraftigt ved hjælp af en magnetisk omrører.
  2. Afvejes 24,5 g poloxamer og tilføje det i små mængder til den kolde PBS. Vent til poloxameren delvist er opløst, før du tilføjer mere.
  3. Opløsningen omrøres, indtil alt poloxamer er opløst.
  4. Tilsæt koldt PBS indtil en endelig volumen på 100 ml er nået. Den endelige koncentration vil være 24,5% w / v.
  5. Stop omrøring af opløsningen og lad den hvile ved 4 ° C indtil bobler og skum i opløsningen er forsvundet. Bobler, der er fanget inde i gelen vil blive overført til printer patron og vil føre til fejl i de trykte offer forme.
  6. Filter (0,22 um filter) opløsningen direkte i trykning patron til at fjerne uønskede partikler, der kunne tilstoppe nålen. Det filtrering trin bør udføres i et koldt rum (eller hvis dette ikke findes med afkølede tips, filter osv.) for at undgå gelering af poloxameren i filteret. Opbevar den fyldte patron ved 4 ° C, indtil 30 minutter før forsøget.

2.. Forberedelse af 3D printer

Den 3D-printer, der anvendes i dette arbejde var "BioFactory" fra regenHU. Den ekstrudering del af systemet består af flere dele. En patron under tryk foroven er fastgjort til en konnektor via en luer-lock adaptor. Konnektoren bro mellemrummene mellem udløbet fra patronen og indløbet af en magnetventil. Ved udløbet af magnetventilen, kan nåle med forskellige diametre anvendes. Materialet ekstruderes på en substrere, der holdes til en bevægende trin ved vakuum. De vigtigste dele af systemet er afbildet i figur 1.. Andre ekstrudering baserede systemer kan bruges til trykprocessen og optimeringsproces skal gøres for hvert system.

  1. Placer magnetventil (dysediameter 0,3 mm) og nålen (indvendig diameter 0,15 mm) i separate 1,5 ml reagensglas fyldt med ultrarent vand og placere dem i en opvarmet ultralydsbad til rengøring i 30 min. Skyl de rengjorte ventiler med ethanol og tør dem med et nitrogenindhold pistol.
  2. Ventilen skal installeres og nålen i printer samt en tom, ren patron.
  3. Påfør 3 bar tryk på systemet og blæse ud eventuelle resterende væske fra installerede ventil og nål med trykluft. For små nålediametre, anbefales det at have et filter (fælles sprøjtefilter, 0,45 um porestørrelse) installeret ved udgangen af ​​den komprimerede luft for at undgå optagelse af små partikler, som kunne tilstoppe nålen. Sluk for presset og installere patronen fyldt med poloxameren. Patronen skal tages ud af køleskabet cirka 30 minutter før montering af patronen, så poloxamer kan nå stuetemperatur og gel.
  4. Påfør 3 bar tryk på systemet og dispensere poloxamer indtil den når nålespidsen og ekstruderes i en kontinuerlig streng.

3.. Optimering af udskrivning Parametre

For at oprette nøjagtige 3D-strukturer, trykning proces skal optimeres til det valgte materiale og koncentration. Afhængig af viskositeten og 3D printsystem hvert materiale vil give en specifik dispensering volumen og linie tykkelse for et fast sæt af parametre.

  1. Med en passende CAD-software (stand til at skabe ISO-filer fra tegningerne), tegne en enkelt linje omkring samme længde som den struktur, at du agter at udskrive.
  2. Placer et mikroskop objektglas 25 mm x 75 mm x 1mm eller enhver anden substrat i printeren, og fastgør den ved at dreje på vakuum.
  3. I printersoftwaren, skal du indstille magnetventil til en høj frekvens på 50 Hz og sætte et højt tryk på 3 bar.
  4. Print et lag af en enkelt linje med en scene hastighed på 300 mm / min.
  5. Reducer trykket, indtil den ønskede linie bredde er nået. Du kan også styre lydstyrken, der er ekstruderet via åbningen tid af ventilen.
  6. Reducere hyppigheden af ​​ventilen, indtil nogen kontinuerlig linie kan udskrives længere. Vælg en frekvens over denne værdi.

Bemærk: Når den ønskede linje bredde og kontinuerlige linjer nås, bestemme den optimale scene hastighed og lagtykkelse, dvs elevatoren af nålen efter en trykt lag.

  1. Print flere lag oven på hinanden, og se, om nålen er i den rigtige position over det foregående lag efter flere trykte lag. Juster lagtykkelse (nål lift), Således at hvert lag er trykt oven på den næste (Figur 3).
  2. Reducer den fase hastighed etape fra 300 mm / min trinvis, så ekstruderede lag begynder og slutter på samme positioner som de tidligere ordninger (Figur 4). For høje stadie hastigheder forårsager scenen for at bevæge sig, før det ekstruderede materiale har rørt det foregående lag.
  3. Til udskrivning af søjle strukturer følge trin 3.1.-3.8., Men i stedet for at trække en enkelt linje tegne et enkelt punkt. De parametre til at fokusere på, når du udskriver søjlerne er trykket (regulerer lagtykkelse og søjle diameter poloxamer), åbningen tidspunktet for ventilen (ekstruderet mængde) og opholdstiden for printhovedet på den position, hvor søjle, bør deponeres .
  4. Når parametrene er optimeret, bør udskrive flere lag af en linje resultere i en fast væg, eller i tilfælde af de punkter, en søjle. Gem parametrene til senere brug.

Brug de parametre fundet under optimering procedure fra dette punkt.

  1. Print den indre struktur (her er det en søjle array) på et objektglas og lad det tørre natten over. Dette a) reducerer størrelsen og tykkelsen af ​​de strukturer og b), giver bedre vedhæftning mellem strukturen og substratet, så lift-off under opfyldning kan undgås.
  2. Med CAD-software, tegne en struktur, der består af en ydre mur omkring den struktur, du har til hensigt at have elueres væk og fyldt. Udskriv struktur med poloxamer. Trykningen af ​​muren vil tage 6 min.

OBS: Væggen skal udskrives mindst 3,5 mm væk fra den indre struktur på grund af dimensionerne af nålen. Ellers trykning af ydervæggen vil ødelægge den indre struktur

  1. Forbered den løsning, du ønsker at efterfylde din sacrificial støbeform med (her 1% agarose i deioniseret vand). Agaroseopløsningen bør have en temperatur mellem 35 ° C og 45 ° C. Under denne temperatur vil agarose størkne for hurtigt, over denne temperatur, kan det ødelægge de trykte søjler fordi poloxamer struktur vil blødgøre.
  2. Fyld langsomt offersystemet formen med opfyldning løsning med en pipette. Dette bør ske langsomt for at undgå ødelæggelse af strukturen inde i væggen.
  3. Lad tilbagefyldt løsning gel eller tværbinde det afhængigt af den anvendte polymer. I tilfælde af agarose størkningen fandt sted ved 4 ° C i 10 min.
  4. Placer tilbagefyldt opofrende skimmel i et isbad i 10 minutter for at eluere poloxamer struktur.
  5. Dup tilbagefyldt struktur med en papirserviet og placere den på en ny objektglas. Tryk strukturen forsigtigt på objektglas for at undgå lækage af det tredje hydrogel fra hulrummet ind i mellemrummet mellemden tilbagefyldt struktur og objektglas.

5.. Fyldning af hulrummene

  1. At fylde hulrummene efterladt af den eluerede poloxamer, fylde den tilsigtede polymeropløsning i en sprøjte udstyret med en 30 G nål. I dette eksempel har vi brugt en 1% alginat methacrylat i 0,15 M NaCl-opløsning med tilsætning af 0,05% w / v lithiumphenyl-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) og 2,5% v / v Alexa-488 konjugeret fibrinogen . Den Alexa-488 konjugeret fibrinogen blev tilføjet til visualisering formål.
  2. Photopolymerize polymeren med en høj intensitet UV-lampe (100 watt, 365 nm, afstand fra substratet var 3,5 cm) i 5 minutter og billedet konstruere ved hjælp af en epi-fluorescens eller konfokalt mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De repræsentative resultater viser, at den omvendte skimmel teknik (afbildet i figur 2) vil skabe en struktureret gel, der kan fyldes med et andet materiale. Ved begyndelsen af ​​hver trykprocessen trykning parametrene er først optimeres. Trinvis justeringer af disse parametre vil resultere i trykte flerlags konstruktioner afbildet i figur 3 og 4, når enkelte linjer udskrives. Om tykkelsen (nålen lift efter én udskrevet layer) er for lav, vil man bemærke, at nålen vil røre de foregående lag. Hvis nålen er for høj, vil en bølge mønster på overfladen af ​​den trykte konstrukt vises. Dette kan ses i figur 3A-3D, hvor alle testede lagtykkelser var for stor til den givne fase hastighed. Fordi en høj scene hastighed reducerer lagtykkelse, mindre forskelle mellem den indstillede og den aktuelle tykkelse ophobes og den bølge mønster starterat fremstå som højden af ​​konstruktionen stiger. Ved at sænke lagtykkelse, bliver forskellene mindre og bølge mønstret vises ved en højere position end før (angivet ved de stiplede linjer i figur 3C og figur 3D). For en fast lagtykkelse dette hvis scenen er for hurtig, vil resultere enten i en bølge mønster eller i konstruktioner, smal mod toppen og har en bule i begyndelsen af ​​konstruktionen (højre kant af den trykte struktur), som vist i 4A-4C. Optimerede parametre for poloxamer var en åbning på cirka 0,2 msek, en frekvens på 31,14 Hz, en lagtykkelse på 0,15 mm, et tryk på 1,5 bar og en hastighed på 75 mm / min. Udskrivning med disse parametre resulterede i glatte massive vægge som i figur 4D. Imidlertid blev et højere stadie hastighed på 100 mm / min valgt til processen at reducere produktionstiden af ​​væggene.

