Microfluidic Platform voor het meten neutrofielchemotaxis van onverwerkte volbloed

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit protocol Gegevens een test ontwikkeld om menselijk neutrofielchemotaxis meet van een druppel bloed met robuuste reproduceerbaarheid. Deze benadering omzeilt de noodzaak van neutrofielen scheiding en vereist slechts een paar minuten assay voorbereidingstijd. De microfluïdische chip maakt het mogelijk de herhaalde meting van neutrofielchemotaxis loop van de tijd bij zuigelingen of kleine zoogdieren, waar monster volume beperkt is.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jones, C. N., Hoang, A. N., Dimisko, L., Hamza, B., Martel, J., Irimia, D. Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood. J. Vis. Exp. (88), e51215, doi:10.3791/51215 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Neutrofielen spelen een essentiële rol in de bescherming tegen infecties en hun aantallen in het bloed wordt vaak gemeten in de kliniek. Hoger aantal neutrofielen in het bloed zijn meestal een indicator van de lopende infecties, terwijl een lage neutrofielen zijn een waarschuwing voor hogere risico's op infecties. Om hun taken te volbrengen, neutrofielen moeten ook effectief te kunnen verplaatsen van het bloed, waar ze het grootste deel van hun leven door te brengen, in de weefsels, waar infecties optreden. Bijgevolg kunnen defecten in het vermogen van neutrofielen migreren risico verhogen op infecties, zelfs als neutrofielen aanwezig in geschikte aantallen in het bloed. Echter, het meten van de migratie van neutrofielen mogelijkheid in de kliniek is een uitdagende taak, die is tijdrovend, vereist een grote hoeveelheid bloed, en expertkennis. Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we een robuust microfluïdische assays voor de migratie van neutrofielen, die een enkele druppel bloed onverwerkte vereist, omstandigopeningen de noodzaak van neutrofielen scheiding en is gemakkelijk te kwantificeren op een eenvoudige microscoop. In deze assay, neutrofielen migreren direct uit het bloed druppeltje, door kleine kanalen, naar de bron van chemoattractant. Om de granulaire stromen van rode bloedcellen voorkomen dat via dezelfde kanalen, implementeerden we mechanische filters met rechte hoek blijkt dat het voorschot van rode bloedcellen selectief blokkeren. We gevalideerde de test door de migratie van neutrofielen vergelijken van bloed druppels verzameld uit vingerprik en veneuze bloed. We vergeleken ook deze volbloed (WB) bronnen met de migratie van neutrofielen uit monsters van gezuiverd neutrofielen en vonden constante snelheid en richting tussen de drie bronnen. Dit microfluïdische platform zal de studie van neutrofielen migratie menselijke staat in de kliniek en de instelling onderzoek helpen ons begrip van neutrofielen functies in gezondheid en ziekte.

Introduction

Neutrofielen handel speelt een cruciale rol bij het ​​bepalen van de voortgang en oplossen van vele inflammatoire aandoeningen, zoals atherosclerose 1, bacteriële infectie of sepsis 2 en brandwonden 3. Voor hun belangrijke bijdrage aan de gezondheid en ziekte voorwaarden, aantal neutrofielen is onderdeel van de standaard bloedanalyse vaak beschouwd in klinische en onderzoekslaboratoria. Ondanks dat een van de meest alomtegenwoordige proeven en de waarde van neutrofielen in de diagnose van infectie en sepsis is herhaaldelijk ondervraagd 4. Bijvoorbeeld, een studie van neutrofielen bij patiënten met brandwonden is gebleken dat het aantal neutrofielen en de migratie van neutrofielen functie komen niet overeen; betekent dat neutrofielen alleen is niet een nauwkeurige indicator van immune status 3. Hoewel moeilijker te meten, heeft neutrofielen functionele bevoegdheid voorgesteld als meer waardevol in een breed scala van omstandigheden.

t "> Belangrijk veel neutrofielen gebreken voorbijgaande en worden niet veroorzaakt door permanente genetische defecten, een onderscheid dat grotendeels over het hoofd gezien in de kliniek tot voor kort. In het kader van brandwonden kunnen neutrofiel migratie tijdens gecontroleerd behandeling van een patiënt als een indicator van ontstekingsstatus of infectie 3. Traditionele migratie assays momenteel in het laboratorium (Boyden-kamer, Dunn kamer, micropipet assay) kan worden vertaald naar een klinische omgeving omdat ze grote hoeveelheden bloed nodig en omslachtig tijdrovend neutrofielen isolatietechnieken (tabel 1). Deze testen kunnen ook niet worden gebruikt om tijdelijke neutrofiel chemotaxis in kleine proefdieren, zoals muizen volgen, aangezien het volume van bloed nodig voor neutrofielen isolatie maakt slechts een monster en vereist vaak zelfs bundelen bloed van meerdere dieren een enkele assay. Bijvoorbeeld, een studie waarbij multiple voorwaarden en behandelingen over meerdere tijdstippen kan mogelijk duizenden muizen vereisen het gebruik van de huidige chemotaxis assays. Dit beperkt het fundamenteel biologisch onderzoek dat kan worden gedaan om de complexe dynamiek van de immuunfunctie te begrijpen in de context van verwonding, infectie of verbranden vaak bestudeerd in muizenmodellen 5.

Om de noodzaak van een neutrofiel functionele test die is snel, robuust, terwijl die minimaal volume bloed pakken hebben we een microfluïdische apparaat dat neutrofielchemotaxis meet direct van een kleine druppel bloed ontwikkeld. Het is bekend dat veel factoren in volbloed, zoals serum 6 en 7 bloedplaatjes invloed neutrofielfunctie. Het is derhalve gunstig dat het volbloed microfluïdische assay minimaliseert monster verwerking de in vivo micro-omgeving van de neutrofielen handhaven wanneer het meten van variaties in chemotaxis met een in vitro assay 8. Deze aanpakvermindert de tijd van bloedafname tot neutrofielen migratie assays van uren met behulp van traditionele technieken, om slechts enkele minuten (Tabel 1). De volbloed microfluïdische platform produceert een lineaire gradiënt chemoattractant voor de duur van het experiment, heeft geen bewegende delen en geen externe drukbron (dwz spuitpomp) vereisen. Het belangrijkste kenmerk van het ontwerp van het volbloed microfluïdische apparaat is de opname van een rode bloedcel (RBC) filtratie kam die mechanisch filtert RBC betreden de migratie kanaal van de inrichting. De rechter bochten van deze filtratie kam voorkomen dat de noodzaak voor de grootte uitsluiting filtratie, die waarschijnlijk zouden worden verstopt door rode bloedcellen en dus blokkeren de chemoattractant gradiënt van het bereiken van het actief migreren neutrofielen in de WB. De opname van het volbloed microfluïdische inrichting een 12 of 24-well plaat vergemakkelijkt het screenen van meerdere mediatoren van menselijke of murine neutrofielchemotaxis sigelijkertijd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Microfluidic Device Fabrication

  1. Met behulp van standaard fotolithografische technieken, fabriceren de meester mal wafer in een klas 1000 schone kamer. Patroon de eerste 3-urn dunne epoxy gebaseerde negatieve fotolaklaag de migratie kanalen definiëren volgens de instructies van de fabrikant. Patroon van de tweede 50-urn dikke laag om de cel-laad-en chemokine kamers definiëren.
  2. Gebruik de patroon wafer te polydimethylsiloxaan (PDMS) apparaten uitgebracht. Krachtig mengen PDMS (20 g) met initiator (2 g) gedurende 5 min met behulp van plastic vork in grote plastic weegvlak.
  3. Giet PDMS op schimmel.
  4. Ontgas de PDMS door het plaatsen mal met PDMS gegoten in een vacuüm exsiccator gedurende 1 uur.
  5. Bak en genezen PDMS microfluïdische inrichtingen ten minste 3 uur in een oven ingesteld op 65 ° C.
  6. Pons de centrale WBLCs behulp van een perforator met een tip diameter van 1,5 mm.
  7. Pons hele donut-vormige apparaten met een punctuelehaar met een tip diameter van 5,0 mm.
  8. Stofdeeltjes verwijderen uit donut apparaten met behulp van plakband.
  9. Spoel een 12-wells plaat met gedemineraliseerd water en daarna droog met stikstof. Plaats plaat in 60 ° C oven gedurende 5 minuten.
  10. Zuurstof plasma behandeling van de 12-well plaat twee keer; een keer alleen voor 35 sec en dan weer met de donut apparaten voor nog eens 35 sec.
  11. Plaats apparaten zorgvuldig in de putjes van de plaat met een pincet.
  12. Bak plaat met gekoppelde apparaten op een hete plaat is ingesteld op 80 ° C gedurende 10 minuten.

2. Microfluidic Assay Voorbereiding

  1. Prime microfluïdische apparaten direct na zuurstofplasma behandeling, wanneer het apparaat is hydrofiel en capillaire effecten priming van de kleine kanalen in de inrichting bevorderen.
  2. Maak chemoaantrekkende oplossing door het mengen van 5 pl fMLP [stockoplossing 10 uM] met 5 pi fibronectine [voorraad oplossing 1 mg / ml] en 490 pi HBSS.
  3. Langzaam pipet & #160; chemoaantrekkende oplossing in WBLC, met behulp van een gel laad-tip (Figuur 1A). Pipet extra 20 ul van de chemoattractant rond de buitenkant van het apparaat.
  4. Plaats plaat in een exsiccator gedurende 15 minuten. Door een vacuüm op de inrichting wordt de oplossing ingedruppeld in de zij-kanalen van de inrichting en de verplaatste lucht verspreid via de PDMS.
  5. Verwijder de plaat uit exsiccator en bevestigen bevochtiging van het apparaat kanaal onder de microscoop. Kijk als bubble wordt kleiner naarmate chemoattractant oplossing komt in de kamer. Geen bel moet aanwezig zijn in de inrichting na vacuüm behandeling.
  6. Was de WBLC en buitenkant van het apparaat grondig te chemoaantrekkende overtollige oplossing te verwijderen. Deze stap genereert een gradiënt van chemoattractant van elk van de focale chemotactische kamers (FCC) naar binnen apparaat.
    1. Vul een spuit van 1 ml met PBS, voeg een 30 G stompe naald aan de spuit. Voorzichtig, steek de naald van de spuit innaar het midden van de donut hole. Duw 100 ul PBS in het gat, zodat een druppel PBS vormen bovenop het apparaat.
    2. Tilt plaat en pipet 1 ml PBS ongeveer inrichting zodat de vloeistof verzameld op de bodem van de put. Zuig de vloeistof en herhaal proces voor in totaal 3x met verse bufferoplossing (gebruik de media in plaats van buffer indien de gescheiden neutrofielen in de media wordt geladen) 9.
  7. Vul elk putje met media tot de bovenkanten van de apparaten zijn ondergedompeld onder vloeistof. Laat de apparaten zitten gedurende 15 minuten te laten gradiënt te stabiliseren. Experimentele resultaten en theoretische gegevens van eindige elementen simulaties blijkt dat de gradiënten in deze apparaten zijn stabiel tot 24 uur voor kleine moleculen (bijvoorbeeld fMLP) en tot enkele dagen voor groter molecuulgewicht (bijvoorbeeld IL8).
  8. Met behulp van gel plaatsen Tips, langzaam pipet 2 pi van bloed (of geïsoleerde neutrofielen) in elke volbloed loading kamer (WBLC) (Figuur 1A).

3. Monstervoorbereiding

Menselijke neutrofielen uit capillair bloed

  1. Verzamelen capillair bloed uit de vinger prikken van gezonde vrijwilligers, die op geen immunosuppressiva. Alle patiënten monsters werden verkregen met informed consent, en procedures die door de MGH en Shriners Institutional Review Boards goedgekeurd.
    1. Voor vingerprik bloedafname, de handen wassen met water en zeep en droog de huid. Bereid anti-coagulant/stain voorraad oplossing door het toevoegen van 1 ml HBSS + 0,2% HSA en 10 pl Hoechst vlek (32,4 uM) om bloedafname (1.65 USP/50 ul bloed) heparine. Prik de vinger met behulp van een SurgiLance prikapparaatje (2.2-mm diepte, 22 G), veeg eerste druppel bloed en het verzamelen van 50 ul van bloed in Eppendorf buisje met de voorraad anti-stollingsmiddel en Hoechst fluorescerende vlek oplossing (10 pl) en voorzichtig mengen.
    Incubeer het bloed en Hoechst kleuring gedurende 10 min om voor kern fluorescente kleuring. Run monster binnen 1 uur van bloedafname.

Menselijke neutrofielen uit veneuze bloed

  1. Trek 10 ml perifeer veneuze bloed in buisjes die 33 USP heparine.
  2. Voeg 50 ul van veneus bloed media en Hoechst vlek zoals eerder beschreven. Incubeer het bloed en Hoechst kleuring gedurende 10 min om voor kern fluorescente kleuring. Run monster binnen 1 uur van bloedafname.

Neutrofielen Afscheiding uit volbloed - Positive Control

  1. Neutrofielen gescheiden, steriel technieken om neutrofielen te isoleren van de 10 ml veneus bloedmonster gebruikt Hetastarch (6% w / v) dichtheidsgradiënt gevolgd door een negatieve selectie magnetisch bolletje isolatiekit volgende protocol van de fabrikant.
  2. Geresuspendeerd de uiteindelijke hoeveelheid van neutrofielen op een concentrtie van 4.000 cellen / ul in 1X HBSS + 0,2% humaan serumalbumine. Laat cellen bij 37 ° C tot klaar om het experiment uit te voeren.

4. Microscopie en beeldanalyse voor neutrofielchemotaxis Metingen

  1. Stel biochamber temperatuur tot 37 ° C, 80% vochtigheid en CO 2 bij 5%.
  2. Start beeldvorming onmiddellijk met behulp van time-lapse imaging op een microscoop (10X of hogere vergroting).

5. Statistische analyse

  1. Handmatig bijhouden minstens 50 neutrofielen in elk monster.
  2. Tel de cellen die in de FCC in de tijd (Figuur 2).
  3. Bereken neutrofielen snelheden in het kanaal tussen WBLC en FCC met ImageJ (NIH) (Figuur 2).
  4. Kwantificeren gerichtheid van neutrofielen door telling van het aantal cellen dat de bifurcatie passeren en het berekenen van de verhouding tussen het aantal cellen dat keren naar de FCC en cellen die uitgang ee apparaat. Cellen die niet directionele zijn niet aan de chemotactische gradiënt en daarom migreren in gelijke aantallen in de richting van de FCC en de afrit kanaal (figuur 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De volbloed (WB) neutrofielchemotaxis test werd gevalideerd door de accumulatie van neutrofielen naar een fMLP gradiënt (Movie S1). Resultaten bevestigen dat RBC zijn gevangen door de filtratie kam terwijl neutrofielen (blauw) actief kunnen migreren van volbloed (figuur 3A en Movie S1). De stabiele lineaire chemoattractant gradiënt (groen) wordt gevormd door de volbloed microfluïdische apparaat werd bevestigd met behulp van FITC-gelabelde dextran (figuur 3A inzet) en de gemeten fluorescentie niveaus in de tijd. Het in deze apparaten gradiënten waren stabiel tot 24 uur voor kleine moleculen en tot een week voor groter molecuulgewicht. De efficiëntie van het wassen protocol werd geverifieerd door beeldvorming gelokaliseerde fluorescerende signaal in de FCC geen signaal in het WBLC of rondom het apparaat. De apparaten werden vervolgens gebruikt om de verschillen in neutrofiel migratie van verschillende bl beoordelenood bronnen.

Resultaten verkregen met behulp van de nieuwe WB chemotaxis platform blijkt dat neutrofielen uit een vingerprik druppel WB, van veneuze WB, of geïsoleerd uit veneuze bloed migreren met een consistente snelheid (20 ± 2 mm / min, blauwe lijn) en met gelijkaardige totale migrerende cellen ( 38 ± 10 cellen / uur, gearceerde balken) uit alle bloed bronnen (Figuur 3B). We waren ook in staat om de gerichtheid of het vermogen van de neutrofielen te kunnen volgen de chemotactische gradiënt kwantificeren. De vertakking in het ontwerp van het volbloed apparaat konden we neutrofielen die directioneel gemigreerd langs chemoattractant gradiënt naar de FCC vergeleken met neutrofielen die willekeurig gemigreerd onder chemokinesis en verliet de inrichting kwantificeren. Neutrofielen migreren van alle drie de bloed bronnen gemigreerd met een gerichtheid index van 0.9 (9 cellen in de richting van FCC voor elke cel die de inrichting verlaten).


Figuur 1. Schematische donut-vormig apparaat. A) chemoaantrekkende gevuld is in het apparaat en een gradiënt wordt gevormd langs de migratie kanaal in de richting van het middelpunt chemotaxiskamers (FCC). Zestien FCC's omgeven iedere WBLC. Na het wassen, het chemoattractant blijft alleen de FCC en een lineaire gradiënt wordt gevormd langs de migratie kanaal. De rode bloedcellen (RBC) filtratie kam voorkomt RBC verstopt het kanaal en het blokkeren van neutrofielen actieve migratie. Zie Movie S1. B) Neutrophils actief migreren uit volbloed en zich ophopen in de FCC, en hun snelheid, richting en nummers nauwkeurig kan worden gekwantificeerd. Klik hier voor een grotere weergave versie van deze figuur.

Figuur 2
Figuur 2. Schematische en overzicht van de cel tellen regeling voor de WB-apparaat. Neutrofielen actief migreren van 2 pl volbloed (WB) in volbloed laadruimte (WBLC) voorbij de rode bloedcel filtratie kam en in ingang van het apparaat geladen. Gerichtheid van de cel wordt gemeten op basis van het besluit van de cel bij de splitsing. Directionele neutrofielen zal de chemotactische gradiënt leidt naar het brandpunt chemotaxis kamer en niet-gerichte cellen te volgen zal niet volgen van de gradiënt en zullen willekeurig migreren ofwel naar de uitgang kanaal of FCC met een gelijke verdeling. Definitieve celtelling wordt op elk tijdstip door telling cellen in de FCC.files/ftp_upload/51215/51215fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Meten neutrofielchemotaxis uit een druppel bloed (WB). A) WB (1 pl) wordt in de volbloed laadruimte (WBLC) geladen. Neutrofielen (blauw) migreren langs de fMLP chemotactische gradiënt gevormd in de migratie kanaal in de richting van de FCC. B) Neutrofielen uit een vingerprik druppel WB, van veneuze WB, of geïsoleerd uit veneuze bloed migreren met consistente getallen (bars) en de snelheid (blauw lijn). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.


Tabel 1. Vergelijking van protocollen voor neutrofiel chemotaxis via het volbloed microfluïdische platform tegen een zijkanaal microfluïdische apparaat en de traditionele Boyden-kamer. De tijd en reagentia elk protocol stap te voltooien vergelijkingen tussen verschillende methoden om neutrofiel chemotaxis meten. De volbloed microfluïdische platform vermindert de totale tijd die nodig is om de test run met 95% en het vereiste bloedvolume> 99%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit werk hebben we een microfluïdische platform om neutrofielchemotaxis meet van een druppel bloed (2 pi). De on-chip mechanische filtratie van RBC van actief neutrofielen migreren omzeilt de noodzaak voor omslachtige cellen scheidingsmethoden zoals dichtheidsgradiënten 10, 11 positieve selectie, negatieve selectie of 12, die gevoelig zijn voor artefacten introduceren door het activeren neutrofielen. De mechanische filtratie van RBC onderscheidt onze technologie van andere microfluïdische chips voor het sonderen van neutrofielen migratie. Bijvoorbeeld, voorafgaand werk Aanbevolen lab 13 en Beebe et al.. 8 gebruikt selectinen op de chip, voor het scheiden neutrofielen uit het monster van compleet bloed vóór de chemotaxis assay. Na scheiding op selectine oppervlakken migratie van neutrofielen trad in bufferoplossing. In deze omstandigheden geen effect van serum op neutrofiel chemotaxis werd verwijderd. Bovendien zijn selectinen bekendde cellen te activeren door het aantrekken specifieke receptoren en derhalve kunnen veranderen in vitro chemotaxis metingen. De mechanische scheiding door de RBC filtratie kam in ons apparaat doet de staat van neutrofielen gemeten door ons apparaat niet veranderen. Ons apparaat vergemakkelijkt de robuuste metingen van snelheid en celaccumulatie nummer evenals cel gerichtheid.

In deze studie hebben we aangetoond dat neutrofielen uit gezonde vrijwilligers migreren van capillair bloed, een druppel veneus bloed, en gescheiden van aderlijk bloed migreren met gelijke snelheid en richting 14. De meting van neutrofielen gerichtheid is belangrijk bij ontstekingsaandoeningen, zoals brandwonden 3, 15 en 16 trauma, waarbij gerichtheid bekend worden aangetast. Slechtzienden en dan gestimuleerd neutrofielen kan weg van de plaats van het letsel te migreren en mogelijk letsel aan gezonde weefsels. Een beperking van deze inrichtinged in dit document is dat cel verrijking apparaat niet mogelijk en derhalve celtellingen zijn afhankelijk van het deel dat ze gevonden in de natieve volbloed. Dit kan problemen bij het verwerven van chemotaxis metingen uit een aanzienlijk aantal cellen in aandoeningen zoals neutropenie, waar het aantal neutrofielen is laag presenteren. Een ander potentieel probleem in onze apparaat is de sterische hindering van migrerende cellen door RBCs of andere cellen migreren tegelijk. In onze experimenten kan neutrofielen persen langs RBC gevangen in de windingen van de RBC filtratie kam zonder hun migratie snelheid. Bovendien, de chemoattractant concentratie en potentie is zeer belangrijk in het induceren van celmigratie. De assay oplossen andere omstandigheden kan belangrijk zijn om de dosis-respons curven uitgevoerd met variërende grootten van chemoattractant. Behandeling en verwerking meer onstabiel chemoattractanten zoals lipidemediatoren is ook van cruciaal belang, dus is het belangrijk om prime-apparatenonmiddellijk voorafgaand aan WB laden. Tenslotte is het ook belangrijk dat het bloed niet stolt voordat de primer de WB apparaat. Als het niet mogelijk is de test direct na draaien bloedafname bloed moet worden opgeslagen op een wip heparine. Laden van monster moet langzaam gebeuren, met zorg geen te zware druk te introduceren in de WB-apparaat.

In de toekomst kan ons apparaat gebruiken om verstoringen in neutrofiel functie brandwonden of trauma patiënten meten zonder de neutrofielen uit natieve serum van de patiënt, die waarschijnlijk een belangrijke rol in neutrofielen dysfunctie 17 speelt. Dit apparaat kan ook worden gebruikt in de toekomst potentiële pro-resolutie therapeutica screenen normale neutrofielen te herstellen bij deze patiënten. Tenslotte kan de inrichting verder worden gemanipuleerd chemotaxis meten van andere migrerende cellen zoals monocyten, macrofagen en T-cellen.

Tot slot hebben we een nove ontwikkeldl meetmethode voor neutrofiel chemotaxis direct van een druppel bloed. De opname van het volbloed microfluïdische inrichting een 12 of 24-well plaat vergemakkelijkt het screenen van meerdere voorwaarden tegelijk. Deze inrichting zal de ontwikkeling van ontstekingsmediatoren resolutie te branden en andere inflammatoire aandoeningen vergemakkelijken. In de toekomst zal dit apparaat worden gebruikt om verstoringen te meten in neutrofielen chemotaxis functie na verloop van tijd in monsters van patiënten en muismodellen waar monster volume beperkt is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Er zijn geen belangenconflicten bekend te maken.

Acknowledgements

Steun van de National Institutes of Health (verleent GM092804, DE019938) en Shriners Burns Hospital.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Device Fabrication
SU-8 Microchem Y131273
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives Sylgard 184 1.1 lb. Kit
Standard glass slides Fisher Scientific 125495 1 X 3 inches
Glass-bottom plate MatTek P12G-1.5-14-F
Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0 mm Ted Pella, Inc. 15081
Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm Ted Pella, Inc. 15072
Microfluidic Assay Preparation and Analysis
Gel-loading pipet tip Fisher Scientific 02-707-139
Syringe Fisher Scientfic 309602
Blunt tip needle, 30 G ½ in. Brico Medical Supply BN3005
Vacutainer, Heparin Becton Dickinson
HBSS Sigma-Aldrich
Human serum albumin Sigma-Aldrich A5843-5G 0.2% final concentration in HBSS
Fibronectin Sigma-Aldrich F0895-1MG
fMLP Sigma-Aldrich F3506-10MG
SurgiLance safety lancet, 2.2-mm depth, 22 G SLN240
Hoescht stain Life Technologies H3570
Positive Control
HetaSep STEMCELL Technologies Inc. 7906
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies Inc. 19257
Plasma Asher March Instruments P-250
Lindberg/Blue M Oven Thermo Scientific 13-258-30C
Stainless Steel Precision Tweezers Techni Tool 758TW458
Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator Fisher Scientific 08-594-15A
Dataplate Digital Hot Plate Alpha Multiservices PMC 720
Nikon TiE inverted microscope Nikon - Micro Video Instruments Inc. MEA53100
CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objective Nikon - Micro Video Instruments Inc. MRH20101
Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon Nikon - Micro Video Instruments Inc. 500-L200NI2
DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32-mm Exciters - 25-mm Emitters Chroma - Micro Video Instruments Inc. 31013v2
Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1,600 x 1,200 pixels Qimaging - Micro Video Instruments Inc. RET-2000R-F-M-12-C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hansson, G. K., Robertson, A. K., Soderberg-Naucler, C. Inflammation and atherosclerosis. Annual review of pathology. 1, 297-329 (2006).
  2. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature medicine. 17, 1381-1390 (2011).
  3. Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS one. 5, (2010).
  4. Lavrentieva, A., et al. Inflammatory markers in patients with severe burn injury. What is the best indicator of sepsis. Burns : journal of the International Society for Burn Injuries. 33, 189-194 (2007).
  5. De Filippo, K., et al. Mast cell and macrophage chemokines CXCL1/CXCL2 control the early stage of neutrophil recruitment during tissue inflammation. Blood. 121, 4930-4937 (2013).
  6. Mankovich, A. R., Lee, C. Y., Heinrich, V. Differential effects of serum heat treatment on chemotaxis and phagocytosis by human neutrophils. PloS one. 8, (2013).
  7. Palabrica, T., et al. Leukocyte accumulation promoting fibrin deposition is mediated in vivo by P-selectin on adherent platelets. Nature. 359, 848-851 (1992).
  8. Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120, (2012).
  9. Jones, C. N., et al. Microfluidic chambers for monitoring leukocyte trafficking and humanized nano-proresolving medicines interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20560-20565 (2012).
  10. Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 412, 15-20 (2007).
  11. Lyons, P. A., et al. Microarray analysis of human leucocyte subsets: the advantages of positive selection and rapid purification. BMC genomics. 8, (2007).
  12. Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PloS one. 6, (2011).
  13. Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab on a chip. 8, 2054-2061 (2008).
  14. Hoang, A. N., et al. Measuring neutrophil speed and directionality during chemotaxis, directly from a droplet of whole blood. Technology. 0, 1-9 (2013).
  15. Kurihara, T., et al. Resolvin D2 restores neutrophil directionality and improves survival after burns. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. (2013).
  16. Buffone, V., Meakins, J. L., Christou, N. V. Neutrophil function in surgical patients. Relationship to adequate bacterial defenses. Arch Surg. 119, 39-43 (1984).
  17. Malawista, S. E., de Boisfleury Chevance, A., van Damme, J., Serhan, C. N. Tonic inhibition of chemotaxis in human plasma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 17949-17954 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics