감소 이트라코나졸의 농도와 지속 시간은 치료의 성공

Immunology and Infection

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Summary

양서류 Batrachochytrium의 dendrobatidis 감염은 감소 된 농도 (0.0025 %) 및 일반적으로 사용되는 것보다 이트라코나졸의 짧은 기간 (6 일 동안 오분 화장실)을 사용하여 제거 할 수있다. 이하 사망률과 적은 부작용이 변경됨 치료 프로토콜을 사용하여 관찰 하였다.

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Brannelly, L. A. Reduced Itraconazole Concentration and Durations Are Successful in Treating Batrachochytrium dendrobatidis Infection in Amphibians. J. Vis. Exp. (85), e51166, doi:10.3791/51166 (2014).

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Abstract

수륙 양용 비행기는 척추 클래스의 가장 큰 감소를 경험하고 이러한 감소의 주요 원인은 질병 chytridiomycosis을 일으키는 곰팡이 병원균, Batrachochytrium의 dendrobatidis (BD)입니다. 포로 보증 식민지 멸종 위기 종의 양서류 세계적 중요하고 멸종의 중요한 위협이있는 사람들을위한 유일한 생명선이 될 수 있습니다. 무병 식민지를 유지하는 것이 포로 관리자의 우선 순위, 모든 종과 삶의 단계에서 아직 안전하고 효과적인 치료법이 발견되지 않았습니다. 일반적으로 사용되는 투여 량은 일부 개인과 종에 해가 될 수 있지만 가장 널리 사용되는 화학 요법 치료, 이트라코나졸입니다. 우리는 이트라코나졸의 낮은 및 안전하지만 유효 선량은 BD 감염을 치료하기 위해 찾을 수 있는지 여부를 평가하기 위해 임상 치료 실험을 수행 하였다. 우리는 발견 0.01-0.0025 %에서 치료 농도를 감소시키고 (11)로부터 치료 기간을 감소시킴으로써5 분 화장실 -6 일, 개구리 적은 부작용 적은 치료 관련 사망률과 BD 감염으로 치료 될 수 있습니다.

Introduction

수륙 양용 비행기는 현재 모든 척추 동물 분류군 1의 생물 다양성에 가장 큰 감소를 경험하고 있습니다. . Chytridiomycosis, chytrid 곰팡이 병원균 Batrachochytrium의 dendrobatidis (BD)에 의한 피부 질환, BD는 생물 다양성 손실의 원인에 대한 기록에 최악의 병원균이 극적으로 감소 2의 주요 원인 중 하나입니다 그것은 양서류 600 종 이상 감염되어있다 많은 200 종의 멸종 위기 또는 2,3 멸종있는 300 종의 감소를 일으키는 원인이되었다. 양서류 chytrid 균은 특정 호스트되지 않고 심각한 질병을 일으키는 진행하는 BD 감염을 허용하는 호스트의 어떤 자질 불분명하다. Chytridiomycosis 전해질 손실 및 심장 마비 4의 결과로, 피부에 이온 채널을 방해하여 죽음의 원인이됩니다. 또한, (된 BD zoospores을 포함하지 않는) BD 상층 액은 올챙이의 면역 반응 5 의원 원인G 연구원은 BD 부산물 6 독성을 생산하고 생각합니다.

많은 종은 빠르게 감소하고 있기 때문에, 포로 보증 식민지 사육 프로그램은 중요한 보존 조치하고, 어떤 종의 유일한 생명선이 될 수 있습니다. 구축 및 무병 식민지를 유지하는 것은 양서류 관리 시설에 대한 도전입니다. BD 감염을 치료하기위한 현재의 화학 요법의 방법은 효과적이지만, 치료되는 동물에 유해 할 수 있으며, 단일 치료법은 종 및 양서류 7의 연령 등급에 걸쳐 성공적인 없었다.

BD 감염에 대한 치료의 몇 가지 임상 시험은 7을 수행하고 있습니다. 치료의 가장 일반적으로 사용되는 세 가지 방법은 열 치료, 클로람페니콜 및 이트라코나졸이다. 열 치료는 몇 가지 부작용, 여러 삶의 단계에서 사용할 수있을 것으로 보인다 nonchemotherapeutic 치료 옵션이며, gener입니다동맹 효과적이다. 치료 연구에서 채트와 리차드 - Zawacki 8은 처리 된 동물의 96 %가 10 일 동안 30 ° C에서 보관 후 감염을 취소 한 것으로 나타났습니다. 이 시험은 100 % 성공하지 않지만, 다른 사람들이 자신의 종족에 대한 열 치료를 평가하기위한 기준을 제공합니다. 열 치료는 많은 종에 효과적이지만, 장시간 고온으로 유지 할 수 많은 고산 종 비실용적이다. 클로람페니콜, 항균, 많은 종의 BD 치료에 성공적으로 사용하고, 체외에서 곰팡이 성장을 억제하고있다. 항균 같이, 클로람페니콜 구체적 균류 공격하지 않지만 진핵 세포 9에서 아폽토시스를 일으키는 것으로 알려져있다. 그것은 행동의 정확한 메커니즘은 알 수 있지만, 클로람페니콜 치료, 세포 내 포자낭을 죽이고, 피부의 세포 사멸을 일으키는 것으로 추측하고있다. 임상 시험 때문에 실시하지 않고,되어 있지만용량과 처리 시간, 평가되지 않은 현재의 치료 프로토콜은 일반적으로 지상파 양서류이 치료가 실용적이지, 2~4주 10, 11에 침수가 필요합니다. 인체 노출은 재생 불량성 빈혈 (12)의 드문 형태와 관련되어 있기 때문에 클로람페니콜은 동물 사용에 대한 일부 국가에서 제한되어 있습니다.

이트라코나졸, 아 졸계 항진균제, 가장 널리 포로 양서류 BD 감염의 치료에 사용된다. 가장 널리 사용되는 프로토콜 5 분 11 일 연속 하루 동안 0.01 % 이트라코나졸 솔루션 목욕 동물입니다. 이 프로토콜은 양서류에 효과적이지만, 양서류는 11, 13의 임상 시험을 기반으로하지 않는, 포유 동물의 관리에 사용되는 표준에서 파생되었다. 이 프로토콜은 특히 속라나와 올챙이 최근 metamorphs (11), 특정 종에 부작용을 일으킬 수 있습니다.올챙이 처리 이트라코나졸의 훨씬 더 낮은 농도 (0.0005 %)을 이용하여 성공을 거두었지만 탈색 (14)와 관련되었다. 이 같은 농도는 최근 metamorphs에 상용화에 박차를 가하고 감염 (15) 치료에 실패한 것으로 밝혀졌다. 이트라코나졸 치료와 부작용의 위험이 있기 때문에, 일부 실무자는 11 일 연속 절반 보통 농도 (0.005 %)를 사용하고이 BD 감염 16을 ​​치료에 성공을 발견했다.

본 연구는 BD 감염 (15)을 치료하는 이트라코나졸을 사용하여 임상 치료 시험을 요약 한 것입니다. 이 프로토콜은 이트라코나졸과 BD 감염된 동물의 치료에 안전하고 효과적인 모두 가장 낮은 용량과 처리 시간을 찾기 위해 시도에 대해 설명합니다. 본 연구에서 사용 된 동물은 걸프 코스트 두꺼비의 최근 metamorphs, Incilius nebulifer했다.

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Protocol

윤리 승인 :이 연구와 그 방법은 툴레 인 대학의 동물 사용 및 관리위원회 (. 프로토콜없이 0407)에 의해 승인되었다.

1. BD 감염에 대한 테스트

  1. BD에 대한 보라고
    1. 멸균 면봉 면봉 동물 ventrum에 다섯 번, 각 허벅 다리, 양쪽, 45 스트로크의 총 각 다리에 다섯 번. 보라고는 양서류의 피부에 BD에 대한 샘플링의 비 침습적 인 방법입니다.
    2. 부드럽게 DNA의 가장 큰 금액을 면봉에 수집하기 위해 스트로크시 사이에 면봉을 회전.
    3. -20 ℃에서 1.5 ml의 마이크로 튜브에 보관 면봉
  2. DNA 추출 및 qPCR의 분석
    1. 동물 조직에 대한 지침에 따라, 시판되는 DNA 분리 키트를 이용하여 면봉으로부터 게놈 DNA를 추출한다.
    2. 보일 다음 정량 실시간 PCR (qPCR에)를 사용하여 추출 된 DNA를 분석 17, 다음과 같이 수정과. :
    3. 이중 탈 이온수로 DNA 추출 샘플보기 1:10 희석.
    4. PCR 억제를 방지하기 위하여 소 혈청 알부민 (BSA)의 0.7 μl를 추가.
    5. PCR 억제가 결과에 영향을 미치는되지 보장하기 위해 각 샘플의 내부 양성 대조군을 포함합니다.
    6. 긍정적이고 부정적인 제어 및 유주자 (감염) 부하를 추정하기 위해 희석 기준의 일련의 실행 샘플.

2. 접종

  1. 문화 BD
    1. (40 분 동안 121 ° C) 멸균 및 냉각, 1 L의 역삼 투 또는 탈 이온수에 10g의 트립 톤을 추가하여 트립 톤 국물을 준비한다. 일단 23 ° C로 냉각, 1 ㎖ 페니실린 - 스트렙토 마이신을 추가합니다.
    2. 23 ° C에서 이레 동안 트립 톤 국물에 (Phyllomedusa 여우 원숭이에서 Guabal, 파나마에서 격리 J. Longcore에서 JEL411) BD 변형 성장
  2. B로 이동로스는 문화 트립 톤 한천 플레이트합니다.
    1. 판을 만들려면 1 L 역삼 투 또는 탈 이온수와 오토 클레이브 (40 분 동안 121 ° C)에 10g의 트립 톤과 10g의 한천을 추가합니다.
    2. 멸균 혼합물을 터치 할 정도로 멋지다하지만 응결 전에, 층류 후드, 페트리 접시에 가득 1/4-1/3을 부어 한 번.
    3. 한천이 완전히 응고 및 냉각되면, 각각의 판에 0.5 ㎖ BD 국물을 추가하고 접시 주위에 균일하게 확산. 건조하도록 허용합니다.
    4. 플레이트는 BD의 zoospores, 파라 필름과 인감 플레이트에 접종하면.
    5. 판 5-7 일 동안 23 ° C에서 배양 할 수 있습니다. 접종 전에 생존을 보장하기 위해 운동을 유주자 확인합니다.
  3. 유주자 접종 솔루션에 대한 홍수 판
    1. BD 배양과 성장의 5~7일 후, 세 수돗물 5 ㎖의 각 판 홍수와 zoospores 10 분 동안 미디어를 입력 할 수 있습니다.
    2. 유주자의 suspe을 붓고휴대용 용기에 nsion.
    3. 혈구와 유주자 농도를 추정한다.
    4. 세 수돗물로 1 × 10 6 3 당 ML의 농도로 혼합물을 희석.
  4. 동물을 접종
    1. 각각 50 ㎖ 용기에, 그 ventrum에 3 ㎖ 접종 혼합물을 부어 각각의 동물에 접종. 추가 접종은 접종 용기의 바닥에 떨어지는 것을 허용한다.
    2. 각 동물은 감염을 확인하기 위해 24 시간 동안 접종 용기에 남아있을 것입니다.
    3. 접종 24 시간 후, 개별 소독 terraria에 동물을 반환합니다.
    4. 감염 2 주에 구축 할 수 있습니다. 면봉과의 qPCR 결과 감염을 확인하고 치료를 시작합니다.
    5. BD-음성 대조군의 경우, 5 ㎖와 홍수 BD없는 한천 플레이트는 상기와 같은 방법을 사용하여 수돗물 및 모의 접종 동물을 세.

3. 치료식이 요법

  1. Prepa처리 욕 재
    1. 1 L 양서류 링거액 (- 가장 효과적인 치료 농도 0.0025 %의 이트라코나졸)에 2.50 ML에게 수성 이트라코나졸 (1 % Sporanox 구강 솔루션)를 추가합니다.
      1. 양서류 링거액 제조법 : 1 L 역삼 투 또는 탈 이온수, 6.6 g의 소듐 클로라이드, 0.15 g의 염화 칼륨, 0.15 g의 염화 칼슘, 및 0.2 g의 중탄산 나트륨. 오토 클레이브 솔루션 (40 분, 121 ℃) 및 실내 온도까지 냉각 할 수 있습니다.
      2. 0.01 % 이트라코나졸 치료 농도의 경우, 1 L 양서류 링거액에 10.00 ml의 수성 이트라코나졸 (1 % Sporanox 구강 솔루션)를 추가
      3. 0.005 % 이트라코나졸 치료 농도의 경우, 1 L 양서류 링거 용액에 5.00 ML에게 수성 이트라코나졸 (1 % Sporanox 구강 솔루션)를 추가합니다.
    2. BD-양성BD-음성 대조군의 경우, 이트라코나졸과 양서류 링거액 동물 목욕.
  2. 치료 <올>
  3. 처리 액 35 mL를 소독 50 ㎖ 용기에 개별 양서류를 놓습니다.
  4. 확인 동물은 완전히 부드럽게 용기를 소용돌이로 5 분 동안 적용됩니다.
  5. 소독 terraria에 동물을 반환합니다. 6 일 동안 반복합니다.
  • 치료의 성공을 보장합니다
    1. 일 처리에 BD 감염에 대한 시험 동물은 시작됩니다.
    2. 감염을 보장하기 위해 4 주 동안 일주일에 해제 한 BD 감염에 대한 실험 동물 일주 처리가 완료되면, 한 번.
  • 생물 등 4. BD

    1. 개인 terraria 매주 소독.
      1. 10 % 표백제 해결책 목욕 terraria 및 치료 컨테이너 목욕.
      2. 흐르는 물에 두 번 표백 용기를 내십시오.
      3. 용기는 다시 사용하기 전에 24 시간 동안 건조 할 수 있습니다.
    2. 교차 오염을 방지하기 위해 동물을 처리 할 때 깨끗한 니트릴 장갑을 착용BD의 병원체. 각각의 동물을 처리하는 사이에 장갑을 변경합니다.
    3. 10 % 표백제에 솔루션을 가져 와서 폐기 전에 모든 액체 폐기물을 소독.
    4. 잠재적으로 폐기 전에 BD에 노출되는 모든 고체 폐기물을 압력솥.

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    Representative Results

    모든 동물 사주 종료 치료 후 BD-음성 인 경우 이트라코나졸 치료가 성공한 것으로 간주되었다. 치료를 시작하기 전에 치료가 끝난 사주 후, BD-양성 대조군 동물 16,765.12의 평균 유주자 부하가 있었을 때 2 주 접종 후, 모든 BD-접종 동물 ((17.34 ±) 1,121.7의 평균 유주자 부하, 감염 ) 14643.08를 ±.

    Incilius nebulifer의 치료 (N = 15) 6 일 동안 다섯 분 동안 0.0025 % 이트라코나졸 농도 화장실을 사용하여 하루에 성공했다. (그림 1B)의 많은 : BD-양성 대조군 (χ 2,1 = 2.17, 특급 (B) = 20,500, p = 0.339 콕스 회귀)에 비해 이트라코나졸 치료이 낮은 농도로 투여는 사망률에 유의 한 차이가 없었다 누구는 BD 감염 재판이 끝날 때까지 살아 남았다.

    0.0025 %의 난의 화장실십일일에 대한 traconazole, 0.005 % 모두와 6 일 동안 0.0025 %의 이트라코나졸은 모두 (그림 1A1B) 크게 증가 십일일의 치료 길이. 권장 치료 농도와 절반 농도 효과적이고 안전한 치료 방법이 발견되었다 사망 BD-양성 대조군 (콕스 회귀 분석과 비교했을 때 : 2.1 χ 0.01 %의 이트라코나졸 = 35.68, 특급 (B) = 307.54, p <0.01; 2,1 χ 0.005 %의 이트라코나졸 = 16.17, 특급 (B) = 9.40 , P <0.01) (그림 1A). 십일일의 0.01 % 이트라코나졸 치료 I. 100 % 사망률의 원인 nebulifer, 그리고 절반의 농도 (11 일 0.005 %의 이트라코나졸)는 60 %의 사망률 (그림 1A)을 발생. 치료 중 사망 한 동물의 작은 하위 집합에 대한 부검 및 조직 병리학을 실시 하였다. 이 연구에 동물 chytridiomycosis으로 사망합니다.


    그림 1. 이트라코나졸 치료 15에서 생존의 차이 (A) Incilius nebulifer :. 11 D의 치료 (N = 15 각 이트라코나졸 0.01의 농도, 0.005 및 0.0025 %를, N = BD-양성 대조군 17이고, n = 9 BD-음성 대조군). (B) I. nebulifer (BD-음성 대조군에 대한 N = 15, 0.01, 0.005와 0.0025 %의 각 이트라코나졸 농도, N = BD-양성 대조군 17이고, n = 9) 6 D 치료. 검은 색 화살표는 치료의 마지막 날을 나타냅니다. 실선은 제어 그룹의 생존을 나타냅니다 (블랙 = BD 양성, 회색 = BD-음). 점선은 이트라코나졸 치료군의 생존을 나타냅니다 (밝은 회색 점 = 0.01 %, 중간 회색 점 = 0.005 %, 검은 점 = 0.0025 %의 이트라코나졸). (이 그림은, Brannelly 등. 15에서 그림 1B 및 1C를 수정되었습니다). 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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    Discussion

    이 프로토콜을 이용하여, 우리는 안전하고 효과적으로 양서류 BD에 대한 이트라코나졸의 치료 치료 복용량 및 시간을 절감 할 수 있었다. 가장 낮은 처리 용량과 시간 (6 일 동안 0.0025 %)이 subclinically 감염 I.에 대한 성공적인 치료했다 nebulifer. 낮은 투여 량 및 처리 시간 모두의 효과는 양서류 모든 종 및 나이 클래스에 사용될 제공된 안전하고 효과적인 치료법은 없기 때문에, BD 감염 치료를위한 임상 치료 실험의 필요성을 설명한다.

    이트라코나졸 치료로 인한 사망의 원인은이 점 (11)에서 알 수 없습니다. 부검 및 조직 병리학은 Brannelly 등. 15 연구에서 치료 기간 중 또는 직후 사망 한 사람의 작은 하위 집합에 실시되었다. 그것은 어떤 동물이 죽지 않았다 분명하지만 이러한 분석의 결과는 죽음의 원인에 대한 결정적이었다chytridiomycosis의. 보통 자기 소화가 죽음과 치료 그룹 사이의 미묘한 차이를 감지 할 수있는 능력에 영향을 미칠 수 있습니다 표본 보존 사이에 발생했습니다.

    이 프로토콜은 하나의 안전하고 효과적인 치료 요법의 존재를 지원하지만,이 같은 더 많은 실험이 진행해야합니다. 제 아졸 처리, 보리 코나 졸은, 적어도 하나의 종 (18)에서 효과적인 것으로 입증되었다. 보리 코나 졸은 이트라코나졸보다 수용액에서보다 안정적이고 올챙이 사용 18 안전한 것으로 입증되었습니다. 이트라코나졸과 보리 코나 졸의 하나의 처리 용량은 가격이 비슷하지만, 보리 코나 졸은 더 정기적으로 이트라코나졸을 선택하는 연구자와 포로 관리자를 선도, 이트라코나졸 이상 구입 훨씬 더 비싸다. 이 때, 하나의 출판 연구는 효율적으로 보리 코나 졸 (18) 보여 주었다. 효능을 입증하기 위해, 더 많은 종의 상용화에 박차를 가하고해야합니다.

    <P 클래스 = "jove_content"> 아졸 항진균제는 곰팡이의 성장을 억제하는 13 항진균 화학 요법의 하나의 유형을 나타냅니다. . BD는 표피에 BD를 죽일 것을 목표로 28 ° C 및 열 치료 이상의 온도에서 체외에서 살해 곰팡이 병원균을 죽이기보다는 성장을 감소하는 것을 목표로 다른 치료 방법이 있습니다. 테르 비나 핀 염산염, 어떤 종 19 BD 감염을 치료에 성공했습니다 다른 항진균제는 진균 세포의 용해를 일으키는 방식으로 작동합니다. 직접 병원균을 공격 항진균제는 더 성공적으로 치료 될 수 있으며, 더 많은 작업 BD 감염에 대한 유망한 치료 옵션을 테스트하기 위해 수행해야합니다.

    이트라코나졸 치료 subclinically 감염된 동물에 효과적인 것으로 표시되었지만, 임상 chytridiomycosis의 치료는 크게 실패하고있다. 날짜 (20)에 하나의 연구가 성공적으로 끝으로 처리했다 I LL의 양서류 및 치료 전해질 치료와 화학 요법의 공격적인 포메이션으로 출진했습니다. 불치병에 걸려 동물에 대한 성공적인 치료 옵션은 특히 모든 개인의 보호 종의 보존을 위해 필수적입니다 포로 식민지에서 비판적으로 멸종 위기에 놓인 동물을 위해 필요하다.

    용량 및 처리 시간을 감소시키는 것은 I. 대해 성공적 이었지만 nebulifer, 치료는 임상 감염 다른 종이나 동물에의 상용화에 박차를 가하고되지 않았습니다. 몇몇 종과 삶의 단계 이트라코나졸 치료의 관용, 그래서 대규모 처리 정권을 적용하기 전에, 포로 관리자는 안전성과 유효성을 개인의 작은 하위 집합에 대한 시험 처리 결정해야한다. 처리의 완료 후에 적어도 4 주 동안 처리 된 동물을 테스트하는 것은 낮은 수준의 감염 7의 박멸을 위해 필요하고, 모든 치료 요법 후에 구현되어야한다.

    십t "> 양서류 보존 노력에 대한 고정 보증 식민지 지역에 우선 순위 BD 감염에 대한 안전하고 효과적인 치료 옵션을 설립. BD 무료 식민지를 유지하는 보존 노력과 포로 식민지의 성공에 필수적이다는 멸종 위기에있는 종의 유일한 생명선이 될 수있다 .

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    Disclosures

    저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

    Acknowledgments

    나는에 도움을 실험 설계를 개념화 및 재료 지원, 치료 요법 및 부검을 확립 도움 A. Pessier 분석, MWH 채트, MJ Robak, K. 테스 커 및 D. Lenger 도움을 CL 리차드 - Zawacki에게 감사의 말씀을 전합니다 실험실과 촬영 기간 동안 자신의 공간의 사용에 대한 지원 및 타 롱가 동물원에서 M. 맥파든과 P. 할로. 이 프로젝트는 부분적으로 LA Brannelly에게 수여 루이지애나 환경 교육위원회의 승인을 통해 생활 기술에 의해 야생 동물과 수산의 루이지애나 부에 의해 투자되었다.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox Janssen Pharmaceutica Inc.
    NaCl Fisher Scientific S640-500
    KCl Fisher Scientific BP366-1
    CaCl2 Fisher Scientific BP510-100
    NaHCO3 Fisher Scientific BP328-500
    Sterile cotton swabs Medical and Wire Equipment MW113
    1.5 ml Microtubes Sarstedt 73.703.217
    Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit Qiagen 69581
    7500 Real-time PCR Applied Biosystems 4351104
    VIC IPC Applied Biosystems 4308323
    BSA Applied Biosystems AM2618
    Agar Invitrogen 30391023
    Tryptone Invitrogen Q10029
    Penicillin-streptomycin Invitrogen 15070-063
    Petri Dish Sigma Aldrich CLS430589

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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