Med optimerede parametre for piLlar udskrivning (åbningstid 0,2 msek, frekvens 31,14 Hz, lagtykkelse 0,08 mm, tryk 1,5 bar, scene hastighed 200 mm / min, residency tid 0,3 sek) vi skabt en vifte af søjler som vist i figur 5A. Udtørrende virkning af søjle matrix resulterede i bøjning af søjlerne mod midten. Denne effekt kan reduceres, men ikke undgås, ved at placere søjler længere fra hinanden. En væg Derefter udskrives omkring søjlerne, som vist i figur 5B.

Efter eluering af opofrende poloxamer skimmel i koldt vand, blev strukturerede agarose hydrogeler som vist i figur 5C oprettet. Efter påfyldning hulrummene med fluorescerende alginat methacrylat opløsning og efterfølgende tværbinding, en roman hydrogel-i-hydrogel søjle matrix såsom den vist i figur 6 kan foretages. Den 3D z-stak rekonstruktion illustrerer tydeligt de fluorescerende søjler, der blev oprettet. Figur 7 strong> illustrerer muligheden af ​​denne teknik til også skabe vilkårligt buede forme.

Figur 1
Figur 1. Skildring af bioprinter. A) Et billede af bioprinter "BioFactory". Nålen og ventilen er ikke synlige i dette billede, men er afbildet i B). Op til 8 printhoveder er monteret på en drejning tårn, der tillader en at hurtigt at skifte mellem materialer. Trykningen sker på et bevægende scene, der kan flyttes i x-, y-og z-retningen. Klik her for at se større figur .

s.jpg "src =" / files/ftp_upload/50632/50632fig2.jpg "/>
Figur 2. Ordning af processen af produktionen af offer-forme til fremstilling af strukturerede hydrogeler.

Figur 3
Figur 3. Lagtykkelse optimering. Poloxamer lag trykt med en fast fase hastighed (250 mm / min) med aftagende tykkelse. Når tykkelsen er for høj, en bølge mønster opstår. Dette forsvinder gradvist med aftagende lagtykkelse. De røde faste linjer angiver bunden af ​​trykte konstrukt hvorimod de røde stiplede linier angiver højden af ​​defekten frie del af det trykte konstrukt. Lagtykkelser er A) 0,18 mm, B) 0,16 mm C) 0,15 mm og D) 0,13 mm. Den røde streg angiver 2 mm.

"> Figur 4
Figur 4.. Trins hastighedsregulering optimering. Poloxamer lag trykt med en lagtykkelse på 0,15 mm med forskellige hastigheder på trin A) 250 mm / min, B) 200 mm / min, C) 150 mm / min og D) 75 mm / min. Ved at sænke trins hastighedsregulering, er udgangspunktet for trykprocessen for alle lag den samme og en massiv væg kan udskrives. Den røde streg angiver 2 mm.

Figur 5
Figur 5. Produktion af mønstrede hydrogeler. A) Søjle vifte af tørret poloxamer med søjler adskilt 1,75 mm fra hinanden. Bøjningen af søjlerne er forårsaget af tørring effekter. B) Søjle matrix omgivet af en væg af poloxamer inden pipettering agarose. C) Struktureretagarose hydrogel efter fjernelse af opofrende mug.

Figur 6
Figur 6.. 3D z-stak rekonstruktion af fluorescensmærkede søjler indlejret i en agarose stillads.

Figur 7
Figur 7. Koncentriske cirkler udskrives fra poloxamer. Enkelt lag er synlige. Den røde streg angiver 2 mm.

Designkriterier Udskrivning parameter
Finere lagtykkelse
  • Pressure ↓
  • Stage hastighed ↑
  • Åbningstid ↓
  • Frekvens ↓
Mindre stregtykkelse
  • Pressure ↓
  • Stage hastighed ↑
  • Åbningstid ↓
  • Frekvens ↓
Kontinuerlig ekstrudering
  • Pressure ↑
  • Stage hastighed ↓
  • Åbningstid ↑
  • Frekvens ↑
Hurtigere byggeri hastighed
  • Pressure ↑
  • Stage hastighed ↑
  • Åbningstid ↑
  • Frekvens ↑

Tabel 1. Fire design parametre for ekstrudering af poloxamer linjer og hvordan de kan blive påvirket af forskellige trykkerier parametre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her præsenterer vi for første gang, at anvendelsen af ​​en termoresponsiv polymer til en opofrende støbeform, der hurtigt kan elueres i koldt vand på grund af gel-sol-overgang poloxamer på ~ 20 ° C. Hastigheden af ​​hele processen gør poloxamer interessant for en hurtig oprettelse af biopolymer strukturer, der ikke kan udskrives med tilstrækkelig opløsning. Teknikken beskrevet her kan anvendes til mønsterdannelse en hydrogel i en anden hydrogel eller til oprettelse af mikrofluidkanaler som det tidligere er blevet rapporteret for andre materialer 35. Fordelen ved poloxameren som en opofrende formen er, at det kan udskrives i arbitrære geometrier til fast lag af lag-konstruktioner, der kan fyldes, og elueres bagefter.

Vi beskriver her processen med at skabe en opofrende form med poloxamer med efterfølgende opfyldning af et sekund hydrogel til at skabe strukturerede hydrogeler. Materialet til den strukturerede hydrogel kan være lmOsen med begrænsninger i forhold til viskositet og temperatur på det punkt fyldning. Lavviskos precursor løsninger af almindeligt anvendte polymerer såsom polyethylenglycoldiacrylat 36,37, alginat 38,39, agarose 40 og methacrylerede biopolymerer 41-43 er blot nogle få eksempler på egnede fyldningsmaterialer. Højviskose materialer kan dog ikke fylde snævre geometrier eller kan ødelægge opofrende mug i tilfælde af tynde skrøbelige strukturer såsom søjlerne udskrives her. En lav procentdel agaroseopløsning blev derfor valgt til opfyldning. En anden fordel ved at anvende agarose i kombination med poloxamer er, at det gelerer ved afkøling. Derfor når nedsænket i koldt vand, agarose bevarer sin geléagtig stat, en stat, der afspejler den inverse trykte poloxamer mønster.

De vigtige skridt i denne procedure indebærer optimering af trykkerier parametre fyldning af offer Skimmelsvamp ogfyldning af hulrummene. For udskrift der er optimeret var hyppigheden og åbning tid af ventilen, det tryk, fase hastighed og lagtykkelsen. Lagtykkelsen er defineret som løft af nålen efter hver trykt lag. I tilfælde af søjlerne, hjemsted tid dvs den tid materialet ekstruderes på et punkt uden at flytte scenen, havde også justeres. Optimeringsproces kan være tidskrævende, fordi ændringer i en parameter kan have indvirkning på flere design parametre ekstruderede linjer. De vigtigste parametre for forskellige design kriterier er beskrevet i tabel 1..

Det andet vigtige skridt i processen er fyldning af offersystemet mug. Opfyldningen af ​​det hellige mug er en delikat skridt. Små og smalle strukturer skal udfyldes omhyggeligt, ofte manuelt og enkel støbning af løsninger måske ikke altid være muligt.

Omhyggelig fyldning af sacrificial formen med agarose blev derfor udført ved hjælp af en 100 gl pipette for at undgå ødelæggelse af søjlerne. Det sidste trin, fyldning af hulrummene, krævet anvendelse af en sprøjte udstyret med en 30 G nål. Der bør udvises omhu for at undgå bobledannelse under fyldningen.

De forskellige geler i konstruktionen præsenteres her kan også indeholde celler. Ved at placere én celletype i hydrogelerne inden for de hulrum og en anden celle typen inde i strukturerede hydrogel, kan et rumligt defineret co-kultur setup blive oprettet. Sammenkoblede 3D ​​netværk som i publikationen fra Miller et al. 30., vaskulære eller neurale netværk er også mulige. En mulig tilgang til sådanne net ville være at udskrive linjer inden en omgivende mur og fylde hulrummene med den anden hydrogel, crosslink den anden hydrogel og fortsætte med at udskrive det næste lag roteres 90 °. Fordelen ved trykning poloxamer som en opofrende formen er, at det hverken kræveren mester skimmel eller en maske. Det kan heller ikke kræve en opvarmet printerhoved at ekstrudere materialet og tilstopning af systemet er ikke blevet observeret i vores eksperimenter.

Konstruktioner som dem præsenteret her kan anvendes i fremtiden som rumligt organiseret 3D co-kulturer at studere diffusion-baserede celle-celle interaktioner eller for lægemiddelforskning. Men en fuldt automatiseret version af proceduren, der præsenteres her skal udvikles for at få succes inden for lægemiddel-screening.

For at opsummere, har vi præsenteret en metode, der tillader udskrivning af vilkårlige geometrier, der kan udfyldes med hydrogeler og elueres bagefter. På den måde kan strukturerede hydrogel-in-hydrogel arkitekturer blive oprettet i en enkel og omkostningseffektiv måde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at erklære.

Acknowledgments

Vi takker Deborah Studer for hjælp med bioprinter.

Arbejdet blev finansieret af Den Europæiske Union syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under tilskudsaftale nr. NMP4-SL-2009 til 229.292.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Poloxamer (Pluronic F127) Sigma P2443
PBS Invitrogen 10010-015
CAD software regenHU BioCAD
Alginate methacrylate Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate Invitrogen F13191
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Agarose Lonza 50004
EQUIPMENT
Bioprinter regenHU Biofactory
Valve regenHU 300 μm Nozzel Diameter
Needle regenHU 150 μm Inner Diameter
Zeiss Axioobserver with ApoTome Zeiss
UV Light Source UVP Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp 100 W

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fedorovich, N. E., et al. Evaluation of photocrosslinked Lutrol hydrogel for tissue printing applications. Biomacromolecules. 10, 1689-1696 (2009).
  2. Lee, K. B., Park, S. J., Mirkin, C. A. Protein nanoarrays generated by Dip-Pen Nanolithography. Abstr Pap Am Chem S. 223, C94 (2002).
  3. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual review of biomedical engineering. 3, 335-373 (2001).
  4. Mironov, V., Reis, N., Derby, B. Review: bioprinting: a beginning. Tissue engineering. 12, 631-634 (2006).
  5. Odde, D. J., Renn, M. J. Laser-guided direct writing of living cells. Biotechnology and bioengineering. 67, 312-318 (2000).
  6. Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J Mater Chem. 18, 5717-5721 (1039).
  7. Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nature. 2, 265-271 (2003).
  8. Engelhardt, S., et al. Fabrication of 2D protein microstructures and 3D polymer-protein hybrid microstructures by two-photon polymerization. Biofabrication. 3, 025003 (2011).
  9. Mironov, V. Printing technology to produce living tissue. Expert opinion on biological therapy. 3, 701-704 (2003).
  10. Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. Regenerative medicine. 3, 93-103 (2008).
  11. Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current opinion in biotechnology. 22, 667-673 (2011).
  12. Fedorovich, N. E., De Wijn, J. R., Verbout, A. J., Alblas, J., Dhert, W. J. Three-dimensional fiber deposition of cell-laden, viable, patterned constructs for bone tissue printing. Tissue engineering. Part A. 14, 127-133 (2008).
  13. Dhariwala, B., Hunt, E., Boland, T. Rapid prototyping of tissue-engineering constructs, using photopolymerizable hydrogels and stereolithography. Tissue engineering. 10, 1316-1322 (2004).
  14. Cook, C., Wang, T., Derby, B. Inkjet Printing of Enzymes for Glucose Biosensors. Mater Res Soc Symp P. 1191, 103-109 (2009).
  15. Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol Lett. 1-7 (2012).
  16. Fabrication of a Glucose Biosensor by Piezoelectric Inkjet Printing. Wang, T. M., Cook, C., Derby, B. 2009 3rd International Conference on Sensor Technologies and Applications (Sensorcomm 2009), 82-85 (2009).
  17. Shim, J. H., Lee, J. S., Kim, J. Y., Cho, D. W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. J. Micromech. Microeng. 22, (2012).
  18. Malmsten, M., Lindman, B. Self-Assembly in Aqueous Block Copolymer Solutions. Macromolecules. 25, 5440-5445 (1021).
  19. Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, I132-I137 (2006).
  20. Matsumura, G., Hibino, N., Ikada, Y., Kurosawa, H., Shin'oka, T. Successful application of tissue engineered vascular autografts: clinical experience. Biomaterials. 24, 2303-2308 (2003).
  21. Kropp, B. P., Zwischenberger, J. B. Tissue-engineered autologous bladders: new possibilities for cystoplasty. Nature clinical practice. Urology. 3, 588-589 (2006).
  22. Oberpenning, F., Meng, J., Yoo, J. J., Atala, A. De novo reconstitution of a functional mammalian urinary bladder by tissue engineering. Nature. 17, 149-155 (1999).
  23. Wood, F. Tissue engineering of skin. Clinics in plastic surgery. 39, 21-32 (2012).
  24. Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering--in vivo and in vitro applications. Clinics in plastic surgery. 39, 33-58 (2012).
  25. Bannasch, H., Momeni, A., Knam, F., Stark, G. B., Fohn, M. Tissue engineering of skin substitutes. Panminerva medica. 47, 53-60 (2005).
  26. Jakab, K., Neagu, A., Mironov, V., Forgacs, G. Organ printing: fiction or science. Biorheology. 41, 371-375 (2004).
  27. Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. The anatomical record. Part A, Discoveries in molecular, cellular, and evolutionary biology. 272, 497-502 (2003).
  28. Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
  29. Raimondi, M. T., et al. Two-photon laser polymerization: from fundamentals to biomedical application in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of applied biomaterials. 10, 56-66 (2012).
  30. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature. 11, 768-774 (2012).
  31. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).
  32. Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. Journal of biomedical materials research. Part A. 101, 272-284 (2013).
  33. He, J., Li, D., Liu, Y., Gong, H., Lu, B. Indirect fabrication of microstructured chitosan-gelatin scaffolds using rapid prototyping. Virtual and Physical Prototyping. 3, 159-166 (2008).
  34. Sachlos, E., Reis, N., Ainsley, C., Derby, B., Czernuszka, J. T. Novel collagen scaffolds with predefined internal morphology made by solid freeform fabrication. Biomaterials. 24, 1487-1497 (2003).
  35. Lee, W., et al. On-demand three-dimensional freeform fabrication of multi-layered hydrogel scaffold with fluidic channels. Biotechnology and bioengineering. 105, 1178-1186 (2010).
  36. Turturro, M., Christenson, M., Larson, J., Papavasiliou, G. Matrix metalloproteinase (MMP) sensitive PEG diacrylate (PEGDA) hydrogels with spatial variations in matrix properties direct vascular cell invasion. J. Tissue. 6, 302-302 (2012).
  37. Butterworth, A., Garcia, M. D. L., Beebe, D. Photopolymerized poly(ethylene) glycol diacrylate (PEGDA) microfluidic devices. Roy. Soc. Ch. 4-6 (2005).
  38. Shachar, M., Tsur-Gang, O., Dvir, T., Leor, J., Cohen, S. The effect of immobilized RGD peptide in alginate scaffolds on cardiac tissue engineering. Acta biomaterialia. 7, 152-162 (2011).
  39. Jeon, O., Bouhadir, K. H., Mansour, J. M., Alsberg, E. Photocrosslinked alginate hydrogels with tunable biodegradation rates and mechanical properties. Biomaterials. 30, 2724-2734 (2009).
  40. Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng-T Asme. 122, 252-260 (2000).
  41. D'Arrigo, G., et al. Hyaluronic acid methacrylate derivatives and calcium alginate interpenetrated hydrogel networks for biomedical applications: physico-chemical characterization and protein release. Colloid Polym. Sci. 290, 1575-1582 (2012).
  42. Pescosolido, L., et al. Hyaluronic Acid and Dextran-Based Semi-IPN Hydrogels as Biomaterials for Bioprinting. Biomacromolecules. 12, 1831-1838 (2011).
  43. Guo, Y., et al. Hydrogels of collagen/chondroitin sulfate/hyaluronan interpenetrating polymer network for cartilage tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 23, 2267-2279 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics