Aislamiento de tejido adiposo células inmunes

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

El tejido adiposo (AT) es un sitio de activación de células inmunes y la interacción intensa. Casi todas las células del sistema inmune están presentes en AT y sus proporciones se alteran por la obesidad. Aislamiento adecuado, cuantificación y caracterización de las poblaciones de células inmunes son fundamentales para la comprensión de su papel en la enfermedad immunometabolic.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Orr, J. S., Kennedy, A. J., Hasty, A. H. Isolation of Adipose Tissue Immune Cells. J. Vis. Exp. (75), e50707, doi:10.3791/50707 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

El descubrimiento de aumento de la infiltración de macrófagos en el tejido adiposo (AT) de los roedores y los seres humanos obesos ha dado lugar a una intensificación de interés en la contribución de células inmunes a la resistencia a la insulina local y sistémica. Aislamiento y cuantificación de diferentes poblaciones de células inmunes en magra y obesos AT es ahora una técnica comúnmente utilizada en los laboratorios immunometabolism; todavía extrema se debe tener cuidado tanto en el aislamiento de células del estroma vascular y en el análisis de citometría de flujo, de modo que los datos obtenidos es fiable e interpretables . En este video se demuestra cómo pica, digerir, y aislar la fracción vascular estromal enriquecida con células inmunes. A continuación, mostramos cómo los macrófagos etiqueta de anticuerpos y los linfocitos T y la forma de la puerta correctamente en los experimentos de citometría de flujo. Se proporcionan flujo representativos parcelas citometría de bajos magras y grasa de alto ratones obesos alimentados con grasa alimentados. Un elemento crítico de este análisis es el uso de anticuerpos que hacenno fluorescencia en los canales donde AT macrófagos son naturalmente autofluorescente, así como el uso de los controles de compensación adecuados.

Introduction

Históricamente, el tejido adiposo (AT) ha sido considerada como un órgano inerte de almacenamiento de lípidos, que se expande y contrae en respuesta al balance energético. Ahora entendemos que AT representa un órgano endocrino que segrega dinámica activamente una serie de hormonas, que influyen directamente en el comportamiento de alimentación y sistémicos homeostasis de la glucosa. Además, durante la última década ha habido un reconocimiento creciente de los numerosos poblaciones de células inmunes residentes en el AT fracción del estroma vascular (SVF), así como su contribución a la homeostasis de AT.

La capacidad de separar la AT adipocitos y SVF usando una colagenasa digestión seguido de centrifugación diferencial fue descrito por primera vez por Rodbell en 1964 1. Colagenasa II es la más utilizada para la separación de los adipocitos y SVF debido al mantenimiento de los receptores de insulina adipocitos 1. Desde el principio, el fraccionamiento enzimático de AT fue empleado principalmente para estudiar AdipoCYTE metabolismo y aislar preadipocitos. Más recientemente, esta técnica, combinada con la disponibilidad generalizada de citómetros de flujo y el cada vez mayor número de anticuerpos conjugados con fluoróforo disponibles comercialmente, ha facilitado la caracterización de AT células inmunes.

Aunque la presencia de células inmunes en inflamado AT había sido descrito previamente 2, los papeles seminales por Weisberg et al. y Xu et al. publicado en 2003 fueron los primeros en documentar la acumulación de macrófagos AT (cajeros automáticos) de la obesidad, que secretan citoquinas inflamatorias y se correlaciona con AT-específica y la resistencia a la insulina sistémica 3,4. Estas observaciones sirven como la base de un nuevo campo de investigación acuñado recientemente, "immunometabolism," 5 y han sido objeto de seguimiento por estudios que implican diversas poblaciones de células inmunes, incluyendo células dendríticas 6, mastocitos, células T 7 8 -10, 11 las células B, células NKT 12, 13, eosinófilos y neutrófilos 14,15 en el desarrollo de la obesidad resistencia a la insulina asociada.

El objetivo de este artículo es proporcionar una descripción detallada de la técnica de digestión de colagenasa utilizado para aislar las células de la AT SVF y para caracterizar los cajeros automáticos y AT células T a través de citometría de flujo. Este protocolo ha sido optimizado para ratón AT, sin embargo, los espectadores pueden beneficiarse de la lectura de un artículo excelente que proporciona una descripción más detallada en la optimización de esta técnica para el consumo humano a los 16 años. El público objetivo de este artículo incluye investigadores con poca experiencia de trabajo con el ratón AT y la realización de citometría de flujo. Varias consideraciones prácticas para equilibrar el rendimiento y la viabilidad celular con el tiempo y los recursos se presentan, así como controles de citometría de flujo óptimas para la caracterización de las poblaciones de células inmunes. Además de nuestro protocolo, los lectores son referred a un reciente artículo de Jove por Basu et al. para una excelente discusión sobre algunos de los aspectos técnicos de la citometría de flujo para incluir controles adecuados y compensaciones 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Reactivos y suministros

Antes de iniciar este protocolo experimental, se preparan los siguientes reactivos:

  1. Etanol al 70%
  2. 1X PBS
  3. 1X DPBS (sin Ca y Mg) suplementado con 0,5% de BSA
  4. Tampón FACS: 1X DPBS (sin Ca y Mg), 2 mM de EDTA, y 1% de FCS
  5. Tampón ACK: 150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO3, y 0,1 mM Na 2 EDTA en agua

2. Recolección y Preparación de tejido adiposo

  1. La eutanasia a los ratones de acuerdo con los procedimientos aprobados IACUC específicos de cada institución.
  2. Mojar bien la piel con etanol al 70%.
  3. Hacer una incisión a nivel de la apófisis xifoides (parte inferior del esternón) y abrir la cavidad torácica para exponer el corazón, con cuidado de no romper los vasos sanguíneos principales.

Nota: En este punto, también es útil para salir de la membrana intacta tanto comoposible y para cortar una muesca de la parte derecha de la caja torácica para permitir que la sangre y el líquido de perfusión a fluir fuera de la cavidad torácica.

  1. Clip de la aurícula derecha para permitir que la sangre y el líquido de perfusión para escapar del sistema circulatorio.

Nota: Cuando se trata de ratones obesos, el exceso de pericardio AT puede necesitar ser retirado para permitir el acceso al corazón.

  1. Sujete el corazón con pinzas e inserte suavemente una aguja en el ventrículo izquierdo a través del ápice. Lentamente perfundir el ratón con 15 ml de PBS estéril.

Nota: Reducir la tasa de perfusión si los pulmones comienzan a llenarse y ampliar.

  1. Abra la cavidad peritoneal y eliminar las bolsas de grasa perigonadal con cuidado para evitar cualquier tejido gonadal.
  2. Colocar almohadillas de grasa en un barco pesan en hielo que contiene 2 ml de 1X DPBS (sin Mg o Ca) suplementado con 0,5% de BSA, y pelos en el AT en trozos finos.

Nota: Limite la cantidad de AT por barco pesa 1,2 g. Si la cantidad de AT supera 1,2 g, se divide en partes iguales entre dos barcos pesan.

  1. Mantenga AT muestras en hielo y preparar 3 ml de solución de digestión colagenasa por AT muestra formada por 1X DPBS complementado con 0,5% de BSA, 10 mM CaCl 2 y 4 mg / ml de colagenasa tipo II.

3. Digestión con colagenasa

  1. Transferencia de AT a tubos cónicos de 50 ml mediante el vertido de la homogeneizado y enjuagar el barco sopesar con 1 ml de DPBS (0,5% de BSA) y 3 ml de solución de digestión de colagenasa II.
  2. Incubar a homogeneizado en un agitador rotatorio (200 rpm) a 37 ° C durante 20 min.
  3. Añadir 10 ml de DPBS (0,5% BSA) para tubos cónicos y colocar en hielo.
  4. Se tritura homogeneizado numerosas veces usando una pipeta de 10 ml serológica, y pasar las suspensiones celulares a través de filtro de 100 micras para un nuevo tubo cónico de 50 ml.
  5. Centrifugar la suspensión de células a 500 xg durante 10 min a 4 y dpor ejemplo, C.
  6. Decantar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células SVF en 3 ml de tampón de lisis ACK de eritrocitos contaminantes.
  7. Añadir 12 ml de tampón FACS y la suspensión de células se centrifuga a 500 xg durante 10 min a 4 ° C.
  8. Decantar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células SVF en tampón FACS.

Nota: Utilice el tamaño del sedimento celular como una guía para la cantidad de tampón FACS para volver a suspender pulg Si el sedimento celular cubre la parte inferior del tubo de 50 ml cónico, utilizar 0,5-1 ml de tampón FACS, de lo contrario, volver a suspender en 0.25-0.5 ml.

  1. Colocar las muestras en hielo y se preparan partes alícuotas de la dilución 1:10 de cada muestra para recuento de células mediante la mezcla de 40 l de tampón FACS, 50 l solución de azul de tripano (0,2%), y 10 l de suspensión celular.
  2. Contar las células viables basándose en la exclusión de azul de tripano y se diluye suspensiones de células a una concentración final de 5-10 x 10 6 células / ml.

4. La tinción de antígenos de superficie celular

Añadir anti-ratón CD16/CD32 anticuerpo (Fc bloque) a una concentración final de 0,5-1 μg/10 6 células, y se incuba en hielo durante 10 min.
  • Muestras de Transferencia (≥ 10 6 células) a 12 tubos de fondo redondo de 75 mm de poliestireno. Preparar tubos separados que si el análisis de las células T y cajeros automáticos, y combinar células adicionales para preparar un número suficiente de tubos para acomodar la compensación requerida y la fluorescencia modificado menos uno (FMO) controles.
  • Nota: Como un ejemplo, cuando la cuantificación de la proporción de cajeros automáticos basado en F4/80 y CD11b, la siguiente compensación y controles FMO tendrá que ser preparado:

    - Unstained (células)

    - DAPI o yoduro de propidio (PI) de manchas individuales (células; no agregan tintes viabilidad hasta el paso 5.1)

    - F4/80 APC (células o perlas de compensación) individuales mancha

    - FITC células individuales o mancha (CD11bcuentas de compensación)

    - FMO 1 (células): rata IgG2a κ isotipo de control APC + CD11b FITC + tinte viabilidad (añadido en el paso 5.1)

    - FMO 2 (células): F4/80 APC + rata IgG2b κ isotipo de control FITC + tinte de viabilidad (añadido en el paso 5.1)

    1. Añadir anticuerpos primarios conjugados con fluoróforo y / o controles de isotipo a la concentración apropiada (véase la Tabla de reactivos y materiales).
    2. Proteger muestras de la luz y se incuba a 4 ° C durante 30 min.
    3. Añadir 2 ml de tampón FACS y la suspensión de células se centrifuga a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
    4. Se decanta el sobrenadante y resuspender el pellet de células SVF en 2 ml de tampón FACS.
    5. Centrifugar la suspensión celular 500 xg durante 5 min a 4 ° C, y resuspender el sedimento celular en SVF ≥ 400 l de tampón FACS.
    6. Transferir las muestras a 12 mm de poliestireno x 75 tubos de fondo redondo equipado con un 35 blusas de tubo colador de células m.
    7. Proteger de la luz, y las muestras se almacenan a 4 ° C hasta el análisis FACS.

    Nota: Para obtener resultados óptimos, las células deben ser analizados Golden Retriever, sin embargo, el análisis FACS con este protocolo se ha realizado con éxito en células marcadas almacenadas en tampón FACS durante 1-2 horas a 4 ° C. Si las células necesitan para ser fijado a aumentar el tiempo de almacenamiento, las células marcadas pueden ser fijadas con paraformaldehído al 2% a 4 ° C durante 24 horas antes del análisis FACS. Empresas anticuerpos sugieren que las células marcadas se pueden almacenar durante hasta una semana, sin embargo, esto no ha sido probado en el marco de este procedimiento.

    5. Análisis FACS

    1. Antes del análisis FACS, añadir colorante viabilidad de las muestras y los controles adecuados para permitir la discriminación de células vivas / muertas.

    Nota: Numerosos colorantes de viabilidad están disponibles comercialmente, pero DAPI y PI se recomiendan en función de la prof excitación / emisiónIles de los anticuerpos conjugados con fluoróforo se utilizan. DAPI y yoduro de propidio se añadieron a cada muestra a una concentración final de 0,2 mg / ml.

    1. Utilice una muestra de control negativo sin teñir, preferiblemente células aisladas a partir del mismo tejido que las muestras experimentales, para ajustar la dispersión lateral (SSC) y la dispersión hacia adelante (FSC) de modo que la población de células (s) de interés están en escala.

    Nota: Para el análisis de AT células SVF, se recomienda que la CSS se muestra en una escala logarítmica frente a FSC en una escala lineal. El uso de una escala logarítmica para SSC es especialmente importante en el análisis de los cajeros automáticos, que a menudo son muy grandes y granulares.

    1. Dibuja una puerta de dispersión de la luz inicial basada en el tipo de célula (s) que se analiza, y ajustar el tubo fotomultiplicador (PMT) de ganancia para que las células no teñidas se encuentran en el extremo izquierdo de un histograma de un solo parámetro (aproximadamente centrado en 10 2) por los cauces adecuados. </ Li>

    Nota: Se recomienda que los linfocitos y los macrófagos (u otras células mieloides) se analizaron por separado debido a las diferencias en la autofluorescencia.

    1. Utilice los controles de manchas individuales o anticuerpos cuentas de compensación de captura para realizar la compensación de varios colores.

    Nota: Se recomienda el uso de cuentas de compensación, sin embargo, se debe garantizar la compatibilidad de cada anticuerpo. Por ejemplo, los granos de compensación pueden no reaccionar de forma cruzada con anticuerpos de conejo, en cuyo caso se requieren células aisladas para obtener un control de mancha única apropiada.

    1. Establezca puertas experimentales basados ​​en controles FMO modificados.
    2. Ajuste el citómetro de flujo para recoger la cantidad apropiada de eventos en función de la prevalencia de la población de interés y registrar los datos experimentales.
    3. Exportar archivos de datos FCS para el análisis fuera de línea. Existen numerosos programas disponibles para cytometr flujoy análisis de datos. Recomendamos Cytobank, una plataforma basada en la web que permite a los investigatores para almacenar y analizar datos y generar datos desde cualquier computadora con acceso a Internet 18. Además, Cytobank ofrece la posibilidad de poner a disposición pública los datos o restringir el acceso a los colaboradores.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Digestión con colagenasa de AT seguido de centrifugación diferencial se utilizó para aislar el SVF de almohadillas de grasa del epidídimo de ratones macho C57BL/6J alimentados con una baja en grasas (10% kcal de la grasa) o alta en grasas (60% kcal de la grasa) dieta (LFD y HFD , respectivamente) durante 16 semanas. Las células de la SVF fueron etiquetados con anticuerpos primarios conjugados con fluoróforo para cuantificar la proporción de cajeros automáticos viables (Figura 1) y AT células T (Figura 2) a través de análisis FACS. Gating inicial, incluyendo la dispersión de luz, la discriminación doblete, y las puertas de viabilidad se representan en las figuras 1A y 2A. Debe hacerse hincapié en que la puerta de dispersión de luz inicial en la Figura 2A se limita a la población de linfocitos con el fin de evitar la inclusión de células mieloides autofluorescentes. Un ejemplo del uso modificado FMO controles para ajustar las puertas experimentales se muestra en la Figura 1B. En este ejemplo, la F4/80 (columna de la izquierda) y los anticuerpos CD11b (columna derecha) son reemplazados por controles de isotipo apropiadas para dar cuenta de la unión autofluorescencia y no específicos. Puertas Quadrant son extraídas para identificar viable cajeros automáticos (F4/80 + CD11b +). De apertura de puerta para CD4 + y CD8 + células T AT se muestra en la Figura 2B. Viable en los linfocitos son primero cerrado para TCRβ (columna izquierda). Posteriormente, las células TCRβ + AT T son cerrada para CD4 y CD8 (columna derecha).

    Figura 1
    Figura 1. Los macrófagos del tejido adiposo. El SVF fue aislado de la AT del epidídimo de ratones macho C57BL/6J alimentados con una dieta baja en grasa o alto contenido en grasas durante 16 semanas utilizando el protocolo de digestión de colagenasa. Posteriormenteconsiguiente, las células se tiñeron para SVF F4/80 y CD11b y análisis de FACS se llevó a cabo utilizando un citómetro de flujo para identificar los cajeros automáticos. (A) la dispersión de luz inicial y puertas de viabilidad. (B) modificado FMO controla la incorporación de anticuerpos isotipo de CD11b y F4/80 se utiliza para alinear cuadrante puertas. (C) La comparación de la proporción de F4/80 + CD11b + ATMs del al de grasas y grasas ratones alimentados bajos. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

    La figura 2
    Figura 2. Las células T del tejido adiposo. El SVF se aisló a partir del tejido adiposo de epidídimo de ratones macho C57BL/6J alimentados con una baja en grasa o una dieta alta en grasa durante 16 semanas utilizando tl protocolo digest colagenasa. Posteriormente, las células se tiñeron para SVF TCRβ, CD4, y CD8a y análisis de FACS se llevó a cabo utilizando un citómetro de flujo para caracterizar las células T AT. (A) la dispersión de luz inicial y puertas de viabilidad. (BC) La comparación de la proporción de TCRβ + células T (columna izquierda) y de las células CD4 + y CD8 + células T (columna derecha) de la AT de (B) bajo en grasa y (c) los ratones alimentados con alto contenido de grasa. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    El creciente interés en el papel del sistema inmune en las consecuencias metabólicas de la obesidad ha llevado al uso generalizado de citometría de flujo para caracterizar las células inmunes de la AT. Aunque el protocolo exacto varía entre los laboratorios en base a su propia experiencia y los equipos disponibles, los pasos críticos incluyen la digestión colagenasa, centrifugación diferencial, y la superficie de la célula etiquetado antígeno. El objetivo del presente artículo es proporcionar un protocolo detallado y guía práctica para el aislamiento de la AT SVF a los investigadores con poca experiencia de trabajo con AT y / o la realización de citometría de flujo.

    Como con cualquier técnica experimental, hay numerosas variaciones que pueden o no pueden tener un impacto significativo en el resultado deseado. Basándonos en nuestra experiencia, el protocolo detallado en este documento representa el equilibrio más eficaz entre el tiempo, los recursos, el rendimiento celular y la viabilidad celular. Por ejemplo, hemos encontrado que el aumento de laduración de la digestión con colagenasa II a tanto como 60 min a concentraciones similares de colagenasa tiene un impacto insignificante sobre el rendimiento celular, por lo que nosotros utilizamos un 20 min digestión con el fin de reducir la duración de la exposición colagenasa. Colagenasa II es la colagenasa más comúnmente utilizado para digestiones de tejido adiposo. Una descripción de todos los diferentes colagenasas y sus usos principales se puede encontrar en el sitio web de Sigma. Rendimientos celulares típicos del protocolo anterior son 2-3 x 10 6 y 4-5 x 10 6 células / g al de los ratones alimentados con un bajo contenido de grasa (10% de kilocalorías de grasa) y alta en grasas (60% de kilocalorías de grasa), la dieta de 16 semanas, respectivamente. Además de variar los tiempos de digestión de colagenasa, hay un número de posibles modificaciones en el protocolo actual en función del modelo experimental que está siendo utilizado, incluyendo el tratamiento dietético. En primer lugar, cuando la extracción en el momento de los ratones alimentados con una dieta enriquecida en ácidos grasos de colesterol o saturado, evite mantener las muestras en hielo antes del picado porque la UnT se solidificará y dificultar picado. En segundo lugar, el protocolo incluye una etapa de lisis de eritrocitos (3,6), sin embargo, una perfusión inicial exitosa a menudo hace que este paso innecesario. En tercer lugar, se debe tener cuidado de no agregar más de 10 mM de CaCl2 a la solución de digestión con colagenasa (concentración final 5 mM); mayores concentraciones de calcio pueden dar lugar a la formación de un precipitado de fosfato de calcio. Si este precipitado se forma después de la etapa de centrifugación inicial (3.5), añadir dos pasos de lavado con 20 ml de tampón FACS (que contiene EDTA) antes de la etapa de lisis de eritrocitos para eliminar el precipitado. En cuarto lugar, se recomienda que los investigadores utilizan todo al menos una capa de grasa perigonadal al aislar el SVF. Hacemos esta recomendación no debido a las limitaciones en el rendimiento celular, pero debido a diversas poblaciones de células mostramos diferentes distribuciones regionales 19. Por lo tanto, los resultados pueden estar sesgados cuando sólo una parte de la almohadilla de grasa perigonadal nosotros esed para aislar células inmunes residentes en el AT. Si toda la almohadilla de grasa es mayor que 1,2 gramos, se divide el tejido adiposo longitudinalmente desde el rostral a caudal extremos. Si dividido en la mitad de esta manera, cada medio debe proporcionar una población representativa de las células y, en general debe ser inferior a 1,2 gramos. Sin embargo, en el caso de que esta es todavía más de 1,2 gramos, se recomienda la realización de digestiones de colagenasa de 1,2 gramo segmentos en tubos separados, y entonces la combinación de todas las células SVF para la citometría de flujo. Además, para los ratones delgados, puede ser necesario combinar las almohadillas de grasa de 2 o 3 ratones para obtener suficientes células SVF para el análisis de citometría de flujo. La necesidad de ratones adicionales debe ser contabilizada en el diseño de experimentos. Por último, otra forma de mostrar los datos es el número de células por gramo de tejido. Si se desea una densidad celular, la AT debe sopesarse antes de ser picada y la digestión.

    En cuanto a la caracterización de AT células de FVE mediante citometría de flujo, dospuntos deben ser enfatizados. En primer lugar, todos los anticuerpos primarios fluoróforo conjugados deben ser validados para su uso con AT células SVF y debidamente tituladas. Aunque hemos demostrado una compensación con los granos, que había valorado previamente estos anticuerpos con AT SVF. En la caracterización de los macrófagos, se recomienda contra el uso de colorantes en tándem (por ejemplo, PE-Cy7), como hemos tenido resultados mezclados con respecto a la unión no específica de los cajeros automáticos utilizando anticuerpos conjugados con estos colorantes. Además, fluoróforos tales como PE y FITC sólo se deben usar después de la titulación cuidado como se describió anteriormente. Una lista de los anticuerpos específicos que comúnmente se utiliza para caracterizar AT células SVF, junto con las concentraciones recomendadas se puede encontrar en la figura en el Cuadro 1. En segundo lugar, porque los cajeros automáticos tienen una fuerte autofluorescencia y una serie de anticuerpos muestran un bajo nivel de unión no específica cuando se usa en una concentración elevada, se recomienda el uso de la modificación FMO controles para ajustar las puertas experimentales.Controles FMO se generan mediante la tinción de un conjunto de muestras de control con todos menos uno de los anticuerpos utilizados para etiquetar las muestras experimentales 20. Hemos modificado los controles FMO en nuestro protocolo para reemplazar uno de los anticuerpos con un control de isotipo conjugado con fluoróforo apropiado en lugar de la simple eliminación de ella. En la práctica, puede ser aceptable para renunciar a los controles de FMO para los anticuerpos que proporcionan separación excepcional entre las poblaciones positivas y negativas. Además de estos controles, se dará cuenta de que antes de compuerta en los anticuerpos, que preseleccionar para poblaciones de linfocitos y macrófagos sobre la base de dispersión hacia adelante y lateral. Esto eliminará la detección de los macrófagos autofluorescent en el análisis de las poblaciones de linfocitos con fluoróforos tales como FITC y colorantes en tándem.

    Aunque los protocolos detallados están más allá del alcance de este artículo, la técnica de aislamiento descrito sirve como un primer paso importante para numerosas técnicas destinadas a caterizing células inmunes residentes en el AT. Por ejemplo, el aislamiento arriba y protocolo de tinción se pueden utilizar para facilitar la clasificación de las poblaciones específicas de la cual puede aislarse mRNA para analizar la expresión génica. Además, simples modificaciones en el protocolo se pueden hacer para permitir el tratamiento ex vivo de cajeros automáticos. Tales modificaciones podrían incluir la utilización de técnicas estériles para obtener el SVF, que luego se lavó dos veces y se resuspendió en un medio de cultivo de células apropiadas. En lugar de la adición de anticuerpos fluoróforo conjugados para teñir antígenos de superficie celular, el SVF se puede añadir a placas de cultivo de tejidos no tratados para enriquecer en cajeros automáticos a través de la adhesión de plástico (aunque esto no se puede afirmar que ser una población pura como fibroblastos y preadipocitos también se puede adherir ). Esto se logra mediante el cultivo de la SVF durante 2-4 horas a 37 ° C seguido por dos etapas de lavado para eliminar las células no adherentes. Cajeros automáticos a continuación, puede ser tratada en consecuencia y se cosecha usando una disociación celular EDTA basado en por lolución para citometría de flujo o se lisaron en tampón RIPA o Trizol para el aislamiento de ARN o proteína, respectivamente. Independientemente de la aplicación posterior, la técnica de digestión colagenasa para el aislamiento de los adipocitos y células SVF descritos por primera vez por Rodbell en 1964 1 sigue siendo una valiosa herramienta para la caracterización de AT células inmunes y su contribución a las consecuencias metabólicas de la obesidad.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    No tenemos nada que revelar.

    Acknowledgements

    JSO se apoya en un NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), Alaska con el apoyo de una beca posdoctoral de la Asociación Americana de Diabetes (7-10-MI-05), y AHH se apoya en un American Heart Association Fundada Investigator Award (12EIA8270000). Experimentos de citometría de flujo se realizaron en el Flujo VMC Citometría de recursos compartidos. El VMC Citometría de flujo de recursos compartidos con el apoyo del Centro de Investigación de Enfermedades Digestivas Vanderbilt (DK058404).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml Life Technologies 14190-250
    DAPI Life Technologies D3571
    BSA Sigma A2153-100G
    collagenase Sigma C6885-5G
    propidium iodide solution Sigma P4864-10 ml
    stable stack 20 microliter Rainin SS-L10
    20 microliter filter tips Rainin SRL10F
    stable stack 250 microliter tips Rainin SS-L250
    1000 microliter tips Rainin GPS-L1000
    1000 microliter filter tips Rainin GP-L1000F
    250 microliter Filter Tips Rainin SR-L200F
    FC Block BD Biosciences 553142
    fisher 100mn strainers Fisherbrand 22-363-549
    medium weigh dish Fisherbrand 02-202B
    aluminum foil Fisherbrand 1213100
    mincing scissors Fisherbrand 089531B
    Vortex Fisherbrand 2215365
    50 ml conical tubes BD Falcon 14-959-49A
    filter top FACS tubes BD Falcon 352235
    10 ml pipette case 200 BD Falcon 1367520
    round bottom tubes BD Falcon 352058
    5 ml syringe BD Falcon 309646
    V Bottom Plates Costar 07-200-107
    transfer bulb pipette Thermo Scientific 13-711-22
    Shaker Thermo Scientific 11 676 071
    Adhesive mat Thermo Scientific 1368750
    Cell Culture Centrifuge Sorvall 75253839
    Adapters Sorvall 75003723
    Rat anti-mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553142 Concentration: 0.5 - 1 μg/ 106 cells
    Rat anti-mouse F4/80 eBioscience 17-4801 Fluorophore conjugate: APC
    Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 17-4321
    Rat anti-mouse CD11b eBioscience 11-0112 Fluorophore conjugate: FITC
    Concentration: 0.5 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 11/1/4031
    Armenian Hamster anti-mouse CD11c eBioscience 12-0114 Fluorophore conjugate: PE
    Concentration: 0.8 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: Dec-88
    Goat anti-mouse MGL1/2 R&D Systems FAB4297P Fluorophore conjugate: PE
    Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: IC108P
    Goat anti-mouse CD206 R&D Systems FAB2535P Fluorophore conjugate: PE
    Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: IC108P
    Rat anti-mouse CCR2 R&D Systems FAB5538P Fluorophore conjugate: PE
    Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: IC013P
    Armenian Hamster anti-mouse TCRβ BD Biosciences 553174 Fluorophore conjugate: APC
    Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 553956
    Rat anti-mouse CD8a BD Biosciences 552877 Fluorophore conjugate: PE-Cy7
    Concentration: 0.8 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 552784
    Rat anti-mouse CD4 BD Biosciences 557956 Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700
    Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 557963

    Table 1. List of Materials and Reagents.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
    2. Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
    3. Weisberg, S. P., et al. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).
    4. Xu, H., et al. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).
    5. Mathis, D., Shoelson, S. E. Immunometabolism: an emerging frontier. Nature Reviews. Immunology. 11, 81 (2011).
    6. Stefanovic-Racic, M., et al. Dendritic cells promote macrophage infiltration and comprise a substantial proportion of obesity-associated increases in CD11c+ cells in adipose tissue and liver. Diabetes. 61, 2330-2339 (2012).
    7. Liu, J., et al. Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice. Nature Medicine. 15, 940-945 (2009).
    8. Feuerer, M., et al. Lean, but not obese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters. Nature Medicine. 15, 930-939 (2009).
    9. Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nature Medicine. 15, 914-920 (2009).
    10. Winer, S., et al. Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy. Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).
    11. Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610-617 (2011).
    12. Wu, L., et al. Activation of invariant natural killer T cells by lipid excess promotes tissue inflammation, insulin resistance, and hepatic steatosis in obese mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109. 1143-1152 (2012).
    13. Wu, D., et al. Eosinophils sustain adipose alternatively activated macrophages associated with glucose homeostasis. Science. 332, 243-247 (2011).
    14. Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. Journal of Lipid Research. 49, 1894-1903 (2008).
    15. Talukdar, S., et al. Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase. Nature Medicine. 18, 1407-1412 (2012).
    16. Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386, 50-59 (2012).
    17. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
    18. Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. Chapter 10, Unit 10 (2010).
    19. Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).
    20. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45, 194-205 (2001).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics