Vurdere Myogenic respons og karaktivitet I Resistance Mesenteriske Arterier Brug Pressure Myography

1Section of Gastroenterology and Hepatology, Georgia Regents University, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Vascular Biology Center, Georgia Regents University
Published 7/06/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Tryk myography anvendes til at vurdere vasoaktivitet af små arterier, der udvikler vedvarende konstriktion når tryk. Dette håndskrift indeholder en detaljeret protokol til at vurdere i isolerede segmenter af små mesenteriale arterier fra rotter, vasoaktivitet og effekten af ​​intraluminale pres på vaskulær diameter.

Cite this Article

Copy Citation

Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography. J. Vis. Exp. (101), e50997, doi:10.3791/50997 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Små modstandskar snøre og dilatere henholdsvis som respons på forøget eller reduceret intraluminale tryk; dette fænomen kaldes myogen reaktion er en central regulator af lokal blodgennemstrømning. I isobare betingelser små modstand arterier udvikle vedvarende konstriktion kendt som myogen tone (MT), som er en vigtig faktor for systemisk vaskulær modstand (SVR). Derfor ex vivo tryk præparater af små modstand arterier er store redskaber til at studere mikrovaskulære funktion i nær-fysiologiske tilstande. For at opnå dette, er en frisk isoleret intakt segment af en lille modstand arterie (diameter ~ 260 um) monteret på to små glas kanyler og under tryk. Disse arterielle præparater bevarer de fleste in vivo egenskaber og tillader vurdering af vaskulær tone i real-tid. Her giver vi en detaljeret protokol til vurdering vasoaktivitet i tryksatte små modstand mesenteriske arterier fra rotter; disse arterier udviklervedvarende vasokonstriktion - ca. 25% af maksimal diameter - når tryk ved 70 mmHg. Disse arterielle præparater kan anvendes til at undersøge virkningen af ​​testpræparater tinforbindelser på forholdet mellem intra-arterielle tryk og vasoaktivitet og bestemme ændringer i mikrovaskulær funktion i dyremodeller af forskellige sygdomme.

Introduction

Små modstand arterier er vigtige determinanter for SVR og spille en vigtig rolle i patofysiologien af mange sygdomme 1,2. Tilstande såsom diabetes 3, graviditet 4, iskæmi-reperfusion 5, fedme og hypertension 6,7 er ofte forbundet med ændret mikrovaskulær funktion. Vaskulær myography kan ikke kun give vigtig indsigt i ændringer i mikrovaskulær funktion i forskellige sygdomme, men også at identificere terapeutiske mål og evaluere effektiviteten af ​​vasoaktive forbindelser. Vaskulær funktion er blevet undersøgt ved anvendelse af isolerede små arterier under isometriske eller isobare fartøjsforholdene 8. Detaljeret beskrivelse af isometrisk myography leveres andetsteds 9. Men der er forskelle i data fra isometrisk versus isobare præparater 10-12. Da tryksatte arterielle præparater tillader studiet af mikrovaskulære funktion i nær-fysiologiske betingelser, denopnåede resultater kan korrelere bedre med in vivo adfærd vaskulære seng 8,13.

I 1902 Bayliss først beskrevet virkningen af transmural pres på vaskulær diameter 14. Han bemærkede i små modstandskar fra forskellige vaskulære senge af kaniner, katte og hunde, et fald i trykket blev efterfulgt af vasodilatation, og en stigning i trykket blev efterfulgt af vasokonstriktion. Dette fænomen er kendt som myogene respons. Bayliss og efterfølgende undersøgere observeret, at i isobare betingelser lille modstandskar udvikle vedvarende konstriktion kaldet MT 15,16. Både myogene respons og MT kan vurderes ved anvendelse af tryk myography (PM) -teknik. PM anvendes primært til at bestemme vasoaktivitet af små arterier, vener og andre fartøjer. Ud over at vurdere effekten af ​​vasoaktive forbindelser på vaskulær diameter, PM - som navnet indikerer - bruges til at vurdere intravaskulær pres-medieret changes på vaskulær diameter. I løbet af de seneste årtier fremskridt i computersoftware, der forbedrede video mikroskopi og glaspipette trækker, har gjort PM lettere at udføre. Imidlertid dissektion af levedygtige intakte segmenter af små blodkar forbliver kedelig og undertiden udfordrende. Her skitsere en detaljeret protokol til at studere myogen respons i små mesenteriske modstand arterier isoleret fra rotter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De viste eksempler er fra forsøg godkendt af IACUC på Georgia Regents University - Protokol nr: # 2011-0408

1. Fremstilling af reagenser

  1. Forbered dissektion løsning lager: For 500 ml lager dissektion løsning (5x), opløses 21.18 g NaCl, 0,875 g KCI, 0,739 g MgSO4, 1,049 g MOPS og 0,019 g EDTA i 450 ml Milli-Q vand. Juster pH til 7,3-7,4 ved anvendelse af 1 N NaOH. Fyldes op til 500 ml med Milli-Q vand. Stamopløsning kan opbevares op til 7-10 dage. Se tabel 1 for en liste over kemikalier og deres leverandører. Se tabel 2 for koncentration i mM.
  2. Forbered arbejdet dissektion løsning: Forbered frisk arbejdsmiljø dissektion løsning hver dag. For 100 ml brugsopløsning opløses 0,091 g glucose, 0,016 g NaH 2 PO 4 og 0,022 g natriumpyruvat i 79,8 ml Milli-Q vand. Tilsæt 0,2 ml 1M CaCl2 og 20 ml dissektion løsning lager til at bringe volumig til 100 ml.
  3. Forbered fysiologisk saltopløsning (PSS): At forberede 1.000 ml PSS, opløses 0,365 g KCI, 6,545 g NaCl, 0,296 g MgSO4, 0,163 g KH 2 PO 4, 2,072 g glucose, 2,184 g NaHCO 3 og 2,383 g HEPES i 950 ml Milli-Q-vand. Juster pH til 7,3-7,4 ved anvendelse af 1 N NaOH. Fyldes op til 1000 ml med Milli-Q vand. Fjern 2 ml opløsning og erstatte det med 2 ml 1 M CaCl2. (Fresh PSS skal forberedes dagligt)
  4. Forbered calcium (Ca 2+) gratis PSS: For 100 ml PSS uden Ca 2+, opløses 0,036 g KCI, 0,654 g NaCl, 0,029 g MgSO4, 0,016 g KH 2 PO 4, 0,207 g glucose, 0,218 g NaHCO3, 0,238 g HEPES, 0,015 g EGTA og 0,0026 g Natrium (SNP) i 95 ml Milli-Q-vand. Juster pH til 7,3-7,4 ved anvendelse af 1 N NaOH. Der fyldes op til 100 ml med Milli-Q vand.

2. Udarbejdelse af Glass kanyler

  1. Pull glaspipetterat generere de 100-150 um tippes kanyler under anvendelse af en pipette aftrækker i henhold til producentens retningslinjer.
  2. Bevel de glas kanylen tips ved hjælp af en mikroelektrode beveller, brand polere dem og bøje glas kanylen tips ved ~ 45 ° ved hjælp af en radiator sonde.
  3. Læg kanyler i mikropipette holder og sæt mikropipette indehaveren på perfusionskammeret.

3. Fremstilling af perfusionskammeret

  1. Skyl perfusionskammer med Milli-Q-vand, efterfulgt af dissektion opløsning i 5 min hver. Indlæse kammer med 2 ml dissektion løsning.
  2. Suge dissektion løsning gennem kanylen anvendes 10 ml sprøjte og fyld forsigtigt hele kanyle og vedlagte slange uden bobler. Sugning forsigtigt for at forhindre dannelse af bobler.
  3. Forbered to suturer med en halv knude hver bruger stumpe pincet. Eftersom oftalmiske monofilament nylon sutur (10-0, 0,2 metrisk) anvendes til at fremstille de knuder, der kun1-2 mm i diameter, kan dissektion mikroskop være nødvendig.
  4. Visualisere under dissektion mikroskop, brug dissektion pincet til at indlæse både kanyler med delvist lukkede sutur knob lidt væk fra spidsen. Senere blev disse knaster vil glide forsigtigt onto kanyle arterielle ender og helt lukket.

4. Indsamling af mesenterialarterie Arcade fra Sprague-Dawley rotter

  1. Søge om godkendelse af den lokale Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC), før udførelse af disse eksperimenter. Hus dyr i dyret anlæg med kontrolleret temperatur og belysning og give fri adgang til vand og en kommerciel gnaver chow.
  2. Bedøver rotter ved intraperitoneal injektion af ketamin (80 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg). Bekræft dyb anæstesi ved tå-pinch og om nødvendigt Administrer yderligere bedøvelsesmidler.
  3. Efter bekræftelse af kirurgiske anæstesi, aflive dyret ved halshugning. Følg AAALAC retningslinjer for utilisering egnede metoder til dyr eutanasi.
  4. Brug en dissektion saks og en pincet til at udføre en mid-line laparotomi fra bækken til brystbenet. Dette gøres i to trin: først incise huden og andet incise det underliggende muskellag. Der skal udvises forsigtighed for ikke at skade de intra-abdominale organer.
  5. Skære den proximale ende af tarmen tæt på pylorus og den distale ende tæt på ileo-caecale junction. Binde begge ender adskilt for at forhindre lækage af Chyme og afføring og dermed undgå kontaminering af ekstracellulær badopløsningen. Incise mesenterium ved dens base nær fodring vaskulatur dvs øvre mesenteriske arterie og overføre hele tyndtarmens mesenteriale seng til en 50 ml bægerglas indeholdende iskold dissektion opløsning.
  6. Tillad Høstet væv at bo i iskold dissektion løsning i 5 minutter og skyl med frisk dissektion løsning til at slippe af blod.

5. Isolering og Kanylering af 4 th

  1. Pin ned den proximale ende af tarmen på højre side i en Sylgard-belagt skål. Forlænge den resterende tarmen i en mod uret sti, pinning segmentet ned for at sprede mesenterium og udsætte blodkarrene (figur 1). Bemærk: Vi isolere arterielle segmenter ved stuetemperatur. Ellers vi placere mesenterial arkade indeholder fad på is. Nogle labs, også på vores institution, bruger chiller enheder til at dissekere arterier ved 4 ° C.
  2. Under et stereo zoom mikroskop dissekere ud 3. og 4. ordens små mesenteriske arterier (~ 260 um) parallelt til tyndtarmen ved hjælp af små saks. Først dissekere væk alle det dækkende fedt. Derefter dissekere ud venen og isolere arterien med V-formet forgreningspunkt. Pas på ikke at punktere den valgte segment. Start dissekere fedt nær en 2. orden gren og finde vejen til 3. eller 4. ordER fartøjer.
    1. Kan skelnes arterier og vener er baseret på deres vægtykkelse - arteriel væggen er tykkere end vene s: Note. Desuden, når tilstødende bindevæv trækkes forsigtigt vinkelret på fartøjer, vener sammenbrud let mens arterier ikke. Da arterier med lumendiameter <400 um er store steder af systemiske vaskulære modstand, for denne protokol vi brugte 4 th orden rotte mesenteriske arterier (lumendiameter <300 um).
  3. Isolere en 4-5 mm afsnit af arterien parallelt til tyndtarmen. Visualiser alle de 5 th ordens grene indlejring i tyndtarmen og skær dem lidt væk fra oprindelsen af filialer og bevare en del. Disse bevarede dele af grene tjener som holder sites (med dissektion tang) til overførsel af arterielle segmenter til en perfusion kammer og efterfølgende vejlede deres kanylering.
  4. Derefter skæres de arterielle segmenter ved at gøre 2 indsnit distalt forde 5 th ordens grene på hver side af arterien og overføre den til perfusionskammeret (se figur 1C og legende).
  5. Kanyler ene ende af fartøjerne på en af ​​glas mikropipetten (diameter: 100-150 um) hjælp dissektion pincet ved at holde spidsen af ​​det arterielle segmentet med dissektion pincet. Skub tidligere indlæst delvis lukket sutur på kanyle ende og sikre det. Bemærk: proximale ende af arterien kan være kanylerede på glasset kanyle, der er forbundet til servostyret trykregulerende enhed til at efterligne in situ-miljø.
  6. Vedhæfte en dissektion opløsning indlæst 10 ml sprøjte til stophanen tilsluttet denne kanyle, således at dissektion løsning i slangen forbinder kanylen og stophane fusionerer med det i sprøjten. Hæv forsigtigt sprøjten. Tyngdekraften på opløsningen vil fjerne den intra vaskulær blod fra den åbne ende af beholderen. Efter fjernelse af intra-arterielle blodLuk stophanen.
    Bemærk: Du kan også vedhæfte stophanen til trykregulatoren, tænde den og forsigtigt øge presset til 5-10 mm Hg for at opnå det samme resultat.
  7. Binde den distale ende af beholderne på et andet glas kanyle ved omhyggeligt at bringe den anden kanyle så tæt som muligt på den ubundne ende af arterielle segment. Skub tidligere indlæst delvis lukket sutur på kanyle ende og sikre det. Skal man være omhyggelig ikke slæbebåd eller trække på arterielle segmenter. Sørg for, at stophaner knyttet til begge kanyler er lukket.
  8. Overfør perfusion kammer på scenen af ​​omvendt mikroskop udstyret med live video-optagelse.
  9. Tilslut stophanen af ​​kanylen bundet til den proximale ende af arteriel segment til en servostyret trykregulerende enhed og sikre, at stophane fastgjort til den anden kanyle forbliver lukket for at opretholde stabil intraluminale tryk.
  10. Dernæst vedhæfte vakuum slangen til sugeporten ennd perfusionen slange til perfusion porten af ​​kammeret.
    Bemærk: afskårne nål port bruges til udsugning og stump nål port til perfusion.
  11. Start perfusion af fartøj med varm PSS gennem enkelt inline opløsning varmelegeme (37 ° C, ækvilibreret med gasblanding: 5% CO2, 5% O2 og 90% N for at opretholde neutral pH og tilstrækkelig iltning 17) ved 2 ml / min under anvendelse af en peristaltisk pumpe. Vend vakuum på så godt. Placer en termistor i kammeret til at overvåge temperatur kontinuerligt.
  12. Da temperaturen af ​​PSS i kammeret nærmer ~ 37 ° C (sædvanligvis inden for 5 min), langsomt øge intraluminale tryk fra 20 til 100 mmHg og tjekke fartøjer for utætheder. Dette gøres ved hjælp af den automatiske trykindstilling af trykregulatoren. Kassér fartøjer med læk og erstatte med et andet segment. De fartøjer med utætheder vil ikke være i stand til at holde trykket.
  13. Vurdere arterielle segmentet for bøjninger og samtidig opretholde trykket ved 100 mm Hg.Med skruen-håndtag, flytte kanylen at rette arterielle segmentet. Må ikke over strække arterielle segmenter; målet er at efterligne in vivo arteriel segmentlængde.
  14. Reducere trykket til 70 mmHg (at efterligne in vivo tryk i mesenteriske arcade 18) og tillade den arterielle segment til at stabilisere og udvikle myogene tone. Arterier kan være under tryk variabelt (40-70 mmHg) i henhold til eksperimentel strategi og vaskulære seng. En tidligere offentliggjorte gennemgang giver en glimrende gennemgang af variabilitet i MT i arterielle segmenter fra forskellige vaskulære senge 8.

6. Måling af Arterial Diameter

  1. Se arterier på 10X målsætning på et mikroskop udstyret med en monokrom video ladningskoblet enhedens kamera. Måle luminale diameter ved hjælp af video frame grabber og tidstro kant-detektionssystem. En liste over udstyr, der anvendes er tilvejebragt i tabel 3.
  2. Monitor og optage fartøj diameter kontinuerligt.
  3. Der observeres for udvikling af MT. Bemærk: Vi bemærkede, at i rotte mesenteriske modstandskar, 70 mmHg, udvikling af MT er kendetegnet ved ~ 20% fald i diameter. MT varierer efter vaskulære seng og dyrearter.
  4. Bekræft vaskulær levedygtighed ved at vurdere vasokonstriktor og vasodilator svar til 1 uM phenylephrin (Phe) og 1 uM acetylcholin (ACh).
  5. Ved afslutningen af hvert forsøg, fastlægge passiv diameter (PD) ved inkubering arterier i Ca2 + -fri PSS i 20 minutter.

7. Myogenic svar

  1. Reducere trykket til 20 mm Hg og lade diameter kan stabiliseres. Øg intraluminale tryk trinvis (20, 40, 60, 80 og 100), og ved hvert tryk trin tillader arterier at opnå en stabil diameter (sædvanligvis inden for 5 min).
  2. Reducer intraluminale tryk til 20 mmHg og inkuberes den arterielle segment i Ca2 + -fri PSS indeholdende 0,39 mMEGTA og 0,1 mM SNP. Tillad det arterielle diameter for at stabilisere (sædvanligvis 15 min).
  3. Gentag tryk-trins reaktion i Ca2 + -fri PSS indeholdende 0,39 mM EGTA og 0,1 mM SNP.

8. Fortolkning af resultater og beregning af data

  1. Beregn MT som den procentvise forskel i diameter observeret for Ca 2 + -holdige versus Ca2 + -fri PSS ved hvert tryk efter følgende beregning:
    Ligning 1
  2. For arterier gennemgår vasomotion diameteren kan beregnes som gennemsnittet plateaufasen i 1 min. Udtrykke de indsamlede data som procent af maksimal afslapning (% PD) i overensstemmelse med forholdet:% PD = 100 x [AD / PD]; AD er forskellen mellem diameteren før og efter tilsætning af noget forsøgslægemidlet (f.eks Phe); PD er passiv diameter (ogsåmaksimal diameter).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Skematisk fremstilling af en typisk tryk myograf set-up er vist i figur 1. De to ender af beholderen er kanyleret med et glas mikropipette og fastgøres med suturer på begge sider. Via en slange og en åben stophane, er en kanyle forbundet til en servostyret tryk-regulator; den anden kanyle er forbundet til en lukket stophane. Kammeret er perfunderet med PSS og vaskulær diameter ændringer observeret af et omvendt mikroskop forbundet til et CCD-kamera.

Den arterielle segment tryk ved 70 mmHg inkuberes i frisk fremstillet varm PSS, som løber gennem det arterielle kammeret ved 2-4 ml / min og suges ud. Arteriel diameter overvåges og registreres ved hjælp videomicroscopy og kant afsløring software. Efter ~ 40 min, arterielle segmenter snøre spontant med 20-40% af deres udgangspunkt diameter (figur 2A). I vores hænder lille rotte modstand arterier snøre med 25-30% (gennemsnitlig Varies i henhold til indstillingerne, operatør og arteriel seng). Derefter funktionel levedygtighed vurderet ved vasodilator og vasokonstriktor responser på ACh (1 uM) og Phe (1 uM), henholdsvis (figur 2A). Mens der kan anvendes andre vasodilatorer, ACh inducerer endothel-afhængig vasodilation og således er nyttige ved vurderingen både endotel samt vaskulær glat muskulatur levedygtighed. Efterfølgende arterielle segment er inkuberet igen i PSS og når diameteren stabiliserer, er den klar til eksperimentet. Ved afslutningen af hvert forsøg, er arterielle segmenter inkuberes i Ca2 + fri PSS at måle PD (figur 2B). Diametrene optaget i figur 2A og 2B er tabuleret i Figur 2C. Absolute MT er forskellen mellem PD og stabil diameter opnået ved spontan vasokonstriktion 70 mmHg. Derfor er MT observeret fra sporingen viste er 33% af PD. Som det ses her, respons på ACh (1 uM) er ge nerally ligner den, der er observeret for Ca2 + gratis PSS. Bemærk, at i forsøg til vurdering vasodilation, kan forudgående tilsætning af en vasokonstriktor være nødvendig.

At bestemme myogene respons, er rotte mesenteriske arterielle segmenter udsat for stigende intraluminale tryk trin mellem 20 og 100 mmHg. Et eksempel er vist i figur 3A. Arterierne får lov til at opnå en stabil diameter efter hvert trin (~ 5 min; stiplede linjer). Efterfølgende samme arteriel segment udsættes for tryk-respons i Ca2 + -fri PSS med 0,39 mM EGTA og 0,1 mM SNP (figur 3A). Den opnåede i slutningen af hvert tryk trin diameter kan vises som en linje graf (figur 3B). MT beregnet som den procentvise forskel i diameter for Ca2 + -holdige vs. Ca2 + -fri PSS ved hvert tryk kan vises som linje eller søjlediagram (figur 3C).

nt "fo: keep-together.within-side =" altid "> Figur 1
Figur 1: En illustration af pres myograf set-up (A) De vigtigste komponenter er angivet.. Se tabel 3 for en liste over alt udstyr. (B) Høstet mesenteriske seng fastgjort på en Sylgard-belagte parabol er vist. (C) En tegning af mesenteriske arteriel arcade vises. Sorte prikker repræsenterer pin positioner. Den stiplede del repræsenterer en arteriel segmentet, der skal dissekeres. Små grønne søjler angiver de indsnit steder på arterien. Klik her for at se større figur .

/ftp_upload/50997/50997fig2.jpg "/>
Figur 2: (A) Som angivet af opsporing, diameter af små mesenteriske arterier fra rotter, når tryk ved 70 mmHg, aftager spontant. Tilsætning af ACh (1 uM) øgede diameter (til nær-start diameter). Tilsætning af Phe (1 uM) til vævsbad nedsætter arteriel diameter. (B) Inkubation i Ca2 + -fri PSS øger arteriel diameter. (C) Diameteren af en enkelt tryksat arteriel segment i forskellige perfusater vist i A og B er tabuleret.

Figur 3
Figur 3: (A) Arteriel diameter registreres kontinuerligt samtidig øge intraluminale tryk trinvist i nærvær af PSS og Ca2 + -friPSS. (B) Linje kurve af arteriel diameter opnået på hvert tryk trin. (C) Bar graf over MT opnået ved hvert tryk trin. Klik her for at se større figur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske trin, fejlfinding og ændringer

I en typisk isobarisk præparat fartøj, er arterien under tryk ved 70 mmHg mellem to glas kanyler perfunderet med varmt (37 ° C) PSS. Efter 30-45 min, arterier udvikle MT, kendetegnet ved spontan fald i diameter, der stabiliserer i 20-30 min. De modstandskar fra forskellige kar udvikle variabel MT. For eksempel rotte modstand mesenteriske arterier udvikle MT ~ 25% af PD, mens cremastric arterier kan opnå MT ~ 40% af PD. Arterier, der ikke udvikler MT inden 60 min skal kasseres; denne varighed kan variere afhængigt af vaskulær seng og arter. Arterier med utilstrækkeligt respons på Phe og ACh bør også kasseres.

pH og temperatur af PSS have en betydelig indvirkning på udviklingen af ​​MT. pH af PSS, som sidder i lange perioder uden beluftning, kan stige. Derudover, ved stue- er usandsynligt, at d temperatur arterierevelop MT. Derfor PSS bør beluftet så hurtigt som muligt ved hjælp gasblandingen angivet i protokollen sektion og temperatur perfusionskammeret skal monitoreres kontinuerligt og holdt ved ~ 37 ° C under anvendelse af en flow-varmelegeme.

Da disse eksperimenter er 3-5 timer i varighed, er perfusionskamre og tilhørende rør udsat for PSS i lange perioder; salt-bundfald kan ophobes i både kammeret og slange, der kan forstyrre efterfølgende eksperimenter. Derfor er det afgørende at vaskes perfusionskammeret og skyl slangen med deioniseret vand efter hvert forsøg. Tilsvarende skal være omhyggelig med at rengøre Sylgard-belagte parabol bruges til dissektion med deioniseret vand efter hver dissektion.

Begrænsninger

På trods af sin betydning, PM har forskellige begrænsninger. For det første at den kollektive omkostninger anskaffe PM udstyr er høj (~ 22 tusind dollars), og kan være uoverkommelige for visse labs; en detaljeret liste over udstyr er vist i tabel 3 For det andet er der behov for nye skibe for de fleste eksperimenter.; dermed et nyt dyr er aflivet for hvert forsøg, hvilket bidrager til de samlede omkostninger. For det tredje, dissektion af små mesenteriale arterier er kedelig og kræver andre instrumenter såsom dissektion mikroskop og mikrodissektions værktøjer, som er udsat for skader. For det fjerde er der en indlæringskurve; få ekspertise i og oprettelse PM i et laboratorium kræver dedikeret personale, tid og kræfter.

Betydning med hensyn til andre fremgangsmåder og fremtidige anvendelser

Isobarisk og isometrisk forsøgsprotokoller er to store tilgange anvendes til at bestemme vaskulær reaktivitet. I modsætning til isobare præparater, er vasoaktivitet i isometriske præparater bestemt ved at måle vaskulær glat muskulatur spændinger hjælp af en wire myograf system. Ud over forskelle i udstyr, der kræves for disse to forsøgsprotokoller, agonist-induced sammentrækning er anderledes blandt disse eksperimentelle tilgange i forhold til størrelsen, tidsforløbet og retningen af karvæggen spænding 11,19. På grund af tekniske bekvemmeligheder og begrænsninger, begge præparater tjener vigtige roller. For eksempel fordi det er lettere at vedligeholde mikroskopisk fokus på isometriske præparater, er de ofte anvendes til samtidig måling af vaskulær reaktivitet og ændringer i vaskulær glat muskulatur Ca2 +. På den anden side er myogene aktivitet bedst vurderes i tryksatte præparater, der anses for at efterligne in vivo fysiologiske tilstand nøje. En detaljeret gennemgang af forskellene mellem disse præparater er forsynet tidligere 19.

Afslutningsvis tryk myography er en pålidelig teknik til at undersøge myogene respons i små modstandskar ved nær-fysiologiske betingelser. Trods sine begrænsninger, har PM forudsat væsentlige bidrag til forståelsen af ​​ændringer ivaskulær funktion i normale og patologiske tilstande 3-7,20-23. Regulering af systemisk vaskulær tone er meget kompleks og involverer lokale og neuro-hormonale faktorer dermed isolering rolle specifikke mekanismer, der regulerer tone af vaskulære senge in vivo er vanskelig. I denne henseende ex vivo tryk arterielle præparater tjener som fremragende surrogater. Der er interesseret i transduktion mekanismer MT og myogen reaktion omtales tidligere offentliggjorte fremragende anmeldelser 15,19. I fremtiden kan vi se fremskridt i udstyr, der integrerer evaluering af myogen respons og ændringer i downstream budbringere såsom Ca 2+ selvom det er højst usandsynligt, at vi ville se en reduktion i udgifter til udstyr. Men da denne teknik er vedtaget af forskere med varieret baggrund, vil vi sandsynligvis se sin ansøgning for at vurdere ændringer i mikrovaskulære funktion i sygdomme end hypertension, diabetes og chok, såsom skrumpelever, dementia etc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfattere ikke har økonomiske konflikter.

Acknowledgements

Sandeep Khurana er støttet af NIH (K08DKO81479). Vikrant Rachakonda understøttes af (T32DK067872).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemical
Acetylcholine Sigma Aldrich A6625
Calcium chloride (CaCl2) Sigma Aldrich 223506
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich G5767
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) Sigma Aldrich E3889
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) Sigma Aldrich E9884
HEPES Sigma Aldrich H3784
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma Aldrich M7506
MOPS Sigma Aldrich M5162
Phenylephrine Sigma Aldrich P6126
Potassium chloride (KCl) Sigma Aldrich P3911
Potassium phosphate (KH2PO4) Sigma Aldrich P5655
Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) Sigma Aldrich S6014
Sodium chloride (NaCl) Sigma Aldrich S7653
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S5881
Sodium nitroprusside Sigma Aldrich 13451
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) Sigma Aldrich S9638
Sodium pyruvate Sigma Aldrich P8574
Table 1.
Physiological salt solution (1,000 ml) mM
KCl 4.9 0.365 g
NaCl 112 6.545 g
MgSO4.7H2O 1.2 0.296 g
KH2PO4 1.2 0.163 g
Glucose 11.5 2.072 g
NaHCO3 26 2.184 g
HEPES 10 2.383 g
CaCl2 2 2 ml (1M stock)
De-ionized water 998 ml
Ca2+ free physiological salt solution (100 ml) mM
KCl 4.9 0.036 g
NaCl 112 0.645 g
MgSO4.7H2O 1.2 0.029 g
KH2PO4 1.2 0.016 g
Glucose 11.5 0.207 g
NaHCO3 26 0.218 g
HEPES 10 0.238 g
EGTA 0.39 0.015 g
Sodium nitroprusside 0.1 0.0026 g
De-ionized water 100 ml
Dissection solution, stock (500 ml) mM
NaCl 145 21.18 g
KCl 4.7 0.875 g
MgSO4 1.2 0.739 g
MOPS 2 1.049 g
EDTA 0.02 0.019 g
De-ionized water 500 ml
Working dissection solution (100 ml) mM
Dissection solution stock 20 ml
Glucose 1.2 0.091 g
NaH2PO4 5 0.016 g
Sodium pyruvate 2 0.022 g
CaCl2 2 0.2 ml (1M stock)
De-ionized water 79.8 ml
Table 2. Composition of Experimetnal solutions
Equipment
CCD Monochrome Camera The imaging Source DMK 21AU04
Single inline solution heater Warner Instruments 64-0102
Thermistor Warner Instruments 64-0108
Dual automatic temperature controller Warner Instruments TC-344B
Flaming/Brown micropipette puller Sutter Instruments P-97
Fluorescence System Interface IonOptix model FSI-700
Forceps and scissors World Precision Instruments
Ion Wizard-Core and Analysis IonOptix Ion Wizard 6.0
Laboratory tubing Silastic 508-005
Male Sprague Dawley rat Harlan Laboratories
Master flex console drive Cole-parmer
Milli-Q Plus Ultrapure Water System Millipore ZD5211584
Ophthalmic monofilament nylon suture Ethicon 9007G
Photometry and Dimensioning Microscope Motic AE31
Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer Living Systems Instrumentation PS-200
Stereomicroscope Nikon Instruments Inc SMZ660
Vessel Chamber Living Systems Instrumentation CH-1
Dissection dish Living Systems Instrumentation DD-90-S
Thin Wall Glass Capillaries World Precision Instruments TW120-6
Microforge Stoelting 51550
Table 3.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Christensen, K. L., Mulvany, M. J. Location of resistance arteries. J Vasc Res. 38, 1-12 (2001).
  2. Rietzschel, E. R. Oxidized low-density lipoprotein cholesterol is associated with decreases in cardiac function independent of vascular alterations. Hypertension. 52, 535-541 (2008).
  3. Hill, M. A., Ege, E. A. Active and passive mechanical properties of isolated arterioles from STZ-induced diabetic rats. Effect of aminoguanidine treatment. Diabetes. 43, 1450-1456 (1994).
  4. Osol, G., Cipolla, M. Interaction of myogenic and adrenergic mechanisms in isolated, pressurized uterine radial arteries from late-pregnant and nonpregnant rats. Am J Obstet Gynecol. 168, 697-705 (1993).
  5. Cipolla, M. J., McCall, A. L., Lessov, N., Porter, J. M. Reperfusion decreases myogenic reactivity and alters middle cerebral artery function after focal cerebral ischemia in rats. Stroke. 28, 176-180 (1997).
  6. Ren, Y., et al. Enhanced myogenic response in the afferent arteriole of spontaneously hypertensive rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298, H1769-H1775 (2010).
  7. Hayashi, K., Epstein, M., Saruta, T. Altered myogenic responsiveness of the renal microvasculature in experimental hypertension. J Hypertens. 14, 1387-1401 (1996).
  8. Schubert, R., Mulvany, M. J. The myogenic response: established facts and attractive hypotheses. Clin Sci (Lond). 96, 313-326 (1999).
  9. Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography. J Vis Exp. (2011).
  10. Buus, N. H., Vanbavel, E., Mulvany, M. J. Differences in Sensitivity of Rat Mesenteric Small Arteries to Agonists When Studied as Ring Preparations or as Cannulated Preparations. British Journal of Pharmacology. 112, 579-587 (1994).
  11. Falloon, B. J., Stephens, N., Tulip, J. R., Heagerty, A. M. Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations. Am J Physiol. 268, H670-H678 (1995).
  12. Schubert, R., Wesselman, J. P. M., Nilsson, H., Mulvany, M. J. Noradrenaline-induced depolarization is smaller in isobaric compared to isometric preparations of rat mesenteric small arteries. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 431, 794-796 (1996).
  13. Khurana, S., Raina, H., Pappas, V., Raufman, J. P., Pallone, T. L. Effects of deoxycholylglycine, a conjugated secondary bile acid, on myogenic tone and agonist-induced contraction in rat resistance arteries. PLoS One. 7, e32006 (2012).
  14. Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. J Physiol. 28, 220-231 (1902).
  15. Hughes, J. M., Bund, S. J. Arterial myogenic properties of the spontaneously hypertensive rat. Exp Physiol. 87, 527-534 (2002).
  16. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, 617-619 (1976).
  17. Raina, H., Zacharia, J., Li, M., Wier, W. G. Activation by Ca2+/calmodulin of an exogenous myosin light chain kinase in mouse arteries. J Physiol. 587, 2599-2612 (2009).
  18. Fenger-Gron, J., Mulvany, M. J., Christensen, K. L. Mesenteric blood pressure profile of conscious, freely moving rats. J Physiol. 488, (Pt 3), 753-760 (1995).
  19. Davis, M. J., Hill, M. A. Signaling mechanisms underlying the vascular myogenic response). Physiol Rev. 79, 387-423 (1999).
  20. Osmond, J. M., Mintz, J. D., Dalton, B., Stepp, D. W. Obesity increases blood pressure, cerebral vascular remodeling, and severity of stroke in the Zucker rat. Hypertension. 53, 381-386 (2009).
  21. Ge, Y., et al. Endogenously produced 20-HETE modulates myogenic and TGF response in microperfused afferent arterioles. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 102-103, 42-48 (2013).
  22. Ryan, M. J., et al. Placental ischemia impairs middle cerebral artery myogenic responses in the pregnant rat. Hypertension. 58, 1126-1131 (2011).
  23. Bagi, Z., et al. Type 2 diabetic mice have increased arteriolar tone and blood pressure: enhanced release of COX-2-derived constrictor prostaglandins. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 1610-1616 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats