Coltura e manutenzione

Published 9/14/2013
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Immunology and Infection

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Summary

Clostridium difficile è un batterio patogeno che è un rigoroso anaerobio e provoca diarrea associata agli antibiotici (AAD). Qui, metodi per isolare, coltivare e mantenere C. cellule vegetative difficile e spore vengono descritti. Queste tecniche richiedono una camera anaerobico, che richiede una manutenzione regolare per assicurare adeguate condizioni di ottimale C. la coltivazione difficile.

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Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J. Vis. Exp. (79), e50787, doi:10.3791/50787 (2013).

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Abstract

Clostridium difficile è un anaerobico, batteri sporigeni Gram-positivo che è principalmente responsabile della diarrea associata agli antibiotici (AAD) ed è un importante patogeno nosocomiale. C. difficile è notoriamente difficili da isolare e coltivare ed è estremamente sensibile anche bassi livelli di ossigeno nell'ambiente. Qui, metodi per isolare C. difficile da campioni fecali e successivamente coltura C. difficile per la preparazione degli stock di glicerolo per la conservazione a lungo termine sono presentati. Sono anche descritte tecniche di preparazione e l'enumerazione scorte spore in laboratorio per una varietà di applicazioni a valle compresi studi di microscopia e animali. Queste tecniche richiedono una camera anaerobica, che mantiene un ambiente anaerobico coerente per garantire condizioni appropriate per ottimale C. la crescita difficile. Forniamo protocolli per il trasferimento di materiali e dalla camera senza cautilizzando una contaminazione significativa ossigeno insieme con suggerimenti per la manutenzione periodica necessaria per sostenere l'ambiente anaerobico adeguato per un efficiente e coerente C. la coltivazione difficile.

Introduction

Clostridium difficile è un batterio Gram-positivi, sporigeni batterio che è un anaerobio obbligato e un agente patogeno gastrointestinale potenzialmente fatale di uomini e animali. Inizialmente descritto nel 1935 come un organismo commensale trovato in campioni di feci da neonati 1, C. difficile è stato poi dimostrato di essere l'agente eziologico della colite pseudomembranosa associata a trattamento antibiotico 2. C. infezioni difficile (CDI) sono in genere preceduti da un trattamento antibiotico che provoca l'interruzione della normale flora del colon, creando una nicchia per C. difficile a prosperare 2. C. difficile è trasmesso come una spora dormiente via fecale-orale e successivamente germina all'interno del tratto gastrointestinale, producendo cellule vegetative in grado di generare più tossine e causando gravi malattie e colite 3. CDI sono spesso refrattari ai trattamenti convenzionali e questi infezioni sono spesso ricorrenti 4. Come risultato, CDI sono responsabili per un massimo di 4,8 miliardi dollari in spese sanitarie negli Stati Uniti 5-7.

C. difficile è molto sensibile anche bassi livelli di ossigeno nell'ambiente. Per C. difficile a persistere nell'ambiente e trasmettere in modo efficiente da un host all'altro, la formazione di una spora metabolicamente attivo è fondamentale 8. Poiché la manutenzione laboratorio e manipolazione di C. difficile richiede un ambiente anaerobico controllato, queste tecniche richiedono l'uso di una camera anaerobica. L'uso di camere anaerobiche ha aggravato recupero e l'isolamento di anaerobi obbligati 9-11, e ha permesso una serie di tecniche molecolari da eseguire in atmosfera anaerobica.

Oltre a C. difficile, l'uso della camera anaerobica e manutenzione qui descritti sono applicabiliad altri anaerobi obbligati come altre specie clostridi (ad esempio C. perfringens), altre specie gastrointestinali (ad esempio specie Bacteroides 12) e patogeni parodontali (ad esempio, specie Peptostreptococcus 13).

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Protocol

Nota: C. difficile è un patogeno umano e animale che può causare malattie gastrointestinali. Esperimenti C. difficile deve essere eseguita con le opportune precauzioni di biosicurezza (BSL-2).

1. Anaerobica Camera Uso e Manutenzione

C. difficile è un rigoroso anaerobio ed è estremamente sensibile anche basse concentrazioni di ossigeno nell'atmosfera. Pertanto, è necessario un ambiente anaerobico controllato per la sua manipolazione successo. L'uso di una camera anaerobica (Figura 1A) fornisce l'ambiente più stabile e le condizioni ideali per la coltivazione effettiva di C. difficile e altri batteri anaerobici 14. Qui, un'atmosfera contenente una miscela di gas (5% CO 2, 10% H 2, 85% N 2) può essere stabilmente mantenuta.

Per introdurre tutti gli elementi nella camera senza contaminazione significativa ossigeno,una camera di compensazione deve essere utilizzato (Figura 1B). Questo dispositivo funziona come un interscambio di gas e lavori automatica, semi-manuale o manuale. La camera di compensazione ha due porte: quella che fornisce accesso al di fuori della camera di compensazione e l'altra permette l'accesso all'interno della camera anaerobica. A seconda del modello, la camera di compensazione può avere un sportello aggiuntivo, che può offrire l'accesso ad una camera anaerobica adiacente, risparmiando così il costo di una camera di compensazione separata. A meno che gli articoli dentro o fuori della camera in movimento attivamente, entrambe le porte devono rimanere chiuse in ogni momento per evitare la contaminazione di ossigeno. La camera di compensazione possiede un interruttore on / off sulla parte anteriore e un pannello contenente quattro pulsanti. Le linee di gas e flessibile della pompa per vuoto sono collegati nella parte posteriore della camera di compensazione, vicino al pannello in cui si trovano gli interruttori per pieno funzionamento manuale dell'unità. Si raccomanda che due cicli di spurgo, utilizzando gas di azoto (N 2), sono utilizzati prima di riempire l'interscambio con la miscela di gas (5% di CO 2, 10% H 2, 85% N 2) per ridurre la quantità di ossigeno introdotto nella camera. Inoltre è importante non lasciare né porta aperta più a lungo del tempo quantità necessaria per spostare gli elementi dentro e fuori l'interscambio e pianificare attentamente esperimenti per ridurre la frequenza di elementi in movimento e dalla camera. Le diverse modalità operative per le camere vinile anaerobiche sono descritte di seguito. Prima di seguire questi protocolli, in modo che siano compatibili con le istruzioni del produttore fornite con la camera.

  1. Modalità Automatica
    Questa è una modalità programmabile e personalizzabile e viene eseguita interamente dalla camera di equilibrio. Per programmare la camera di equilibrio, fare riferimento alle istruzioni del produttore. Un programma consigliato per la tipica voce nella camera prevede due cicli di spurgo con azoto seguita dalla ricarica della camera di equilibrio con una miscela di gas che si avvicina all'atmosfera mantenuto all'interno della camera diber. Durante ogni ciclo di vuoto, le procedure standard di fabbrica suggeriscono di tirare un vuoto a 20 inHg e spurgo di 1 inHg.
    1. Assicurarsi che la porta camera d'equilibrio interno è completamente chiuso.
    2. Aprire lo sportello della camera di equilibrio esterno.
    3. Posizionare gli elementi in camera di equilibrio e chiudere lo sportello camera di compensazione esterna. Se l'introduzione di liquidi, svitare i tappi a metà strada per garantire lo scambio efficiente di gas. Imballaggi e contenitori sigillati devono essere aperti prima di iniziare il ciclo, astenendosi dal farlo potrebbe deformarsi e danni plasticware e contenitori. Per mantenere la sterilità, aprire gli imballaggi insufficienti per consentire solo lo scambio efficiente di gas.
    4. Premere il pulsante Start.
    5. Attendere che la camera di compensazione ha pedalato attraverso il programma e il display si legge "anaerobica".
    6. Aprire lo sportello camera di equilibrio interiore.
    7. Spostare gli oggetti nella camera.
    8. Chiudere porta interna.
  2. Modalità Semi-manuale
    Questa modalità può essere utilizzata quando si spostano gli oggetti dentro o fuori della camera ed è necessaria quando cycling il gas all'interno della camera è necessaria.
    1. Assicurarsi che la porta camera d'equilibrio interno è completamente chiuso.
    2. Aprire lo sportello della camera di equilibrio esterno.
    3. Posizionare gli elementi in camera di equilibrio e chiudere lo sportello camera di compensazione esterna. Se l'introduzione di liquidi, svitare i tappi a metà strada per garantire lo scambio efficiente di gas. Imballaggi chiusi, come i cicli inoculazione e piastre a 96 pozzetti, devono essere aperti prima di iniziare il ciclo.
    4. Premere Menu.
    5. Premere Start. La camera di equilibrio mostrerà la funzione di ogni tasto e non risponde fino a quando questo è completato:
      • Freccia su: attiva la pompa del vuoto.
      • Freccia giù: inizia l'azoto (spurgo) flusso di gas.
      • Start: avvia il flusso di miscela di gas.
      • Menu: tornare alla visualizzazione predefinita.
    6. Premere "Up", togliendo gas dalla camera di equilibrio, fino a quando il display indica 20 inHg.
    7. Premere "Down", riempiendo la camera di compensazione di azoto, fino a quando sul display compare meno di 1 inHg. Non overshoot, in quanto questo creerà pressione positiva all'interno della camera di equilibrio, che può influire sulla sua integrità.
    8. Ripetere i passaggi 6 e 7 per eseguire un ciclo di spurgo supplementare.
    9. Premere "Up" fino a quando il display indica 20 inHg.
    10. Premere il tasto "Start", riempiendo l'interscambio con la miscela di gas, fino a quando sul display compare meno di 1 inHg.
    11. Aprire lo sportello camera di equilibrio interiore.
    12. Spostare gli oggetti nella camera.
    13. Chiudere porta interna.
  3. Modalità manuale
    Questa modalità può essere utilizzata ogni qualvolta le modalità automatiche o semi-manuali non funzionano o non vi è alcun potere per la camera di equilibrio. Questa modalità non funziona quando la camera di compensazione è acceso, pertanto, è difficile determinare la pressione all'interno della camera di compensazione. Poiché il vuoto tirare e tempi di spurgo gas dipende tempi di vuoto e di flusso del gas, rispettivamente, l'uso di un manometro all'interno interscambio è tenuta a controllare la pressione e ridurre il rischio di lesioni personali e danni al gorgogliatore.
    1. Assicurarsi che la porta camera d'equilibrio interno è completamente chiuso.
    2. Aprire lo sportello della camera di equilibrio esterno.
    3. Posizionare oggetti, tra cui il manometro, in camera di equilibrio e chiudere lo sportello camera di compensazione esterna. Se l'introduzione di liquidi, svitare i tappi a metà strada per garantire lo scambio efficiente di gas. Imballaggi chiusi, come i cicli inoculazione e piastre a 96 pozzetti, devono essere aperti prima di iniziare il ciclo.
    4. Individuare i tre interruttori sulla parte posteriore della camera di compensazione denominata "Switch controllo manuale." Questi sono etichettati individualmente come:
      • Al vuoto
      • Azoto
      • Mix Gas
    5. Capovolgere l'interruttore a levetta al vuoto fino a quando il manometro legge circa il 20 inHg.
    6. Capovolgere l'interruttore a levetta di azoto fino a quando il manometro legge circa 1 inHg.
    7. Capovolgere l'interruttore a levetta al vuoto fino a quando il manometro legge circa il 20 inHg.
    8. Capovolgere l'interruttore a levetta di azoto fino a quando il manometro legge circa 1 inHg.
    9. Capovolgere l'interruttore a levetta al vuoto fino a quando il manometro legge circa il 20 inHg.
    10. Capovolgere l'interruttore del gas Mescolare fino a quando il manometro legge circa 1 inHg.
    11. Aprire lo sportello camera di equilibrio interiore.
    12. Spostare gli oggetti nella camera.
    13. Chiudere porta interna.

2. Coltura, enumerando e Memorizzazione C. difficile da campioni di feci

Questa procedura è destinato per recuperare C. difficile da campioni fecali contenenti spore e successivamente mantenere colonie isolate da cellule vegetative o spore di conservazione a lungo termine delle scorte glicerolo. In alternativa, questa procedura può essere utilizzata per enumerare il numero di C. presente difficile in campioni di feci (ad esempio, da studi su animali). Per arricchire in modo selettivo e differenziato per C. difficile, taurocolato-cefoxitin-cycloserine-fruttosio agar (TCCFA) viene utilizzato per inibire la crescita della normale flora fecale 15-16. Cicloserina è batteriostatica per i batteri Gram-negativi, mentre cefoxitin inibisce più ampiamente crescita di batteri sia Gram-negativi e positivi, ad eccezione di C. difficile e la maggior parte entrano ceppi cocci. Un indicatore di pH rosso neutro, può essere incluso nel mezzo, come la fermentazione del fruttosio si tradurrà in una diminuzione del pH e un cambiamento di colore successivo da rosso / arancione a giallo. Per recuperare in modo efficiente le spore di C. difficile come batteri vegetativi, la taurocolato sodio sali biliari viene utilizzato per indurre la germinazione 17-18. Perché C. difficile forma spore, alcool o trattamento termico di campioni può essere utilizzato per ridurre o eliminare le cellule vegetative, limitando la crescita della flora contaminanti, che possono aumentare l'efficienza di C. recupero difficile 19. Come accennato in precedenza, è cruciale per la pre-ridurre tutte le piastre per almeno 1-2 ore nella camera anaerobica prima dell'uso per garantire la rimozione di ossigeno residuo. Dryi Airng le piastre prima dell'uso nella camera possono ridurre la condensa. Mezzo liquido può richiedere fino a 24 ore per ridurre seconda del volume e del rapporto superficie-aria del contenitore utilizzato.

Prima di iniziare, i seguenti elementi devono essere posizionati all'interno della camera anaerobica:

  • Campione di feci
  • Tamponi sterili
  • Anse sterili per inoculazione
  • 1x PBS (vedi Materiali)
  • Piastre TCCFA (vedi Materiali)
  • Bhis (Brain Heart Infusion media con estratto di lievito), targhe e brodo (vedi Materiali)
  • 50% glicerolo (sterilizzato)
  • 10% di L-cisteina (sterilizzato)
  • Fiale stoccaggio criogenico

* In alternativa, colonie isolate possono essere ripartiti su piastre di agar bhis, e successivamente raschiata e risospese in bhis mezzo liquido con il 15% di glicerolo per la conservazione a lungo termine a -80 ° C. ** E 'importante notare che Gram-colorazione non è una strategia efficace per identificare C. Difficile direttamente da campioni di feci 23 C. difficile deve prima essere isolato dagli altri flora presenti nelle feci.

  1. Risospendere il campione di feci in 1x PBS (puo 'essere eseguita in condizioni aerobiche), e assicurarsi che il campione di feci è completamente risospeso in PBS 1x vortex. Se l'enumerazione C. difficile dallo sgabello, pesare il campione di feci prima dell'aggiunta di PBS 1x.
  2. Effettuare diluizioni seriali del campione di feci risospeso in PBS 1x per l'isolamento o conteggio adeguato di unità formanti colonie (CFU) per grammo di feci.
  3. Utilizzando una tecnica asettica, applicare 100 ml di ogni diluizione in serie alle piastre TCCFA.
  4. Utilizzando una serie di anse da inoculo sterili, realizzato cultura richiesto colonie isolate o equamente la cultura applicato sulla superficie della piastra TCCFA per enumerazione di colonie.
  5. Incubare la piastra anaerobiosi per 48 ore a 37 ° C. È possibile rilevare e identificare C. colonie difficile del entro 24 ore basano suil piatto, irregolare, aspetto a vetro smerigliato delle colonie a 15, anche se più accurata identificazione e la numerazione si ottiene dopo 48 ore.
  6. Utilizzando cicli da inoculo sterili, sottocultura tutte le colonie che sembrano essere C. difficile sul pre-ridotti piastre di agar bhis, integrati con 0,03% di L-cisteina 20. Raccogliere una colonia individuo, e realizzato sulla piastra in quadranti, utilizzando un nuovo un'ansa da inoculo sterile per ogni quadrante, per ottenere colonie isolate. In alternativa, contare il C. difficile del colonie di ciascuna diluizione (questo possono essere effettuate in condizioni aerobiche) e calcolare il numero di unità formanti colonia per grammo di campione di feci.
  7. Conferma C. Identificazione difficile via Gram-colorazione. Dopo Gram-colorazione, C. difficile apparirà come canne viola e alcune cellule possono contenere endospore terminali. Reazione a catena della polimerasi (PCR) identificazione dei geni che codificano per la tossina B può fornire un'ulteriore confermaceppi produttori di tossina di C. difficile 21 mentre multilocus tipizzazione sequenza (MLST) è successo per l'identificazione e la tipizzazione precisa dei ceppi sconosciuti e nontoxigenic di C. Difficile 22.
  8. Per mantenere uno stock di C. difficile a -80 ° C, raccogliere un individuo, isolato colonia dalla piastra bhis agar con un'ansa da inoculo sterile e risospendere colonia in 10 ml di bhis pre-ridotti mezzo liquido integrata con 0,03% di L-cisteina. *
  9. Incubare per una notte in anaerobiosi a 37 ° C, o fino a quando la cultura diventa torbido.
  10. Aggiungere 333 ml di glicerolo al 50% e 666 ml di C. cultura difficile per un ml tubo criogenico 1.8 per creare un stock di glicerolo 15% del ceppo isolato.
  11. Tappare ermeticamente la provetta criogenica, mescolare bene e togliere immediatamente la scorta dalla camera anaerobica e posto in un freezer -80 ° C per la conservazione a lungo termine.

3. Coltura C. difficile

Questa procedura prevede il recupero di C. difficile da scorte glicerolo conservati a -80 ° C. Perché ripetuti cicli di congelamento-scongelamento possono uccidere le cellule vegetative, è importante mantenere le scorte glicerolo congelati in ogni momento. Si sconsiglia l'utilizzo di ghiaccio secco per il trasferimento ceppi dentro e fuori la camera, come l'evaporazione di ghiaccio secco può modificare l'ambiente all'interno della camera. Invece, si consiglia di utilizzare rack di raffreddamento congelati per mantenere gli stock di glicerolo congelati durante il trasporto. Per vari scopi selettivi e differenziali, tre supporti sono comunemente usati per la coltura di C. difficile. TCCFA, come discusso in precedenza, è selettivo per C. difficile e contiene taurocolato di sodio, un germinant. Infuso di cuore cervello supplementato con estratto di lievito (bhis) è comunemente utilizzato, arricchito, terreno non selettivo che consente la crescita di un'ampia varietà di organismi (Figura 2A) 24. Spesso, L-cisteinae viene aggiunto bhis come riducente 20. Infine, l'aggiunta di sangue al mezzo (Figura 2B) consente la sporulazione più efficiente rispetto a TCCFA e prevede il rilevamento della fluorescenza verdastra unico o chartreuse esibita da C. difficile sotto-onda lunga ultravioletta (UV) 15 (figura 2C). Quando la coltura C. difficile da scorte di spore, è fondamentale ricordare che taurocolato di sodio deve essere aggiunto al mezzo per assicurare germinazione.

Prima di iniziare, i seguenti elementi devono essere posizionati all'interno della camera anaerobica:

  • Glicerolo congelato magazzino (in rack di raffreddamento)
  • Anse sterili per inoculazione
  • Piastre TCCFA o bhis (vedi Materiali)
  • Bhis brodo (vedi Materiali)
  • 50% glicerolo (sterilizzato)
  • Fiale stoccaggio criogenico
  1. Posizionare il glicerolo magazzino ghiacciato di C. difficile in un rack di raffreddamento che è stata conservata a -80 ° C prIOR da utilizzare per impedire lo scongelamento.
  2. Portare il glicerolo magazzino congelato in ghiaccio secco nella camera anaerobica.
  3. Usando una tecnica asettica e un'ansa da inoculo sterile, mettere una piccola quantità di azione sulla piastra e strisciare attraverso un quadrante della piastra.
  4. Ruotare la piastra di 90 ° e, utilizzando un nuovo un'ansa da inoculo sterile, continuare a striscia attraverso il secondo quadrante.
  5. Ripetere per il terzo e quarto quadrante per garantire l'isolamento di singole colonie.
  6. Togliere immediatamente congelati stock di glicerolo dalla camera anaerobica e tornare al -80 ° C.
  7. Incubare la piastra di anaerobiosi notte a 37 ° C. Colonie individuali isolate devono essere osservati dopo la crescita durante la notte.

4. Purificante spore di C. difficile

Poiché è necessaria sporulazione per la sopravvivenza in ambienti ricchi di ossigeno e per la trasmissione efficiente della malattia 8, la preparazione delle scorte di spore è often necessaria per applicazioni a valle, non limitato a studi di microscopia e di animali. E 'importante notare che l'enumerazione spore richiede la ripetizione di garantire la riproducibilità dei conteggi. Pipettando su e giù parecchie volte tra diluizioni riduce anche la perdita in quanto le spore aderiscono alla plastica bene.

Sporulazione di C. difficile non è così rapido o omogeneo come altre specie sporigeni. Per ottimizzare la produzione di spore e di recupero, è consigliato sia a medio sporulazione (SMC) 17,25 o 70:30 medie 26. Altri media comunemente usati sono bhis, che richiede 4-5 giorni di crescita prima sporulazione efficiente è visto 27, e Clospore, un mezzo liquido che produce alti titoli di spore (luglio 10-agosto 10 spore per millilitro) dopo 72 ore di crescita. Altri protocolli usano l'acqua ghiacciata, piuttosto che 1x PBS 20, tuttavia, l'uso di una soluzione isotonica in grado di ridurre le spore si attacchino gli uni agli altri e in plastica superfici. Alternativamente,alcuni ricercatori purificare ulteriormente le loro spore utilizzando un gradiente di saccarosio per rimuovere completamente le cellule vegetative e detriti 29.

Prima di iniziare, i seguenti elementi devono essere posizionati all'interno della camera anaerobica:

  • Anse sterili per inoculazione
  • Bhis, SMC e / o 70:30 piastre (vedi Materiali)
  • Bhis brodo (vedi Materiali)
  • 1x PBS, sterilizzata per filtrazione (vedi Materiali)
  1. Cultura ceppi dal glicerolo congelati magazzino su piastre bhis pre-ridotto e incubare in anaerobiosi notte a 37 ° C.
  2. Restreak su vari pre-ridotto SMC o 70:30 piastre e incubare in anaerobiosi a 37 ° C per 24-48 ore. Formazione di spore può essere seguito mediante microscopio a contrasto di fase. Spore appariranno fase mentre luminoso vegetativa e le cellule madri appariranno fase oscura. * In alternativa, spore possono essere purificati da 70:30 mezzo liquido dopo 24-48 ore, che fornisce 10 5 -10 6 spore per millilitro, a seconda della strain utilizzato.
  3. Utilizzando un'ansa da inoculo sterile, raschiare piatti e risospendere le cellule in 10 ml sterile PBS 1X.
  4. Scartare piastre e rimuovere sospensione di spore dalla camera anaerobica. Agglomerare le cellule a 3000 xg per 15 minuti. Lavare le cellule due volte in PBS 1x, risospendere completamente il pellet cellulare ogni volta.
  5. Incubare per una notte a 4 ° C per aiutare nella lisi di vegetativa e cellule madri.
  6. Incubare a 70 ° C per 20 minuti per uccidere tutte le cellule vegetative residue.
  7. Per determinare unità formanti colonie (CFU) per millilitro, in serie diluire ogni preparazione spore in 1x PBS e piastra su bhis + 0,1% taurocolato di sodio. Incubare le piastre per un minimo di 24 ore prima di enumerazione colonie.
  8. Spore possono essere memorizzati in PBS 1x sia a temperatura ambiente oa 4 ° C per una conservazione a lungo termine. Se conservata a 4 ° C, può essere utile per riscaldare il preparato spore a 55 ° C per 15 minuti per ripristinare germinazione efficiente.

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Representative Results

Un esempio di C. difficile coltivate su bhis e Columbia anaerobica pecore agar sangue media può essere visto in Figura 2. C. difficile forma colonie irregolari che sono piatta e in possesso di un aspetto a vetro smerigliato che è evidente in entrambi i supporti. Qui, un isolato clinico eritromicina sensibile di C. difficile, 630E 30, è cresciuto su bhis agar, un arricchito, terreno non selettivo, per 24 ore a 37 ° C (Figura 2A). Colonie su Columbia anaerobica agar sangue di montone appaiono simili a quelle coltivate su bhis sotto luce bianca (Figura 2B), tuttavia, l'uso di questo strumento prevede anche il rilevamento della fluorescenza verdastra o chartreuse esibita da C. difficile sotto-onda lunga ultravioletta (UV) 15 (figura 2C). C. colonie difficile del TCCFA su agar sono simili a crescita su bhis agar. A causa della presenza di due antibiotici in TCCFA mezzo, una TIMe periodo di 48 ore di crescita è necessario prima che l'enumerazione delle colonie.

Figura 1
Figura 1. La camera Coy Laboratories Tipo C vinile e dei suoi componenti. (A) A Coy Laboratories Tipo C camera di vinile che fornisce spazio di lavoro per un singolo individuo in una sola volta (42 pollici x 32 pollici). Esso contiene una ventola casella catalizzatore (angolo posteriore sinistro) che circola e riscalda l'aria, e detiene il Stak-Pak contenente il catalizzatore di palladio necessario per ridurre qualsiasi contaminazione ossigeno. (B) La camera di compensazione serve come interscambio e fornisce un meccanismo per il trasferimento di materiali dentro e fuori della camera, evitando la contaminazione significativa ossigeno all'interno dell'ambiente anaerobico. La camera di compensazione ha due porte: una che forniscono accesso all'esterno della camera di compensazione e l'altra permette l'accesso all'interno del secolo e da camera anaerobica. La camera di equilibrio è programmabile e permette di cicli personalizzati per l'ingresso nella camera. L'apparecchio funziona in modalità automatica, semi-manuali e manuali. (C) Attaccato, guanti in lattice flessibili sono forniti che consentono gamma completa di movimento e di raggiungere all'interno della camera. I guanti sono fissati ad un bracciale specializzati presso le maniche vinile con adesivo vinile, permettendo la sostituzione dei guanti senza interrompere l'atmosfera anaerobica della camera. Guanti in neoprene sono inoltre disponibili. (D) il modello 10 Gas Analyzer controlla continuamente ossigeno e livelli di idrogeno che forniscono una lettura istantanea della atmosfera all'interno della camera. Questa unità consente di avvisi immediati in caso di perdita, una miscela di gas non corretto viene utilizzato o ulteriori problemi sorgono con allarmi acustici e una luce LED lampeggiante.

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Figura 2. L'aspetto di C. colonie difficile del su vari supporti. La caratteristica, irregolare, aspetto a vetro smerigliato piano è evidente con un isolato clinico eritromicina sensibile di C. difficile, 630E 30, cresciuto su bhis agar per 24 ore (A) e Columbia anaerobica pecore agar sangue per 48 ore sotto luce bianca (B) e la luce ultravioletta a onde lunghe (C).

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Discussion

I metodi qui descritti consentono il recupero semplice e veloce di C. difficile da una varietà di campioni fecali, compresi gli esseri umani, topi e criceti, nonché la conservazione a lungo termine di C. difficile come scorte glicerolo o spore. C. difficile può essere un organismo difficile da coltivare, ma accurata manutenzione di un ambiente anaerobico e l'applicazione di tecniche asettiche può provvedere robusta crescita e una riduzione della contaminazione.

Le camere anaerobiche: Considerazioni e manutenzione

Ci sono due tipi di camere anaerobiche: camere di rigidi o camere in vinile. Camere rigidi sono fatti tipicamente di alluminio o un polimero rigido (ad esempio plexiglas o materiali acrilici), permettendo l'uso di sostanze chimiche corrosive. Camere rigidi possono essere convertiti in uno stile senza guanti e sono meno soggette a forature, tuttavia, le perdite sono difficili da individuare e trovare e camere rigidi richiedono qualche metodo percompensare spostamento gas durante l'uso. Le unità polimeriche spesso sono dotate di camera di compensazione solo spurgo, che potrebbe essere più costoso per funzionare. Per la manutenzione delle rigide condizioni atmosferiche, il costo, la flessibilità, requisiti di spazio di laboratorio e di facile manutenzione, le camere vinile anaerobici sono raccomandati (Coy Laboratorio Prodotti, Figura 1A). Questa camera anaerobica è costituito da un vano portaoggetti vinile che è supportato da una struttura tubolare in alluminio ed è collegato a una camera di compensazione che funziona come uno scambio per il trasferimento di materiali dentro e fuori della camera (Figura 1B), utilizzando guanti in lattice o neoprene collegato a maniche in vinile (Figura 1C). È importante seguire esattamente le istruzioni del produttore per il corretto assetto della camera anaerobica. Può essere a temperatura controllata con una (o più, a seconda delle dimensioni della camera) unità di casella riscaldatore che prevedono la circolazione dell'aria attraverso un catalizzatore di palladio. Il palladio catalyst serve per ridurre la contaminazione ossigeno introdotto attraverso l'interscambio convertendo idrogeno e ossigeno in acqua. Idealmente, entrambi i livelli di ossigeno e idrogeno sono controllati mediante un analizzatore di gas (Figura 1D), visualizzando concentrazione di ossigeno in parti per milione (ppm) e la concentrazione di idrogeno in percentuale.

Mezzi liquidi e solidi, sia pre-ridotto nella camera anaerobica prima dell'uso. Piastre di Petri (100 mm di diametro) possono essere ridotti solo per due ore prima di utilizzare il 31, tuttavia, terreno liquido dovrebbero essere ridotte durante la notte. Soprattutto, i media devono essere raffreddati prima del trasferimento nella camera per evitare lampeggiante liquido durante l'evacuazione camera di compensazione. Consumo di plastica, come piastre a 96 pozzetti, devono essere pre-ridotti notte prima dell'utilizzo, la plastica è poroso e può memorizzare le molecole di ossigeno 32. A seconda dell'applicazione, alcune plastiche devono essere pre-ridotto fino a 48 ore prima dell'uso 33. Rifiuti Biohazard dovrebbe be smaltiti in modo appropriato. Una piccola borsa di rischio biologico può essere conservato all'interno della camera, ma deve essere sostituito frequentemente.

Una concentrazione di idrogeno di almeno il 3% deve essere mantenuto all'interno della camera, in modo da garantire sia una buona crescita di C. rimozione dell'ossigeno difficile ed efficiente. Se la concentrazione dell'idrogeno è inferiore al 3% o se la cella non è stata utilizzata per diversi giorni, un ciclo camera deve essere eseguito per ripristinare la concentrazione di idrogeno a livelli desiderabili. Qui, circa un terzo del gas nella camera è aspirato (casella vinile sgonfi significativamente) e sostituito con miscela di gas fresco. Assicurarsi che la camera di compensazione è anaerobico prima di iniziare. Pompaggio troppo gas nella camera deve essere evitato, poiché pone non solo inutile stress sul sacchetto vinile, ma sarà anche impedire all'utente di raggiungere nella parte posteriore della camera. Eseguire sempre questa procedura in una zona ben ventilata. Prendere precauzioni supplementari se il chamber è conservato in una piccola stanza scarsamente ventilato. Aprite le porte alla camera come il contenuto di gas all'interno della camera può asfissiare l'utente.

Manutenzione addizionale comprende rigenerazione del catalizzatore palladio per garantire la rimozione efficiente di ossigeno all'interno della camera. L'ossigeno e l'idrogeno sono ridotti dal catalizzatore, l'acqua può accumularsi sulla superficie dei granuli di alluminio rivestito di palladio, riducendo la loro efficienza nel tempo. Per ovviare a questo, i catalizzatori di palladio dovrebbero essere rigenerate almeno una volta alla settimana dalla cottura di almeno 230 ° C per un'ora. Inoltre, a causa sia della riduzione dell'ossigeno ed evaporazione dell'acqua di piatti e supporti, accumulo di acqua è un problema comune ai camere anaerobiche. Per garantire comodo manipolazione e aumentare l'emivita delle apparecchiature all'interno della camera, possono essere utilizzate confezioni di essiccante, ma devono essere asciugate frequentemente seguendo la stessa procedura utilizzata per i catalizzatori di palladio. In alternativa, un deumidificatore può essere utilizzato quale circola aria attraverso un blocco metallico che condensa acqua e vengono raccolte in un contenitore. Il dispositivo impedisce di troppo pieno dei contenitori d'acqua, tuttavia, deumidificatori devono essere monitorati ed i contenitori devono essere svuotati quando quasi al massimo. Per pulire la camera di vinile, è consigliato l'uso di un panno morbido e detergenti disponibili in commercio raccomandato per il cloruro di polivinile (PVC) (ad es Pulitore magico di plastica, parte no. 1.600.480, Coy Laboratories). Per evitare di graffiare o danneggiare la camera di vinile, non usare asciugamani di carta, Kim-salviette o prodotti contenenti chetoni o altri composti che danneggiano il PVC.

Infine, C. difficile produce gas idrogeno solforato (H 2 S), che è estremamente reattivo e corrosivo. L'idrogeno solforato può essere dannoso per la strumentazione, il catalizzatore palladio e alcuni metalli esposti. Se possibile, non lasciare alcuna strumentazione, come omogeneizzatori e spettrofotometri, in chamber per lunghi periodi di tempo per evitare la corrosione da acido solfidrico. A causa della produzione di idrogeno solforato, elementi quali l'analizzatore palladio catalizzatore e gas dovranno essere periodicamente sostituito come parte della regolare manutenzione camera. Alternative per ridurre i livelli di solfuro di idrogeno all'interno della camera, come l'utilizzo di carbone attivo, acetato di piombo, cloruro di argento o argento solfato di assorbire o chimicamente rimuovere il solfuro di idrogeno, sono stati descritti 34 e possono essere utilizzati per rallentare la corrosione delle apparecchiature.

Precauzioni aggiuntive

Non aprire mai una porta per la camera di compensazione senza garantire che l'altra porta è chiusa e bloccata per evitare la contaminazione di ossigeno. Inoltre, evitare l'uso di elementi taglienti all'interno della camera per ridurre il rischio di puntura del vinile.

È importante notare che l'idrogeno è un gas infiammabile in presenza di ossigeno. Fare attenzione quando si introduce elementi into la camera che gli elevati livelli di contaminazione ossigeno non si verificano (maggiore di 999 ppm). È importante utilizzare solo premiscelato miscela di gas non infiammabile anaerobica e monitorare attentamente l'analizzatore di gas all'interno della camera, soprattutto quando si utilizza un nuovo serbatoio di gas. Se si verificano entrambe le concentrazioni di idrogeno e ossigeno superiori al 4%, garantire che le procedure di emergenza appropriate, che devono essere descritte in procedure operative standard del laboratorio (SOP), sono seguiti.

Risoluzione dei problemi C. la crescita difficile

Se scarsa crescita di C. culture difficile è osservata in terreno ricco, questo è più spesso per contaminazione ossigeno all'interno della camera. L'aggiunta di un agente riducente (ad esempio L-cisteina o tioglicolato) al mezzo può migliorare la crescita, tuttavia, il problema della contaminazione di ossigeno all'interno della camera avrebbe bisogno di essere affrontate. Monitoraggio dei livelli di ossigeno e idrogeno all'interno della camera con un analizzatore di gas può rapidamente unalert all'utente di problemi prima di un ritardo in corso e diminuzione della produttività si verifica. In caso di contaminazione di ossigeno, individuando rapidamente l'origine con un rilevatore di fughe di gas (disponibile da Coy Laboratories) è consigliato. Per aumentare la probabilità di trovare la posizione di una perdita, uno straccio imbevuto di alcool può essere posizionato all'interno della camera poiché il rivelatore può identificare aumento dei livelli di idrocarburi e aumento dei livelli di idrogeno. Una volta trovata la fonte della perdita, può essere riparato con colla o silicone seguendo le istruzioni del produttore.

Un certo numero di organismi facilmente crescere in ambienti anaerobici, comprese altre specie comuni clostridi (Clostridium perfringens ad esempio) e la anaerobio facoltativo, Escherichia coli. Tecnica asettica e altre strategie possono ridurre il rischio di contaminazione. Organizzazione adeguata all'interno della camera, come l'immissione articoli a portata di mano per ridurre il potenziale di fo cadute e pronta rimozione dei rifiuti biologici accumulati, possono ridurre i rischi di contaminazione. Inoltre, asciugamani di carta inumidito con una soluzione diluita di candeggina possono essere portati periodicamente nella camera per pulire le superfici ed i guanti di lattice o neoprene. E 'fondamentale per non lasciare soluzioni di candeggina o alcool all'interno della camera per lunghi periodi di tempo in quanto questi possono permeare l'atmosfera e mezzi solidi e liquidi, uccidendo C. difficile, oltre a danneggiare il vinile 34. Inoltre, la sostituzione regolare dei guanti in lattice o neoprene può anche ridurre il rischio di contaminazione. Come accennato in precedenza, se non siete sicuri se un organismo è C. difficile o un contaminante, un test per la presenza del gene tdcB usando PCR possono determinare rapidamente se l'organismo è C. Difficile 21. Infine, se coltivare organismi multipli all'interno della stessa camera anaerobica, è importante notare che C. difficile può produrre sottoprodotti metabolici (e. G. Solfuro di idrogeno) che inibiscono la crescita di altri microrganismi anaerobi e viceversa.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare Coy Laboratori per fornire gentilmente le immagini della camera anaerobica. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di sovvenzione DK087763 (SMM) e un Curriculum STEP / HHMI Sviluppo Fellowship (ANE).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Proteose Peptone no. 2 BD 212120
Na2HPO4 Fisher S373
KH2PO4 Fisher BP362
NaCl Fisher S27
MgSO4 (anhydrous) Fisher M65
á´…-Fructose Fisher L96
Sodium taurocholate Sigma T4009
á´…-cycloserine Sigma C6880
Cefoxitin Fluka C4786
Brain heart infusion medium BD 237300
Proteose Peptone BD 211684
(NH4)2SO4 Sigma A5132
Tris base Fisher BP152
Agar BD 214010
L-cysteine Sigma C7755
BactoPeptone BD 211684
Columbian sheep blood agar Fisher L21928
NaCl Fisher S27
KCl Fisher P217
Glycerol Fisher BP2291
Sterile inoculating loops Fisher 22363596
Sterile swabs Fisher 1495990
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Materials
TCCFA agar

Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g
Na2HPO4 5 g
KH2PO4 1 g
NaCl 2 g
MgSO4 (anhydrous) 0.1 g
Fructose 6 g
Agar 20 g

Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

After autoclaving, add:
10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%)
25 ml of 10 mg/ml á´…-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml)
1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml)

BHIS Medium

Brain heart infusion 37 g
Yeast extract 5 g

For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

Optional (add after autoclaving):

3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)
10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%)

SMC Sporulation Medium

BactoPeptone 90 g
Protease peptone 5 g
(NH4)2SO4 1 g
Tris base 1.5 g
Agar 15 g

Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

Optional (add after autoclaving):
3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)

70:30 Medium

BactoPeptone 63 g
Protease peptone 3.5 g
Brain heart infusion 11.1 g
Yeast extract 1.5 g
(NH4)2SO4 0.7 g
Tris base 1.06 g

For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%).

Blood agar

The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended.

1X Phosphate buffered saline (PBS)

NaCl 8.01 g
KCl 0.2 g
Na2HPO4 1.44 g
KH2PO4 0.27 g

Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use.

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References

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