Author Produced

En prisvärd HIV-1 Drug Resistance Monitoring Metod för Resurs Limited inställningar

Medicine
 

Summary

Motstånd Drogtester för HIV-1 infekterade individer misslyckas antiretroviral terapi (ART) kan vägleda framtida terapier och förbättra behandlingsutfallet. Optimera individuella och befolkningshälsoresultat i hög hiv-prevalens men resursfattiga områden i slutändan kommer att kräva överkomliga och tillgängliga läkemedelsresistens genotypning och metoder för tolkning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Manasa, J., Danaviah, S., Pillay, S., Padayachee, P., Mthiyane, H., Mkhize, C., Lessells, R. J., Seebregts, C., de Wit, T. F., Viljoen, J., Katzenstein, D., De Oliveira, T. An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings. J. Vis. Exp. (85), e51242, doi:10.3791/51242 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

HIV-1 resistens har potential att allvarligt äventyra effektiviteten och effekten av antiretroviral terapi (ART). Som ART-program i Afrika söder om Sahara fortsätter att expandera, bör individer på ART övervakas noga för uppkomsten av läkemedelsresistens. Övervakning av de överförda läkemedelsresistens för att spåra överföringen av virala stammar som redan är resistenta mot ART är också kritisk. Tyvärr är drogresistensbestämning fortfarande inte lätt tillgängliga i resurs begränsade inställningar, eftersom genotypning är dyr och kräver avancerad laboratorie-och datahantering infrastruktur. En öppen tillgång genotypisk läkemedelsresistens övervakningsmetod för att hantera individer och bedöma överföras resistens beskrivs. Metoden använder fri programvara med öppen källkod för tolkning av drogresistensmönster och generering av enstaka patientrapporter. The genotyping protokollet har en förstärkningshastighet som överstiger 95% för plasmaprover med AViral belastning> 1000 HIV-1 RNA kopior / ml. Känsligheten minskar avsevärt för virusnivåer <1,000 HIV-1 RNA kopior / ml. Den metod som beskrivs här validerades mot en metod för HIV-1 resistens provning godkänt av den amerikanska myndigheten Food and Drug Administration (FDA), den Viroseq genotypning metoden. Begränsningar av den metod som beskrivs här hör att det inte är automatiserad och att det inte heller förstärka cirkulerande rekombinanta formen CRF02_AG från en valideringspanel av prover, även om den förstärkta subtyper A och B från samma panel.

Introduction

Hiv-epidemin i södra Afrika har snabbt 1 utvecklas med en samtidig exponentiell ökning av individer på antiretroviral behandling (ART), särskilt i Sydafrika 2, 3. Som bevis på den epidemiologiska effekterna av storskaliga behandlingsprogram för att minska förekomsten 4 och ökad förväntad livslängd i resursfattiga områden (RLS) 5 fortsätter att ackumuleras, kommer insatser för att öka ART täckning intensifieras. Utvecklingen av riktlinjer mot användningen av behandling som ett förebyggande verktyg 6, 7 under testet och behandla program innebär att det absoluta antalet individer på behandling kommer att öka ytterligare. Ett stort antal personer kommer att vara på ART för längre perioder som den genomsnittliga livslängden för individer på ART närmar sig den för HIV oinfekterade befolkningen 8. Utveckling och överföring av HIV resistens har Always ansetts vara ett hot mot resultaten av ART 9-12. Det finns således ett behov av mer rigorös kontroll och övervakning av läkemedelsresistens som fler individer initieras på ART.

Genotypisk resistens testar (BRT) har använts med framgång i utvecklade länder, både för övervakning och uppföljning av HIV-1 resistens hos personer som får ART. I dessa inställningar har BRT integrerats i vårdkedjan för HIV-1-infekterade individer. De flesta internationella riktlinjer rekommenderar BRT för vuxen eller barn misslyckas ART (första linjens och andra linjens) 13-15, barn som utsätts för förebyggande av mor-till barn (PMTCT) regimer men därefter smittade 16, och i miljöer med höga halter av överförd resistens hos akut infekterade individer 13-15. Däremot har kostnads, teknik och infrastruktur krav begränsat genomföranförandet av liknande metoder för läkemedelsresistens övervakning i RLS.

Den sydafrikanska HIV-behandling och övervakningsriktlinjer för närvarande inte rekommendera användning av BRT i att vägleda val av ART för individer misslyckas första linjens regimer 17. Individer kopplas främst baserad på virologiska (HIV-1-RNA virusmängd) parametrar. Men under 2012, Södra Afrikas HIV Clinicians Society publicerade de första sydliga riktlinjer Afrikanska ARV resistens testning 18. Riktlinjerna rekommenderar GRT testning för alla vuxna missar första linjens och andra linjens ART och för infekterade spädbarn och barn som utsätts för PMTCT 18. Dock är BRT rekommenderas inte 18 för akut infekterade individer eftersom det inte finns några aktuella bevis för höga nivåer av överförd resistens i södra Afrika 19-29. Det förväntas att en del av dessa rekommendationer kommer att integreras med tiden i den nationella Treatment och övervaknings riktlinjer i de olika länderna i regionen. Redan på 2013 sydafrikanska behandlingsriktlinjer finns det nu rekommendation av BRT vid andra linjens misslyckande för vuxna och vid första eller andra linjens PI-baserad behandling misslyckande för barn 30.

Det har visat sig att införliva BRT i behandlingsriktlinjer i Sydafrika skulle vara potentiellt kostnadsneutralt. Med tanke på kostnaden för den andra linjens behandling läkemedel som är relativt dyrare än första linjens läkemedel, med hjälp av BRT för att identifiera patienter som verkligen behöver byta till andra linjens behandling kommer inte att leda någon extra kostnad för programmet. Dessutom kan BRT också identifiera andra orsaker till misslyckanden, spara behandlingsalternativ och generera information om nya resistensmönster 31. Därför är det nödvändigt att minska kostnaderna för läkemedelsresistens övervakningsmetoder ytterligare i syfte att förbättra tillgängligheten, kvaliteten på vården end utfall.

Här presenterar vi ett BRT metod som syftar till att använda generiska (öppen källkod) primer för omvänd transkription, polymeraskedjereaktion (PCR) och sekvensering (tabell 1), samt mestadels öppen källkod för drogmotstånd tolkning. För klinisk behandling, är det protokoll som kompletteras av en omfattande översyn och rapporteringsmetod med specialist tolkning av laboratorie resistens rapport med nära anslutning till de nationella behandlingsriktlinjer. Protokollet är indelat i fyra olika delar, 1) HIV ribonukleinsyra (RNA) Utvinning, 2) Omvänd transkription och Polymerase Chain Reaction (PCR) av virala mål, 3) Sekvense och 4) bioinformatiska metoder för analys av kromatogram, anpassning, säkring och tolkning av sekvensdata.

Protocol

1. Etylendiamintetraättiksyra (EDTA) för bearbetning av helblod

OBS: Blod kan behandlas omedelbart efter samlingen av kan lagras vid 4 ° C i högst 24 timmar.

  1. Att arbeta i en biosäkerhet skåp, låta hela provet EDTA-blod för att nå rumstemperatur.
  2. För varje prov, märka tillräckligt cryovials med providentifiering (ID), förvaringsmaterial (plasma), och datum.
  3. Centrifugera prover för 10 min vid 1000 x g.. Använd inte bromsar för att stoppa centrifugen. Detta kommer att ge tre lager (uppifrån och ner): plasma, leukocyter (buffy coat) - ett mycket tunt lager - och erytrocyter, inklusive trombocyter.
  4. Försiktigt aspirera supernatanten (plasma) och delprov 500 ml i varje cryovial. Se till att inte störa cellager (buffy coat) eller överföra alla celler.
  5. Förvara vid -80 ° C tills det behövs för RNA-extraktion eller gå vidare till RNA-extraktion omedelbart.
ve_title "> 2. RNA-extraktion

  1. Förbered en extraktion kalkylblad med ID för de prover som skall extraherade inklusive positiva och negativa kontroller plasma.
  2. För varje prov som skall extraheras, märka en 1,5 ml sterilt mikrocentrifugrör med provet ID, extraktion datum och "RNA". Också märka en sammansatt kolonn och provröret samt en 2 ml mikrocentrifugrör innehåller arbets lys lösning med motsvarande siffror från utvinning kalkylblad.
  3. Att arbeta i biosäkerhet skåp, tillsätt 200 l prov till motsvarande 2 ml mikrocentrifugrör arbetssätt lys lösning.
  4. Vortex brunn och inkubera under 10 min vid rumstemperatur.
  5. Efter 10 min, centrifugera röret en kort stund.
  6. Addera 800 ml absolut etanol för att vart och ett av rören.
  7. Blanda med puls vortexa och kort centrifug.
  8. Överför 600 | il av denna lösning till motsvarande kolumn / samlingsrörenheten. Centrifugera vid 6000 xg under 1 min.
  9. Överför kolumn till en ny uppsamlingsröret och kasta den gamla samlingen röret med filtratet. Upprepa ovanstående steg 2.8 (ovan) två gånger.
  10. Addera 500 pl tvättbuffert AW1 till varje kolonn och centrifugera vid 6000 xg under 1 min.
  11. Kasta filtratet och uppsamlingsröret och överför kolumn i ett annat provrör.
  12. Addera 500 pl var buffert AW2 och centrifugera vid 20000 xg under 3 min. Upprepa steg 2.11.
  13. Centrifugera i en ny kollektion röret vid 20000 x g under ytterligare 2 min.
  14. Kasta filtrat och plats kolumn i 1,5 ml mikrocentrifugrör.
  15. Addera 60 pl buffert AVE (RNas-fritt vatten) till mitten av kolonnen säkerställer att man inte dispensera vätska på sidan av kolonnen.
  16. Inkubera vid rumstemperatur under 1 min.
  17. Centrifugera vid 6000 x g under 2 min.
  18. Kasta kolumnen och mössa 1,5 ml mikrorör.
  19. Proverna är nu klara för reverse transkription.
  20. Om provning skall utföras omedelbart, förvara vid 4 ° C i upp till 6 timmar. Men om testning är att försenas sedan placera vid -80 ° C omedelbart. OBS: inte frysa / tina proverna mer än 3x.

3. Reagens Förberedelse för omvänd transkription

  1. Före start, beräkna volymer av var och en av de reagens som behövs för det antal prover som bearbetas, inklusive, de positiva och negativa kontroller i plasma. Lägg även till en reagenskontroll.
  2. Med hjälp av de beräknade volymer från steg 3.1 (ovan), förbereda deoxiribonukleotid trifosfat (dNTP)-primer mix i en ren, steril 200 l PCR-rör följt av en kort puls vortex. Varje prov bör ha 0,5 pl av den omvända primern RT21 och 0,5 pl av dNTP, se tabell 2.
  3. Alikvotera 1,0 pl av dNTP-primer mix till 200 ^ PCR-rör.
  4. Förbered omvänt transkriptas (RT)-enzymblandning genom tillsats av en μ, L av 10x omvänd transkription buffert, 1 l av 0,1 M DTT och 2 pl av 25 mM MgCl2 till ett sterilt rör följt av skakning och kort centrifugering, se tabell 3.
  5. Lägg till 0,5 l vardera av enzymerna RNAseOUT och Upphöjd III omvänt transkriptas till enzymblandning röret därefter på röret försiktigt för att blanda.
  6. Förvara rören med dNTP-primer blandar och enzymblandning på en kalla blocket och flytta till RNA stationen.

4. Omvänd transkription

  1. Lägg till 6 l av RNA-provet till dNTP-primer mix röret följt av en kort vortex-blandning.
  2. Efter tillsats av RNA, flyttar till det PCR-rum med både dNTP / primer / RNA-blandning och RT Enzyme mix rören på ett kallt block eller is.
  3. Centrifugera kort de dNTP / primer / RNA-mix rören (från steg 4.2) och placera dem i en termocykler.
  4. Värm vid 65 ° C under 5 min för att denaturera RNA.
  5. Snabbt kyl till 4 ° C, håll inne i 2min.
  6. Paus termocykler medan fortfarande vid 4 ° C; ta ut rören.
  7. Snabbt lägga till 5 l av enzymblandning samtidigt som rören på en kall kvarter.
  8. Blanda försiktigt genom att knacka på röret centrifugera sedan kort rören och återgå till termocykler.
  9. Håll rören vid 50 ° C under 60 min för att omvänt transkribera RNA följt av enzymdenaturering vid 85 ° C under 5 min för att stoppa den omvända transkriptionen.
  10. Kyl till 37 ° C. Så fort temperaturen når 37 ° C, pausa och ta röret ur termocykler.
  11. Snabbt lägga till 0.5 l av RNAse H till rören och återgå till termocykler.
  12. Håll vid 37 ° C under 20 minuter och kyl sedan till 4 ° C.
  13. Den komplementära DNA (cDNA) kan användas omedelbart eller kan lagras vid -20 ° C eller kallare tills de behövdes. Emellertid bör långtidslagring av cDNA vara vid -80 ° C.

5. Beredning av reagens för PCR

  1. Before start, beräkna volymer av varje reagens som krävs för antalet prover som bearbetas och kontrollerna. Förutom de tre kontroller (positiva, negativa, och reagens), kan du också lägga till en PCR-kontroll (HIV-DNA). De första och andra omgången PCR-blandningar kan framställas samtidigt och den andra huvudblandning lagrades vid -20 ° C tills de behövdes. Blandningar kan lagras under cirka 8 timmar.
  2. Lägg 18,4 | il vatten, 2,5 | il 10 x buffert, 1,0 ^ il MgCl2, 0,5 ul dNTP och 0,25 | al av vardera av de primrar som visas i tabell 4 och skaka.
  3. Lägg till 0.1 l av Platinum Taq-polymeras (5U/μl) och blanda försiktigt röret genom att trycka på den.
  4. Alikvotera 23 pl av Master Mix till 200 ul PCR-rör.
  5. Med Master Mix rören på en kall block eller is flytta till PCR-rummet.

6. Innesluten PCR

  1. Lägg 2 ul av cDNA till 23 pl av 1: a omgången PCR master blanda.
  2. Stäng tuberna, placera proverna i termocykler och använda följande PCR-cykelbetingelser: 94 ° C under 2 min, 30 cykler av 95 ° C under 30 sek, 58 ° C under 20 sekunder och 72 ° C under 2 min, följt av en slutlig extention vid 72 ° C under 10 min, såsom visas på fig. 1.

Figur 1
Figur 1. Bygga bo PCR cykelförhållanden. Klicka här för att visa en större bild.

  1. Fortsätt till den 2: a omgången PCR-steget eller förvara den 1: a omgången PCR-produkter vid -20 ° C eller kallare tills de behövs i ett senare skede.
  2. För 2: a omgången PCR, tillsätt 2 pl i 1: a omgången PCR-produkt till 23 l av den 2: a omgången PCR Master Mix ettd använda samma PCR-programmet på figur 1.

7. Gelelektrofores

  1. Gelpreparat
    1. Lägg till en 0,5 g agaros tablett till en 250 ml glaskolv och tillsätt 50 ml 1x TBE-buffert till kolven.
    2. Värm i mikrovågsugn till kokning, virvla ofta (ungefär var 30 sek) tills den är helt upplöst. Använd en silikongrepp eller silikon grytvante att förstå den varma kolven. Den agaroslösning kan koka ur kolven väldigt lätt så noga övervaka denna process.
    3. Kyl vid rumstemperatur under cirka 10 min.
    4. Häll agaros i en gelgjutning fack som innehåller lämplig storlek kam, gel är klar att använda i ca 20-30 min.
    5. Placera gelen i elektrofores kammare och köra som rekommenderas av tillverkaren.
  2. Gelelektrofores och visualisering.
    1. Vortex Novel Juice för 10 sek före användning.
    2. Späd 1 l av Novel Juice med 5 ^ DNA prov och blanda.
    3. Späd 3 l av Novel Juice med 3 l av molekylviktsmarkör och blanda.
    4. Ladda blandningarna från avsnitten 7.2.2 och 7.2.3 (ovan) och köra gelen vid 100 V och 400 mA i 40 minuter för att utvärdera PCR-förstärkning.
    5. Positiv amplifiering kan visualiseras under UV-ljus såsom 1315 bp-fragment, Figur 2.

    Figur 2
    Figur 2. Gel bekräftelse av PCR-amplifiering med hjälp av 1% agarosgel och en 200 bp stege. Klicka här för att visa en större bild.

    1. Det bör inte finnas någon förstärkning i de negativa och reagenskontroller, vilket indikerar frånvaron av kontamination.

    8. PCR-produkten Cleanup

    1. Som förberedelse för sekvenseringsreaktionen, är de positiva andra omgången PCR-produkter saneras med hjälp av Purelink PCR-rening kit.
    2. Lägg till 80 l av arbets Bindning buffert Hög-Cutoff (B3) till 20 l av PCR-produkt och pipett mixen.
    3. Lägg provet blandas med bindningsbufferten till en spinnkolonn i ett uppsamlingsrör.
    4. Centrifugera kolonnen vid 10.000 xg under 1 min. Överför kolumn till en ny kollektion tub.
    5. Tvätta kolonnen med 650 ul av tvättbuffert med etanol.
    6. Centrifugera kolonnen vid 10.000 xg under 1 min. Överför kolumn till en ny kollektion tub.
    7. Centrifugera kolonnen vid maximal hastighet under 2 till 3 minuter för att avlägsna eventuell kvarvarande tvättbuffert.
    8. Placera snurra kolumn i ett rent 1,7 ml eluering rör medföljer satsen.
    9. Tillsätt 40 ^ il elueringsbuffert till mitten av kolonnen och inkubera kolonnen vid rums temperature 1 min.
    10. Centrifugera kolonnen vid maximal hastighet under 2 min (> 10000 xg).
    11. Elueringen röret innehåller din renade PCR-produkten klar för sekvensering. Kassera kolonnen.
    12. Provets koncentration och kvalitet av DNA med hjälp av en Nanodrop.
    13. Om inga egna sekvense faciliteter är tillgängliga, kan de renade PCR-produkterna skickas till en kommersiell sekvense labb i detta skede.

    9. Sekvenseringsreaktioner

    1. PCR-produktema sekvenseras genom att använda den stora färgämnesterminator sats version 3,1 och 4 primrar för varje prov (två främre och två back). Primersekvensema visas i tabell 2. Därför, efter sekvense sikt kommer varje prov har fyra sekvenser som skall monteras in i en contig.
    2. Sätt upp de sekvenseringsreaktioner som anges i Tabell 5 för var och en av de fyra primrarna.
    3. Blanda sekvense buffert och primers genom virvling före användning.
    4. Blandavatten, buffert och primer före tillsatsen av den stora färgämnessekvensering. Blanda genom att vortexa.
    5. Blanda försiktigt mastermixen efter att ha lagt den stora färgen sekvense blanda genom att vända röret eller knacka den försiktigt.
    6. Alikvot 9 | il av huvudblandning i en 96-brunnars optiska plattan.
    7. För att kunna köra 24 prov / platta, ställa in plattan enligt nedan figur 3.

    Figur 3
    Figur 3. Schema representation av en 96-brunnar med 12 patientprover som sekvens med 4 primers vardera (RTC1F, RTC2R, RTC3F och RTC4R). Klicka här för att visa en större bild.

    1. Lägg till 1.0 l av DNA-provet (~ 20-40 ng), täcka plattan med enn lim aluminiumhölje och sedan försiktigt blanda det.
    2. Centrifugera vid 3000 x g under 1 min. Ta av aluminiumlocket och lägg en gummitätning matta.
    3. Placera plattan på termocykler och kör följande cykelprogram som visas i figur 4.

    Figur 4
    Figur 4. PCR cykling villkor för sekvensering. Klicka här för att visa en större bild.

    1. När PCR klar, rensa upp i sekvense produkten omedelbart.

    10. Sekvense Cleanup

    1. För varje sekvenseringsreaktion, blanda 50 | il absolut etanol och 5 | il 3 M natriumacetat.
    2. Med hjälp av en flerkanalig pipett 55 &# 956, l av natriumacetat / EtOH-lösning till varje brunn.
    3. Täta brunnar med självhäftande aluminium lock, se till att varje brunn tätas ordentligt.
    4. Centrifugera vid 3000 x g under 20 min.
    5. Efter 20 minuter, ta av locket och vänd plattan, i en mjuk rörelse, till en vikt labb vävnad (INTE bang för att bli av med överstående eftersom detta kommer att rubba pelleten!).
    6. Centrifugera den inverterade plattan på samma vävnad vid 150 x g under 2 min.
    7. Tillsätt omedelbart 150 | il kall 70% EtOH. Dröj inte tillsats av etanol i detta steg.
    8. Täta med samma lim aluminium lock och skaka.
    9. Centrifugera vid 3000 x g under 5 min.
    10. Vänd plattan på ett annat vikta servetten och centrifugera inverteras vid 150 xg under 1 min.
    11. Efter centrifugering, placera avslöjats i termocykler och torka vid 50 ° C i 2 min.
    12. När plattorna är torr, försegla den med självhäftande folie omslag, linda in i folie och förvara vid -20 ˚ C tills den ska gå vidare with sekvense elektrofores.
    13. När redo att sekvens, upplösa rengjorda sekvenseringsprodukter i 10 ml Hi-Di formamid, denaturera och belastning för elektrofores.

    11. Bioinformatics

    1. Sekvens Assembly
      1. Starta programmet Geneious.
      2. Skapa en arbetsmapp för att lagra sekvenserna.
      3. Importera ABI-filer som genereras av sekvenseringsmaskinen till arbetsmappen använda importverktyget. Geneious kommer att fördela procentkvalitetsresultatet för varje sekvens importeras.
      4. Öppna sekvenser med kvalitetsresultat> 70% genom att dubbelklicka på dem.
      5. Varje fil ska öppnas i ett nytt fönster. Programvaran kommer att indikera kvaliteten vid varje nukleotidposition i kromatogrammet av sekvenskvalitet med ljusblå barer. Ju högre stapel, desto bättre kvalitet på grund samtalet.
      6. Med användning av markören för att välja mittsektionen av den sekvens som lämnar ut i ändarna, som vanligtvis är av dålig kvalitet. Klicka på utdraget för att extrahera regionen med god kvalitet sekvens.
      7. Välj alla fyra extraherade sekvenserna för varje prov och sätta ihop dem mot en referenssekvens.
      8. Inspektera sammansatta sekvensen för att säkerställa att du är i rätt läsram. Om du är i rätt läsram, bör i början av Proteas börjar med följande aminosyror: PQITLW. I början av RT börjar med PISPIE.
      9. Utdrag contig regionen som täcker början av PR till den 300: e RT kodon. Under denna process, även kontrollera för infogningar eller strykningar.
      10. Gå igenom konsensussekvensen av den extraherade contig, identifiera eventuella oklarheter och kontrollera positioner med blandade baser genom att inspektera kvaliteten (symmetri, höjd, bakgrund och axlar av flankerande regioner) av basen samtal.
      11. Markera konsensussekvensen och klicka extraktet knappen för att skapa en separat fil för konsensussekvensen från de fyra grundfärger och Label det på lämpligt sätt.
      12. Exportera sekvensen till en backup lagring mapp på datorn eller en nätverksmapp.
    2. Sekvens för kvalitetsbedömning (HIVDB)
      1. Analysera sekvensen med hjälp av HIVDB programmet vid http://hivdb.stanford.edu .
      2. Kontrollera om strykningar och tillägg i de sammanfattande uppgifterna och se till att sekvensen omfattar alla de 99 proteas (PR) kodon och den 1: a 300 RT kodon.
      3. Kontrollera om det finns någon markerad kvalitetssäkring (QA) frågor i både PR och RT regioner såsom stoppkodoner, ram skift, tvetydiga positioner och ovanliga rester.
    3. Sekvense Kvalitetskontroll
      1. Spräng den nya sekvensen mot en lokal sekvens databas från tidigare körning.
      2. Om den nya sekvensen är> 97% liknar någon sekvens i databasen bör alla skeden av protokollet ses över, med början med sekvensanalys och gå tillbaka till den RNA-extraktion för att säkere att det inte fanns några mix ups (prov växling, mislabeling) eller kontaminering.
      3. Om inga problem identifieras, upprepa analysen av både gamla och nya prover från RNA-extraktion stadiet.
      4. Om sekvenserna fortfarande är> 97% liknande, se över patientens historia för att bedöma om någon epidemiologisk koppling mellan individerna.
    4. Fylogenetisk analys
      1. Rikta alla sekvenser från databasen med ClustalW program Geneious.
      2. Kontrollera manuellt justering för feljusterade sekvenser, borttagningar och infogningar och redigera därefter.
      3. Konstruera ett fylogenetiskt träd med hjälp PHYML, Geneious träd byggare eller andra trädbyggare i Geneious.
      4. Undersök trädet för prov med kort grenlängder.
      5. Granska prover med korta grenlängder för eventuella föroreningar.

    12. REGA DB informatik

    1. Sekvens Ladda
      1. Logga in på RegaDB med användning av ett unikt användarnamn och lösenord.
      2. På rullgardinsmenyn under patient-ID, välj "Börjar med".
      3. Lägg patient-ID och välj den person vars genotyp är att laddas upp.
      4. På menyn till vänster, välj "virusisolat".
      5. Från alternativen under virusisolat välj "lägg till".
      6. Ange provdatum, prov-ID, Sekvens-ID och Sekvens datum.
      7. Välj "välj fil" och sedan navigera till den FASTA filen i sekvensen som ska laddas upp.
      8. När du valt FASTA fil som ska laddas upp, klicka på ladda upp.
      9. När uppladdade sekvensen visas i nukleotid rutan under sekvens identifierar och datum genom att klicka på OK-knappen längst ned till höger i fönstret.
      10. Kontrollera om PR och RT protein anpassning genom att klicka på knappen protein och välja antingen PR eller RT.
      11. Kontrollera för drogen resistensmutationen genom att klicka på det motstånd knappen. Detta gerdu motstånds profiler från tre algoritmer: ANRS, Stanford HIVDB och RegaDB.
    2. Rapportgenerering med REGA
      1. Logga in på RegaDB med ditt unika användarnamn och lösenord.
      2. På rullgardinsmenyn under patient-ID, välj "Börjar med".
      3. Lägg patient-ID och välj den person vars rapporten ska genereras.
      4. På menyn till höger väljer du virusisolat.
      5. Från alternativen under virusisolat klicka på "Visa".
      6. Dubbelklicka på den virala isolat som du vill skapa en rapport.
      7. På den virala isolat fönstret klickar du på den virala fliken isolat rapport.
      8. Välj de algoritmer för tolkning av genotyp från rullgardinsmenyn och välj sedan rapportmall att använda.
      9. När algoritmen och mallen är markerad klickar du på knappen "skapa".
      10. Hämta rtf-dokument genereras.
      11. Öppna rtf göracument som ett word-dokument.
      12. Ändra storlek på behandlingshistorik diagrammet.
      13. Efter diagrammet, lägger avsnittet "Klinisk diagram och motstånd tolkning".
      14. Med hjälp av data på motstånd bordet och den kliniska diagram, lägga till en beskrivning av patientens motstånd profil börjar med patientens anamnes och läkemedlen med vilka viralt isolat är resistenta. Också lägga till en beskrivning av patientens virusmängd och CD4 + celler profiler från diagrammet.
      15. Skicka rapporten till Smittskydds (ID) specialist för översyn och rekommendationer om framtida tålmodig ledning. Processen är också en mycket viktig kvalitetssäkring skede. Eventuella fel i genotyp eller inconsistences i behandlingshistoria, kan virologiska och immunologiska profiler identifieras och granskas innan en slutrapport skickas, med alla rekommendationer, för klinikern hantera patienten.

Representative Results

Den validerade metoden var en modifiering av en tidigare rapporterad metod 20. Den Viroseq genotypning metod, som har godkänts av FDA, användes som referensmetod i valideringen. En panel av kvalifikationsprövning prover från de franska nationella kontoren för forskning om aids och viral hepatit (ANRS) användes i den primära jämförelsen mellan de två metoderna. De två genotypning metoder var 100% samstämmiga i att identifiera alla kliniskt viktiga läkemedelsresistensassocierade mutationer som tolkas av HIVDB program för proverna som framgångsrikt förstärks av båda metoderna. Såsom visas i tabell 6, nukleotid-sekvenserna för de tre paren var 99,5% identiska. De förutsagda aminosyrasekvenserna var 100% identisk. Ett urval av fem kunde inte med framgång förstärks av Viroseq. Förutom provet inte amplifieras genom Viroseq underlät intern metod för att amplifiera ett andra prov som visadesvara en cirkulerande rekombinanta viruset (CRF02_AG) genom Viroseq. De tre prov som förstärkta med båda metoderna var subtyp B (två prov) och subtyp A (ett prov).

Figur 5
Figur 5. Användning av en HKY granne Sammanfogning träd göras som en del av sekvens kvalitetssäkring. Det finns fyra par / grupper av sekvens med mycket korta genetiska avstånden. Den genetiska avståndet mellan RES655 och RES655_1 (samma prover sekvens på olika dagar) är 0,003. Det är ett potentiellt fel med RES637_1/RES638 paret som deras genetiska avståndet är för kort (0,075) för prover från olika epidemiologiskt olänkade individer. Det finns en annan RES637 på trädet med ett avstånd på 0,075 vid jämförelse med RES638_1. Den CQ01/CQ02 kluster tyder på att de två provernafrån panelen är dubbletter av samma prov. De kluster tillsammans med subtyp B referenssekvensen bekräftar subtyp tilldelats av REGA Subtyp verktyget. CQ05 och CQ04 klustrade med subtyper A och G respektive, medan REGA subtypverktyget klassificerat dem som A och CRF02_AG respektive. Ett annat användbart verktyg för HIV subtyping och rekombination är SCUEL, som finns tillgänglig på http://www.datamonkey.org. Klicka här för att visa en större bild.

En panel av fem prover användes för att fastställa precisionen hos den interna metoden. Tio upprepade genotyper genererades för vardera av de fem proverna. Med hjälp av 16 Kapillär 3130xl genetisk analysator, 48 av de 50 genotyper genererades från 24 körningar, beredd på samma dag. För alla fem proverna, de förutsagda aminosyrasekvenserna var 100% överensstämmande bland replikat. För nukleinsyrasekvenser, there var> 99% parvisa likhet.

Under de två första åren av användning av denna metod, har sextio prover upprepas slumpmässigt från RNA-extraktion till sekvensering. Det fanns inga statistiskt signifikanta skillnader mellan sekvensen kvalitetsresultat och antalet blandade baser mellan replikaten. Både nukleotid-och aminosyra parvisa jämförelser för de sextio paren var större än 99% identiska. Således drog resistensmutationer för alla par var 100% samstämmiga.

Kostnadsminskning

De reaktionsvolymer för RT-PCR och sekvensering har reducerats med åtminstone hälften, jämfört med den ursprungliga metoden 20, 32, utan att kompromissa med kvaliteten på de sekvenser som genereras. Detta möjliggjorde en minskning av kostnaden för 50% för RT-och PCR-stegen.

Den nya metoden var ursprungligen utformad för att fungera med sex sekvenseringsprimer till sekvens alla 99 kodonen av proteasgenen och de första 300 kodonen av omvänt transkriptas-genen 20, 32. Liknande metoder använder också sex till åtta primers 33, 34. Några nyligen publicerade metoder har använt mindre än sex grundfärger, även om det ibland sekvensering av proteas-och RT-gener seprately 35, 36. Vi sökte att minska antalet sekvenseringsprimrar från sex till fyra, (figur 6)

Figur 6
Figur 6. Jämförelse av kontinuerliga sekvenser från sex vs fyra sekvenseringsprimrar för generering av det 1197 bp stora pol-sekvens som omfattar alla 99 HIV-1-proteas-kodon och de första 300 kodonen av omvänt transkriptas-genen.242/51242fig6highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.

Sekvenser från en uppsättning av 17 prover genererade från sex primrar jämfördes med sekvenserna som genereras efter uteslutning av två primers (MAW46 och if). De subtyper var 14 undertyp C, två subtyp B, och en subtyp A. Det fanns inga signifikanta skillnader i sekvens kvalitetsresultat. Återigen, den genomsnittliga parvisa identiteten mellan de 17 paren av nukleinsyra var 99% respektive 100% på aminosyranivå. Sålunda minskar sekvenseringsprimrar från sex till fyra resulterade i en minskning av den sekvense kostnaden med nästan en tredjedel.

Den enda egenutvecklade programvara verktyg som används i detta protokoll var Geneious för sekvens montering. De läkemedelsresistens tolkningsverktyg, samt rapporten genererar verktyg är alla fria och öppna tillgång till verktyg. Detta minskar kostnaderna ytterligare genom eliminering av de kostnader som är förknippade med användningen av proprietär programvara. Vidare Kollektive förhandlingar tillät reagenserna för detta protokoll för att paketeras in i en sats för enkel åtkomst från Life Technologies och finns som Saturn / Life Technologies genotypning metod 37. Dessutom kan Saturnus medlemmar tillgång reagenserna till ett rabatterat pris.

Klinisk miljö

Den beskrivna protokollet har genomförts i kontroll och övervakning av läkemedelsresistens i en landsbygd i KwaZulu-Natal. Sammanlagt 604 genotyper genererades från kliniska prover mellan december 2010 och maj 2013 vid en förstärkning på 95% för prov med virusnivåer> 1,000 RNA kopior / ml. Denna kliniska HIV-drogmotstånd studien godkändes av biomedicinsk forskningsetiska kommittén vid University of KwaZulu-Natal (ref. BF052/10) och Kommittén för hälsoforskning i KwaZulu-Natal Department of Health (ref. HRKM 176/10). Genererades och skickades tillbaka till klinikerna Individuella patientrapporterför behandling av patienten.

Sjuttio två (72) genotyper också genereras som en del av en övervakning av överförd resistens studie, kapslade i en stor prospektiv populationsbaserad hiv-övervakning studie. Delprov var nålstick helblod i EDTA mikrorör. Vid genotypning fanns en förstärkningsnivå på 79% 19. Etiskt godkännande för genotypning av prover från övervaknings studien erhölls från University of KwaZulu-Natal biomedicinsk forskningsetiska kommittén (ref. BE066107).

Primer Namn Sekvens Längd Riktning HXB2 Position
MAW-26 TTGGAAATGTGGAAA GGAAGGAC 23 Framåt 2028-2050 1: a omgången PCR
RT-21 CTGTATTTCAGCTATC AAGTCCTTTGATGGG 31 Omvänd 3539-3509 1: a omgången PCR
Pro-1 TAGAGCCAACAGCCC CACCA 20 Framåt 2147-2166 2: a omgången PCR
RT-20 CTGCCAATTCTAATTC TGCTTC 22 Omvänd 3462-3441 2: a omgången PCR
RTC1F ACCTACACCTGTCAA CATAATTG 23 Framåt 2486-2508 Sekvensering
RTC2R TGTCAATGGCCATTG TTTAACCTTTGG 27 Omvänd 2630-2604 Sekvensering
RTC3F CACCAGGGATTAGAT ATCAATATAATGTGC 30 Framåt 2956-2994 Sekvensering
RTC4R CTAAATCAGATCCTAC ATACAAGTCATCC 29 Omvänd 3129-3101 Sekvensering
RT-y GTGTCTCATTGTTTAT ACTAGG 22 Omvänd 2967-2946 Sekvensering
MAW-46 TCCCTCAGATCACTC TTTGGCAACGAC 27 Framåt 2251-2277 Sekvensering

Tabell 1. Omvänd transkription, PCR och sekvense anpassade primrar som används vid genereringen av en 1197 bp-pol-fragmentet som täcker alla 99 HIV-1-proteas-kodon och de första 300 kodonen av den omvända trascriptase genen.

RT21 (5pmol/ml) 0,5 0,2
dNTP (10 mM) 0,5 0,4
Totalt 1

Tabell 2. dNTP / Primer mix för den omvända transkriptionsreaktionen.

Reagens Volym (ml) / reaktion Koncentration / reaktion
First Strand Buffer (10x) 1 1
MgCl2 (25 mM) 2 4
DTT (0,1 M) 1 0,008
RNaseOUT (40 U / ml) 0,5 16
Upphöjd III omvänt transkriptas (200U/ml) 0,5 8
Totalt 5

Tabell 3. Enzymblandning för den omvända transkriptionsreaktionen.

Reagens Volym (ml) / reaktion Slutlig koncentration / Reaktion
DEPC-behandlat vatten 18,4 - </ Td>
PCR-buffert (10x) 2,5 1
MgCl2 (50 mM) 1 2
dNTP-blandning (10 mM) 0,5 0,2
Överförts primer (5 pmol / ml) 0,25 0,05
Omvänd primer (5 pmol / ml) 0,25 0,05
Platinum Taq-polymeras (5 U / ml) 0,1 0,02
Delsumma 23 -

Tabell 4. Master Mix för kapslade PCR.

Reagens Volym (ml) / reaktion Koncentration / reaktion
DEPC-behandlat vatten 6,1
Sequencing Buffer (5x) 2 1
Primer (3,2 pmol / ml) 0,5 0,16
Big Dye terminatorsekvense mix 0,4 -
Totalt 9

Tabell 5. Master Mix för sekvenseringsreaktioner.

Viroseq Inhouse % NA Likhet
Prov-ID Subtype Kvalitetsresultat PR Mutationer RT-mutationer Subtype Kvalitetsresultat PR-mutationer RT Mutationer
CQ01 B 99,9 M46L, I54L, V82A, L90M D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q B 99,2 M46L, I54L, V82A, L90M D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q 100
CQ02 B 99,5 M46L, I54L, V82A, L90M D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q B 99,5 M46L, I54L, V82A, L90M D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q 100
CQ03 NA NA NA NA NA NA
CQ04 CRF02_AG 98,4 I54V, V82F, I84V M41L, L74I, L210W, T215Y, V108I, Y181C NA NA NA NA NA
CQ05 ETT 99,7 K103N ETT 93 K103N 100

Tabell 6. Jämförande Results från en parallell analys mellan Viroseq genotypning metod och den interna metoden med användning av en panel av prover som tillhandahålls av ANRS.

Discussion

Flera lågprisbolag interna metoder har beskrivits i arbetet med att försöka göra HIV-drogmotstånd genotypning billigare 33, 34, 36. Det råder ingen tvekan om behovet av att integrera resistens testning i vårdkedjan för individer på antiretroviral behandling i resursfattiga områden. Men de flesta av de rapporterade metoderna fokuserar på tillämpningen av läkemedelsresistens genotypning i övervakningen av läkemedelsresistens hos en befolkningsnivå. Saturn / Life Technologies genotypning metod är en helt integrerad protokoll för kontroll och övervakning av läkemedelsresistens. Denna metod var avsedd att vara ett prisvärt protokoll genomföra mestadels öppen källkod och öppna resurser åtkomst bioinformatik för tolkning av läkemedelsresistens och generering av rapporter för klinisk behandling.

Det visades genom jämförelse med FDA godkända Viroseq genotypning metod för att varakorrekt identifiera drogresistensmutationer från en panel av ANRS kvalifikationsprövning prover, i 100% av laboratoriepanelprover som framgångsrikt förstärks. Noggrannheten bedömdes också på kliniska prover av subtyp C-virus, den mest dominerande subtypen i södra Afrika. Metoden var så exakt på subtyp C-prov som det var på subtyp A och B. Men om metoden skulle kunna användas i andra delar av världen där CRF02_AG är utbredd, finns det ett behov av ändring av primers eftersom metoden misslyckades med att förstärka en av panelprover som visade sig ha CRF02_AG. Alternativt kan en degenererad uppsättning av primrar som är känsliga för alla grupp M virus 33, 36 skulle kunna användas i regioner där subtyp fördelningen är mer heterogen 38.

Känsligheten av omvänd transkription och PCR kan ökas genom att man extraherar RNA från större volymer av plasma, t.ex. 500 ml. Plasmat kan centrifuged vid 21.000 xg under 90 minuter för att koncentrera viruspartiklarna innan du fortsätter med det protokoll som beskrivs av QIAamp viralt RNA extraktion mini kit.

Såsom visas har det nya förfarandet en ytterligare fördel att den producerar omfattande rapporter för individuell behandling av patienten. Dessa rapporter är en konsolidering av genotyp, immunologiska och virologiska övervakningsuppgifter samt klinisk och behandlingshistorik från RegaDB. Detta åtföljs av en detaljerad laboratorie tolkning av resistensprofil följt av en lika detaljerad genomgång av patientens kliniska historia samt behandlingsrekommendationer. Användningen av en specialistläkare för att granska rapporterna och ger behandlingsrekommendationer för patienterna ger den välbehövliga mentorskap för sjuksköterskor såväl som oerfarna kliniker, som allt oftare tillhandahåller ART i Sydafrika som en del av WHO: s rekommendationer för uppgiften växling. Dessa kliniskarapporter har visat sig vara effektiva läromedel för kliniker med liten eller ingen erfarenhet av drogresistenshantering. Ur ett patientperspektiv, minskar vår metod behovet av att resa till centraliserade webbplatser för att få tillgång till specialist hiv-tjänster.

Således, den beskrivna protokollet som helhet ger en bra plattform, där HIV-läkemedelsresistens hantering kan integreras, till en rimlig kostnad, i vårdkedjan för HIV-infekterade individer misslyckas ART. De data som genereras kan användas för epidemiologiska syften att bedöma utvecklingen och överföring av resistens i samhället. Storleken på pol fragment genereras är bra nog för mer komplexa fylogenetisk analys som kommer att producera bättre förståelse av epidemin på befolkningsnivå.

Disclosures

Detta arbete stöddes av Wellcome Trust (082384/Z/07/Z), Europeiska unionen (SANTE 2007 147-790), den amerikanska centret för sjukdomar Styr via CAPRISA (projekttitel: Health Systems Förstärkning och HIV behandlingssvikt (HIV- TFC)), och Schweiziska sydafrikanska gemensamma forskningsprogrammet (SSJRP) forskningsbidrag med titeln "Swiss Prot / Sydafrika: Protein Bioinformatics Resource Development för viktiga Hälsorelaterade patogener". RL stöds av Wellcome Trust (licensnummer 090.999 / Z / 09 / Z). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet. Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Författarna vill tacka alla kolleger som gjort detta arbete möjligt, speciellt Maya Balamane, Elizabeth Johnston Vit, Sharon Sjöblom, Greg Ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, James Garvey, Gavin Cobb, Senzo Maphanga, Terusha Chetty , Kevi Naidoo, Andrew Skingsley, Katharine Stott, och Lungani Ndwandwe. Författarna vill också tacka all personal på Institutionen för hälsa och Afrika Centre personal som arbetar i Hlabisa HIV Behandling och Omvårdnadsprogrammet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Superscript III 1st strand Synthesis kit Life Technologies 18080051 Reverse Transcription
SATURN/LiFE Technologies Custom Primers Life Technologies 4473517 PCR
Platinum Taq Life Technologies 10966026 PCR
PureLink QUICK PCR Purification Kit Life Technologies K310002 PCR
Viroseq ABBOTT 4J94-20 Reverse Transcription and PCR
Agarose Tablets (Dnase/Rnase free) BIOLINE BIO-41027 PCR
TBE Buffer MERCK 1.06177.2500 PCR
O'Range Ruler 200 bp DNA Ladder Fermentas FE SM0633 PCR
Novel Juice GeneDireX LD001-1000 PCR
MiniBis Bioimaging System DNR Bioimaging Systems Ltd Gel Documentation
Power Pac 300  BIORAD Gel Electrophoresis
Big Dye Terminator Kit version 3.1 Life Technologies 4337456 Sequencing
Arrays Life Technolgies 4319899 Sequencing
PoP Life Technologies 4363785 Sequencing
10x EDTA Buffer Life Technologies 402824 Sequencing
Formamide Life Technologies 4311320 Sequencing
5x Sequencing Buffer Life Tecgnologies 4336697 Sequencing
3130 xl Genetic Analyzer Life Technologies Sequencing
GeneAmp PCR System 9700 Life Technologies RT/PCR/Sequencing
Centrifuge 5804 EPPENDORF Sample Processing
Centrifuge 5415R EPPENDORF RNA Extraction
Centrifuge 5415R EPPENDORF RT and PCR
Centrifuge 5415D EPPENDORF PCR Product Clean up
Centrifuge 5810 EPPENDORF Sequencing Clean up
Picofuge BIORAD C1301-230V RT and PCR
Vortex Genius 3 IKA RNA extraction and reagent preparation
Vortex mixer IKA Sequencing Cleanup
NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer ThermoScientific DNA quantification 
3 M Sodium Acetate MERCK 567422 Sequencing Clean up
Absolute Ethanol MERCK SAAR2233540LP Sequencing Cleanup
1.5 ml SARSTEDT Tubes BIODEX 72.692.005 RNA Extraction
2 ml SARSTEDT  Tubes BIODEX 72.693.005 RNA Extraction
2 ml Collection tubes SCIENTIFIC GROUP MCT-200-NC/S RNA Extraction
Optical MicroAmp 96-well reaction plates Life Technologies N8010560 Sequencing
200 µl 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps STAR Lab - supplied by CELTIC A1402-3700 RT and PCR
200 µl PCR individual tubes Scientific Group CR/3745 RT and PCR
Geneious  Biomatters Sequence analysis
Internet Access Preferrably high speed
Web resources
hivdb.stanford.edu Stanford University Drug reistance analysis
http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB SATuRN database
http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html SATuRN Sequence quality tool

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shao, Y., Williamson, C. The HIV-1 epidemic: low- to middle-income countries. Cold Spring Harbor Persp. Med. 2, (2012).
  2. Mutevedzi, P. C., et al. Scale-up of a decentralized HIV treatment programme in rural KwaZulu-Natal, South Africa: does rapid expansion affect patient outcomes. Bull. World Health Organ. 88, 593-600 (2010).
  3. Houlihan, C. F., et al. Cohort profile: Hlabisa HIV treatment and care programme. Int. J. Epidemiol. 40, 318-326 (2011).
  4. Tanser, F., Barnighausen, T., Grapsa, E., Zaidi, J., Newell, M. L. High coverage of ART associated with decline in risk of HIV acquisition in rural KwaZulu-Natal. South Africa. Science. 339, 966-971 (2013).
  5. Bor, J., Herbst, A. J., Newell, M. L., Barnighausen, T. Increases in adult life expectancy in rural South Africa: valuing the scale-up of HIV treatment. Science. 339, 961-965 (2013).
  6. Montaner, J. S., et al. The case for expanding access to highly active antiretroviral therapy to curb the growth of the HIV epidemic. Lancet. 368, 531-536 (2006).
  7. Granich, R. M., Gilks, C. F., Dye, C., De Cock, K. M., Williams, B. G. Universal voluntary HIV testing with immediate antiretroviral therapy as a strategy for elimination of HIV transmission: a mathematical model. Lancet. 373, 48-57 (2009).
  8. Johnson, L. F., et al. Life expectancies of South african adults starting antiretroviral treatment: collaborative analysis of cohort studies. PLoS Med. 10, (2013).
  9. Blower, S., Ma, L., Farmer, P., Koenig, S. Predicting the impact of antiretrovirals in resource-poor settings: preventing HIV infections whilst controlling drug resistance. Curr. Drug Targets. 3, 345-353 (2003).
  10. Geretti, A. M. Epidemiology of antiretroviral drug resistance in drug-naive persons. Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 22-32 (2007).
  11. Larder, B. A., Darby, G., Richman, D. D. HIV with reduced sensitivity to zidovudine (AZT) isolated during prolonged therapy. Science. 243, 1731-1734 (1989).
  12. Erice, A., et al. Brief report: primary infection with zidovudine-resistant human immunodeficiency virus type 1. N. Engl. J. Med. 328, 1163-1165 (1993).
  13. Williams, I., et al. British HIV Association guidelines for the treatment of HIV-1-positive adults with antiretroviral therapy. HIV Med. 13 Suppl 2, 1-85 (2012).
  14. DHHS, US Panel on Antiretroviral Guidelines for Adults and Adolescents. Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. (2012).
  15. Vandamme, A. M., et al. European recommendations for the clinical use of HIV drug resistance testing: 2011 update. AIDS Rev. 13, 77-108 (2011).
  16. DHHS, US Panel on Antiretroviral Therapy and Medical Management of HIV-Infected Children. Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Pediatric HIV Infection. (2012).
  17. Department of Health. Clinical guidelines for the management of HIV & AIDS in adults and adolescents. Department of Health. (2010).
  18. Conradie, F., et al. The 2012 southern African ARV drug resistance testing guidelines. S. Afr. J.HIV Med. 13, 162-167 (2012).
  19. Manasa, J., et al. Primary Drug Resistance in South Africa: Data from 10 Years of Surveys. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 28, 558-565 (2012).
  20. Tshabalala, M., et al. Surveillance of transmitted antiretroviral drug resistance among HIV-1 infected women attending antenatal clinics in Chitungwiza, Zimbabwe. PLoS ONE. 6, (2011).
  21. Bartolo, I., et al. Antiretroviral drug resistance surveillance among treatment-naive human immunodeficiency virus type 1-infected individuals in Angola: evidence for low level of transmitted drug resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 53, 3156-3158 (2009).
  22. Bartolo, I., et al. HIV-1 genetic diversity and transmitted drug resistance in health care settings in Maputo, Mozambique. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 51, 323-331 (2009).
  23. Hamers, R. L., et al. HIV-1 drug resistance in antiretroviral-naive individuals in sub-Saharan Africa after rollout of antiretroviral therapy: a multicentre observational study. Lancet Infect. Dis. 11, 750-759 (2011).
  24. Hamers, R. L., et al. HIV-1 Drug Resistance Mutations Are Present in Six Percent of Persons Initiating Antiretroviral Therapy in Lusaka, Zambia. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. (2010).
  25. Nwobegahay, J., Selabe, G., Ndjeka, N. O., Manhaeve, C., Bessong, P. O. Low prevalence of transmitted genetic drug resistance in a cohort of HIV infected naive patients entering antiretroviral treatment programs at two sites in northern South Africa. J. Med. Virol. 84, 1839-1843 (2012).
  26. Iweriebor, B. C., et al. Molecular epidemiology of HIV in two highly endemic areas of northeastern South Africa. Arch. Virol. 157, 455-465 (2012).
  27. Parboosing, R., Naidoo, A., Gordon, M., Taylor, M., Vella, V. Resistance to antiretroviral drugs in newly diagnosed, young treatment-naive HIV-positive pregnant women in the province of KwaZulu-Natal South Africa. J. Med. Virol. 83, 1508-1513 (2011).
  28. Nwobegahay, J. M., et al. Prevalence of antiretroviral drug resistance mutations and HIV-I subtypes among newly-diagnosed drug-naive persons visiting a voluntary testing and counselling centre in northeastern South Africa. J. Health Popul. Nutr. 29, 303-309 (2011).
  29. Nwobegahay, J., et al. Prevalence of drug-resistant mutations in newly diagnosed drug-naive HIV-1-infected individuals in a treatment site in the waterberg district, limpopo province). S. Afr. Med. J. 101, (2011), 335-337 (2011).
  30. Rosen, S., Long, L., Sanne, I., Stevens, W. S., Fox, M. P. The net cost of incorporating resistance testing into HIV/AIDS treatment in South Africa: a Markov model with primary data. J. Int. AIDS Soc. 14, 24 (2011).
  31. Dalai, S. C., et al. Evolution and molecular epidemiology of subtype C HIV-1 in Zimbabwe. AIDS. 23, 2523-2532 (2009).
  32. Chen, J. H., et al. In-house human immunodeficiency virus-1 genotype resistance testing to determine highly active antiretroviral therapy resistance mutations in Hong Kong. Hong Kong Med. 18, 20-24 (2012).
  33. Lee, C. K., et al. An in-house HIV genotyping assay for the detection of drug resistance mutations in Southeast Asian patients infected with HIV-1. J. Med. Virol. 84, 394-401 (2012).
  34. Aitken, S. C., et al. A Pragmatic Approach to HIV-1 Drug Resistance Determination in Resource-Limited Settings by Use of a Novel Genotyping Assay Targeting the Reverse Transcriptase-Encoding Region Only. J. Clin. Microbiol. 51, 1757-1761 (2013).
  35. Zhou, Z., et al. Optimization of a low cost and broadly sensitive genotyping assay for HIV-1 drug resistance surveillance and monitoring in resource-limited settings. PLoS One. 6, (2011).
  36. , Life Technologies. Life Technologies and SATuRN Collaborate to Increase Access to HIV Testing in Africa. Available from: https://ir.lifetechnologies.com/releasedetail.cfm?releaseid=694585 (2012).
  37. Lihana, R. W., Ssemwanga, D., Abimiku, A., Ndembi, N. Update on HIV-1 diversity in Africa: a decade in review. AIDS Rev. 14, 83-100 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics