Author Produced

En rimelig HIV-1 Drug Resistance Monitoring Metode for Ressurs Limited Innstillinger

Medicine
 

Summary

Resistens testing for HIV-1 infiserte individer sviktende antiretroviral terapi (ART) kan veilede fremtidige terapier og forbedre behandlingsresultatene. Optimalisere individuelle og befolkningshelseutfall i høy HIV-prevalens men ressurs-begrensede innstillinger til slutt vil kreve rimelig og tilgjengelig legemiddelresistens genotyping og tolkningsmetoder.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Manasa, J., Danaviah, S., Pillay, S., Padayachee, P., Mthiyane, H., Mkhize, C., Lessells, R. J., Seebregts, C., de Wit, T. F., Viljoen, J., Katzenstein, D., De Oliveira, T. An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings. J. Vis. Exp. (85), e51242, doi:10.3791/51242 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

HIV-1 resistens har potensial til å seriøst kompromiss effektiviteten og virkningen av antiretroviral terapi (ART). Som ART programmer i Afrika sør for Sahara fortsetter å ekspandere, bør individer på ART overvåkes nøye for fremveksten av legemiddelresistens. Overvåking av overført narkotika motstand å spore overføring av virusstammer som allerede er resistente mot ART er også kritisk. Dessverre, er resistens testing fortsatt ikke er lett tilgjengelig i ressurs begrensede innstillinger, fordi genotyping er dyrt og krever avansert laboratorium og datastyring infrastruktur. En åpen tilgang genotypisk legemiddelresistens overvåking metode for å håndtere individer og vurdere overført resistens er beskrevet. Metoden bruker fri programvare med åpen kildekode for tolkningen av legemiddelresistens mønstre og generering av individuelle pasientrapporter. Den genotyping protokollen har en forsterkning hastighet på større enn 95% for plasmaprøvene med viral belastning> 1000 HIV-1 RNA kopier / ml. Følsomheten reduseres betydelig for viral belastning <1000 HIV-1 RNA kopier / ml. Metoden som beskrives her ble validert mot en metode for HIV-1 resistens testing godkjent av United States Food and Drug Administration (FDA), den Viroseq genotyping metode. Begrensninger av metoden beskrevet her inkluderer det faktum at den ikke er automatisert og at det også kunne forsterke den sirkulerende rekombinant form CRF02_AG fra en validerings panel av prøver, selv om det forsterkede undergrupper A og B fra det samme panelet.

Introduction

HIV-epidemien i det sørlige Afrika har utviklet seg raskt en med en samtidig eksponentiell økning i personer på antiretroviral terapi (ART), spesielt i Sør-Afrika to, tre. Som bevis på epidemiologiske virkningen av storskala behandlingsprogrammer i å redusere forekomsten fire og økende levealder i ressurs-begrensede innstillinger (RLS) 5 fortsetter å hope seg opp, vil arbeidet med å øke ART dekning intensiveres. Utviklingen av retningslinjene til bruk av behandlingen som et forebyggende verktøy 6, 7 under test og behandle programmer betyr at det absolutte antall individer for behandling vil øke ytterligere. Et stort antall individer vil være på ART for lengre perioder av gangen som den gjennomsnittlige levealder for personer på ART nærmer seg at av HIV infisert befolkningen åtte. Utvikling og overføring av HIV legemiddelresistens har alltiys vært betraktet som en trussel mot prestasjoner av ART 9-12. Således er det et behov for en mer rigorøs overvåking og kontroll av legemiddelresistens som flere individer er initiert på ART.

Genotypisk legemiddelresistenstesting (GRT) har vært brukt med hell i utviklede land, både for overvåking samt overvåking av HIV-1 resistens hos personer som får ART. I disse innstillingene, har GRT blitt integrert i den behandling for HIV-1 infiserte individer. De fleste internasjonale retningslinjer anbefaler GRT for voksne eller pediatriske pasienter som sviktet ART (første-og andrelinje) 13-15, pediatriske pasienter eksponert for forebygging av mor-til-barn smitte (PMTCT) regimer, men senere smittet 16, og i miljøer med høye nivåer av overført resistens hos akutt infiserte individer 13-15. Imidlertid har kostnadene, teknologi og infrastruktur krav begrenset gjennomføringtering av lignende tilnærminger til narkotika motstand overvåking i RLS.

Den sørafrikanske HIV behandling og overvåking retningslinjer for øyeblikket ikke anbefale bruk av GRT i guiding valg av ART for personer sviktende første-linjen regimene 17. Enkeltpersoner er slått primært basert på virologisk (HIV-1 RNA) parametre. Men i 2012, Southern African HIV Klinikere Society publiserte de første Southern African ARV legemiddelresistens testing retningslinjer 18. Disse retningslinjene anbefaler GRT testing for alle voksne sviktende første-og andrelinje ART og for infiserte spedbarn og barn utsatt for PMTCT 18. Imidlertid er GRT ikke anbefalt 18 for akutt infiserte individer, fordi det ikke er noen strøm bevis for høye nivåer av overført legemiddelresistens i Sør-Afrika 19-29. Det er forventet at noen av disse anbefalingene vil bli integrert over tid inn i det nasjonale treling og overvåking retningslinjer for de ulike landene i regionen. Allerede i 2013 sørafrikanske retningslinjer for behandling er det nå anbefaling av GRT på tidspunktet for andre-linjefeil for voksne og på tidspunktet for første-eller andre-linjen PI-basert regime fiasko for barn 30.

Det har vist seg at å innlemme GRT inn retningslinjer for behandling i Sør-Afrika ville være potensielt kostnadsnøytralt. Tatt i betraktning kostnadene for de andre behandling legemidler som er relativt dyrere enn de første linje narkotika, bruker GRT å identifisere pasienter som virkelig trenger å bli byttet til andre linje behandling vil ikke medføre noen ekstra kostnader til programmet. I tillegg kan GRT også identifisere andre årsaker til svikt, bevare behandlingstilbud og generere informasjon om nye resistensmønstre 31. Derfor er det nødvendig å redusere kostnadene for legemiddelresistens overvåkingsmetoder enda lenger for å forbedre tilgang, kvaliteten på pleien end utfall.

Her presenterer vi en GRT metode utviklet for å bruke generiske (open source) primere for revers transkripsjon, polymerase chain reaction (PCR) og sekvensering (tabell 1), så vel som for det meste åpen kildekode programvare for legemiddelresistens tolkning. For klinisk ledelse, er protokollen kompletteres av en omfattende gjennomgang og rapporteringsmetode med spesialist tolkning av laboratorielegemiddelresistens rapport med nær tilslutning til de nasjonale retningslinjer for behandling. Protokollen er delt inn i fire ulike komponenter; 1) HIV ribonukleinsyre (RNA) Extraction, 2) Omvendt transkripsjon og Polymerase Chain Reaction (PCR) forsterkning av virale mål, 3) Sekvensering og 4) Bioinformatikk metoder for analyse av chromatograms, justering, curation og tolkning av sekvensdata.

Protocol

En. Etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) Whole Blood Processing

Merk: Blod kan behandles umiddelbart etter innsamling av kan lagres ved 4 ° C i ikke mer enn 24 timer.

  1. Å arbeide i en biosikkerhet kabinett, må EDTA fullblodsprøve for å nå romtemperatur.
  2. For hver prøve, merke nok cryovials med prøven identifikasjon (ID), lagring materiale (plasma), og dato.
  3. Sentrifuger prøvene i 10 minutter ved 1000 x g. Ikke bruk bremsene til å stoppe sentrifuge. Dette vil gi tre lag (fra øverst til nederst): plasma, leukocytter (Buffy pels) - et svært tynt lag - og erytrocytter, inkludert blodplater.
  4. Aspirer forsiktig supernatanten (plasma) og delmengde 500 ml i hver cryovial. Pass på å ikke forstyrre cellelaget (buffycoat) eller overføre noen celler.
  5. Oppbevar ved -80 ° C inntil nødvendig for RNA ekstraksjon eller gå videre til RNA ekstraksjon umiddelbart.
ve_title "> to. RNA Extraction

  1. Forbered en utvinning regneark med ID-ene for prøvene som skal utvinnes inkludert positive og negative plasma kontroller.
  2. For hver prøve som skal ekstraheres, merke en 1,5 ml sterile mikrosentrifugerør med prøven ID, ekstraksjon dato og "RNA". Også en merkelapp sammensatt kolonne og samling rør samt et 2 ml mikrosentrifugerør inneholdende arbeidsdager lysis løsning med tilsvarende tall for utvinning arket.
  3. Arbeid i Bio-sikkerhetskabinett, tilsett 200 mL prøve til tilsvarende 2 ml mikro tube av arbeidslyse løsning.
  4. Vortex brønn og inkuberes i 10 min ved romtemperatur.
  5. Etter 10 min, sentrifuger røret kort.
  6. Legg 800 ml absolutt ethanol til hvert av rørene.
  7. Bland med puls virvling og kort sentrifuge.
  8. Overfør 600 ul av denne oppløsning til den tilsvarende kolonne / samling rørenheten. Sentrifuger ved 6000 xg i 1 min.
  9. Overfør kolonne til en ny samling rør og kast den gamle samling rør som inneholder filtratet. Gjenta ovenstående trinn 2.8 (over) to ganger mer.
  10. Legg 500 pl vaskebuffer AW1 til hver kolonne og sentrifuger ved 6000 xg i 1 min.
  11. Kast filtratet og oppsamlingsrøret og overføre kolonnen til en ny samling rør.
  12. Legg 500 pl buffer ble AW2 og sentrifuger ved 20 000 x g i 3 min. Gjenta trinn 2.11.
  13. Sentrifuger i en ny samling rør ved 20 000 xg i ytterligere 2 min.
  14. Kast filtratet og plass-kolonnen i 1,5 ml mikrosentrifugerør.
  15. Legg 60 pl Buffer AVE (RNase fritt vann) til midten av kolonnen slik at du ikke utporsjonering av væske på siden av kolonnen.
  16. Inkuber ved romtemperatur i 1 min.
  17. Sentrifuger ved 6000 xg i 2 min.
  18. Kast kolonnen og sett lokk på 1,5 ml mikrosentrifugerør.
  19. Prøvene er nå klare for reverSE transkripsjon.
  20. Hvis testing skal utføres umiddelbart, oppbevar ved 4 ° C i opptil 6 timer. Dersom testing skal forsinkes deretter plassere ved -80 ° C umiddelbart. NB: ikke fryse / tine prøvene mer enn 3x.

Tre. Reagens Forberedelse for Omvendt transkripsjon

  1. Før start, beregne volumene av hver av de reagenser som er nødvendig for det antall prøver som blir behandlet, inkludert, de positive og negative plasma kontroller. Også legge en reagens kontroll.
  2. Ved hjelp av de beregnede volumer fra trinn 3.1 (ovenfor), forberede deoksyribonukleotid trifosfat (dNTP)-primerblandingen i en ren, steril 200 mL PCR rør etterfulgt av en kort puls virvling. Hver prøve må ha 0,5 pl av den reverse primer RT21 og 0,5 mL av dNTP, se tabell 2..
  3. Delmengde 1,0 mL av dNTP-primerblandingen til 200 mL PCR-rør.
  4. Forbered revers transkriptase (RT) enzym blanding ved å legge til en μ, L av 10 x revers transkripsjonsbuffer, 1 pl 0,1 M DTT og 2 pl av 25 mM MgCl 2 til et sterilt rør etterfulgt av vortex-blanding og kort sentrifugering, se tabell 3.
  5. Legg 0,5 mL hver av de enzymene RNAseOUT og Hevet III reverstranskriptase til enzymet blandingsrøret deretter på røret forsiktig for å blande.
  6. Hold rørene med dNTP-primer mikser og enzym blanding på en kald blokk og flytte til RNA stasjonen.

4. Omvendt transkripsjon

  1. Tilsett 6 pl av RNA-prøven til dNTP-primer blandingsrøret etterfulgt av en kort virvling å blande.
  2. Etter tilsetningen av RNA, gå til PCR med begge dNTP / primer / RNA-blanding og RT Enzyme blande-rør på en kald blokk eller is.
  3. Kort sentrifuger dNTP / primer / RNA mix rør (fra trinn 4.2) og plassere dem i en thermocycler.
  4. Oppvarm til 65 ° C i 5 minutter for å denaturere RNA.
  5. Raskt kjølig til 4 ° C, hold i 2min.
  6. Pause thermocycler mens de fortsatt på 4 ° C, ta ut rørene.
  7. Raskt legge 5 pl av enzymblandingen, samtidig som rørene i en kald blokk.
  8. Bland forsiktig ved å trykke på røret deretter kort sentrifuger rørene og gå tilbake til thermocycler.
  9. Hold rørene ved 50 ° C i 60 min for å reversere transkribere RNA, etterfulgt av enzym denaturering ved 85 ° C i 5 min for å stanse revers transkripsjon.
  10. Avkjøl til 37 ° C. Så snart temperaturen blir til 37 ° C, pause og ta røret ut av thermocycler.
  11. Raskt legge 0,5 mL av RNase H til rørene og gå tilbake til thermocycler.
  12. Hold ved 37 ° C i 20 min og deretter avkjøles til 4 ° C.
  13. Den komplementære DNA (cDNA) kan brukes umiddelbart eller lagres ved -20 ° C eller lavere inntil nødvendig. Imidlertid bør den langtidslagring av cDNA være ved -80 ° C.

5. Reagens Forberedelse til PCR

  1. Before starter, beregne volumene av hver av de reagenser som er nødvendig for det antall prøver som blir behandlet og kontrollene. I tillegg til de tre kontrollene (positiv, negativ, og agens), kan du også legge til en PCR-kontroll (HIV DNA). De første og andre runde PCR-blandinger kan fremstilles samtidig og det andre konsentrat-blandingen lagret ved -20 ° C inntil behov. Mikser kan lagres i ca 8 timer.
  2. Til 18.4 mL vann, 2,5 ul 10 x buffer, 1,0 ul MgCl2, 0,5 pl dNTPs, og 0,25 mL av hver av primerne, som vist i tabell 4 og virvle.
  3. Legg 0,1 mL av Platinum Taq polymerase (5U/μl) og bland forsiktig røret ved å trykke det.
  4. Delmengde 23 mL av master mix til 200 mL PCR-rør.
  5. Med master mix rør på en kald blokk eller is flytte til PCR rommet.

6. Nøstet PCR

  1. Tilsett 2 pl av cDNA til 23 pl av den første runde PCR master mix.
  2. Lukk rørene, sett prøvene i thermocycler og bruke følgende PCR sykkelBetingelser: 94 ° C i 2 minutter, 30 sykluser av 95 ° C i 30 sek, 58 ° C i 20 sek, og 72 ° C i 2 min, etterfulgt av en endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 min, som vist på figur 1.

Figur 1
Figur 1. Nøstet PCR sykkelforholdene. Klikk her for å se større bilde.

  1. Fortsett til andre runde PCR scenen eller lagre første runde PCR produktene ved -20 ° C eller kaldere før det er nødvendig på et senere stadium.
  2. For andre runde PCR, tilsett 2 mL av den første runden PCR produkt til 23 mL av andre runde PCR mester mix end bruke samme PCR-programmet på figur 1.

7. Gel Electrophoresis

  1. Gel forberedelse
    1. Legg til en 0,5 g agarose tablett til en 250 ml glasskolbe og tilsett 50 ml 1 x TBE-buffer til kolben.
    2. Varm i mikrobølgeovn å koke; virvle ofte (ca. hver 30 sek) til det er helt oppløseliggjort. Bruk en silikongrep eller silikon gryteklut til å ta tak i den varme kolbe. Den agarose-løsning kan koke ut av kolben meget lett så nøye overvåke denne prosessen.
    3. Avkjøl i romtemperatur i ca 10 min.
    4. Hell agarose til en gel støpe magasin inneholdende passende størrelse kam; gel er klar til bruk i omtrent 20-30 min.
    5. Plasser gel i elektroforese kammeret og kjøre som anbefalt av produsenten.
  2. Gel-elektroforese og visualisering.
    1. Vortex Novel Juice for 10 sek før bruk.
    2. Tynn ut en mL av Novel Juice med 5 mL av DNA prøven og mix.
    3. Tynn ut 3 mL av Novel Juice med 3 mL av molekylvekt markør og bland.
    4. Laste mikser av § § 7.2.2 og 7.2.3 (ovenfor) og kjør gelen ved 100 V og 400 mA for 40 min å evaluere PCR forsterkning.
    5. Positiv forsterkning kan bli visualisert under UV-lys som 1315 bp fragment, figur 2.

    Fig. 2
    Figur 2. Gel bekreftelse av PCR forsterkning ved hjelp av en% agarosegelelektroforese og en 200 bp stige. Klikk her for å se større bilde.

    1. Det bør ikke være noen forsterkning i den negative og reagens-kontroller, noe som indikerer fravær av forurensninger.

    8. PCR Produkt Cleanup

    1. I forberedelsene til sekvense reaksjon, er de positive andre runde PCR-produkter ryddet opp ved hjelp av PureLink PCR rensing kit.
    2. Legg 80 mL av arbeids Binding buffer Høy Cutoff (B3) til 20 mL av PCR produkt og pipette miks.
    3. Tilsett prøven blandes med bindingsbuffer til en spin-kolonne i en samling rør.
    4. Sentrifuger kolonnen ved 10 000 x g i 1 min. Overfør kolonne i en ny samling rør.
    5. Vask kolonnen med 650 ul vaskebuffer med etanol.
    6. Sentrifuger kolonnen ved 10 000 x g i 1 min. Overfør kolonne i en ny samling rør.
    7. Sentrifuger på kolonnen ved maksimal hastighet i 2-3 minutter for å fjerne eventuelt gjenværende vaskebuffer.
    8. Plasser spin kolonnen i en ren 1,7 ml eluering rør som følger med settet.
    9. Legg 40 mL av elueringsbuffer til midten av kolonnen og inkuberes kolonnen ved romtemperature for 1 min.
    10. Sentrifuger på kolonnen ved maksimal hastighet i 2 min (> 10 000 xg).
    11. Den eluering røret inneholder en rensede PCR-produkt klar for sekvensering. Kast kolonnen.
    12. Bestem konsentrasjon og kvaliteten av DNA ved hjelp av et Nanodrop.
    13. Hvis ingen i huset sekvense fasiliteter er tilgjengelig, kan de rensede PCR produktene skal sendes til en kommersiell sekvense lab på dette stadiet.

    9. Sekvense Reaksjoner

    1. PCR produktene er sekvensert med den store dye terminator kit versjon 3.1 og 4 primere for hver prøve (to foran og to bakover). Den primer-sekvenser er vist i tabell 2.. Derfor, etter at sekvense løp, vil hver prøve har fire sekvenser for å bli satt sammen til en contig.
    2. Sett opp sekvenseringsreaksjoner som angitt i tabell 5 for hver av de fire primere.
    3. Bland sekvense buffer og primerne ved å virvle før bruk.
    4. Blandvann, buffer og primeren før tilsetningen av den store fargestoff sekvensering. Bland ved virvling.
    5. Bland forsiktig master mix etter at den store fargestoff sekvense Bland ved å snu røret eller banke det lett.
    6. Delmengde 9 mL av master bland inn et 96-brønners optisk plate.
    7. For å kjøre 24 samples / plate, sette opp platen som angitt nedenfor Figur 3.

    Figur 3
    Figur 3. Scheme representasjon av en 96-brønns plate med 12 pasientprøver blir sekvensert med 4 primere hver (RTC1F, RTC2R, RTC3F, og RTC4R). Klikk her for å se større bilde.

    1. Tilsett 1,0 mL av DNA-prøven (~ 20-40 ng), dekke platen med etn klebende aluminiumsdekselet og deretter forsiktig bland det.
    2. Sentrifuger ved 3000 x g i 1 min. Ta av dekselet aluminium og legge en gummipakning matte.
    3. Sett platen på thermocycler og gi følgende sykkel program vist på figur 4..

    Figur 4
    Figur 4. PCR sykkelforholdene for sekvensering. Klikk her for å se større bilde.

    1. Når PCR er ferdig, rydde opp i sekvense produktet umiddelbart.

    10. Sekvense Cleanup

    1. For hver sekvense reaksjon, bland 50 mL absolutt etanol og 5 pl 3 M natriumacetat.
    2. Ved hjelp av en flerkanals pipette, tilsett 55 &# 956, l av natriumacetat / EtOH-løsning til hver brønn.
    3. Forsegle brønner med selvklebende aluminiumsdeksel, slik at hver brønn er forseglet riktig.
    4. Sentrifuger ved 3000 x g i 20 min.
    5. Etter 20 min, ta av dekselet og snus platen, i en jevn bevegelse, på en foldet lab vev (IKKE bang for å kvitte seg med supernatant da dette vil løsne pellet!).
    6. Sentrifuger den inverterte plate på den samme vev ved 150 x g i 2 min.
    7. Umiddelbart legge 150 mL kald 70% EtOH. IKKE utsette tilsetting av etanol på dette trinnet.
    8. Forsegl med samme klebe dekselet og vortex aluminium.
    9. Sentrifuger ved 3000 x g i 5 min.
    10. Inverter platen på en ny foldet vev og sentrifuger invertert ved 150 xg i 1 min.
    11. Etter sentrifugering, sett avdekket i thermocycler og tørke den ved 50 ° C i 2 min.
    12. Når platene er tørre, forsegle den med selvklebende folie dekker, pakk i folie og oppbevares ved -20 ˚ C til den er klar til å fortsette with sekvense elektroforese.
    13. Når klar til sekvensen, oppløse renset sekvense produkt i 10 ml Hi-Di formamid, denaturere og belastningen for elektroforese.

    11. Bioinformatikk

    1. Sequence Assembly
      1. Start programmet Geneious.
      2. Lag en arbeidsmappe for å lagre sekvenser.
      3. Importer ABI filer generert av sekvense maskinen til arbeidsmappen ved hjelp av import verktøyet. Geneious vil bevilge prosent kvalitet score for hver sekvens importert.
      4. Åpne sekvenser med kvalitetspoeng> 70% ved å dobbeltklikke på dem.
      5. Hver fil skal åpnes i et nytt vindu. Programvaren vil angir kvaliteten i hvert nukleotid-posisjonen av kromatogrammet av sekvensen kvalitet ved hjelp av lys blå søylene. Jo høyere søylen er, jo bedre er kvaliteten på basen samtalen.
      6. Bruke markøren velger midten delen av sekvensen la ut endene, som vanligvis er av dårlig kvalitet. Klikk på ekstrakt knappen for å trekke regionen med god kvalitet sekvens.
      7. Velg alle fire hentet sekvenser for hver prøve og montere dem mot en referansesekvens.
      8. Inspiser samlet sekvens for å sikre at du er i riktig leseramme. Hvis du er i riktig leseramme, bør begynnelsen av Protease starte med følgende aminosyrer: PQITLW. Begynnelsen av RT vil starte med PISPIE.
      9. Pakk den contig regionen som dekker begynnelsen av PR til 300th RT kodon. I løpet av denne prosessen, også se etter innsettinger eller slettinger.
      10. Gå gjennom konsensus sekvens av den utpakkede contig, identifisere eventuelle uklarheter og verifisere stillinger med blandede baser ved å inspisere kvalitet (symmetri, høyde, bakgrunn og skuldre av flankerende områder) av base samtaler.
      11. Velg konsensus sekvens og klikk ekstrakt knappen for å opprette en egen fil av konsensus sekvens fra de fire primere og label det på riktig måte.
      12. Eksportere sekvensen til en backup lagring mappe på datamaskinen eller en nettverksmappe.
    2. Sequence Quality Assessment (HIVDB)
      1. Analyser sekvensen bruker HIVDB programmet på http://hivdb.stanford.edu .
      2. Sjekk for slettinger og innsettinger i sammendragsdata og sikre at sekvensen dekker alle de 99 protease (PR) kodon og de første 300 RT kodon.
      3. Sjekk om det er uthevet kvalitetssikring (QA) problemer både i PR og RT regioner, slik som stoppkodoner, ramme skift, tvetydige posisjoner og uvanlige rester.
    3. Sekvense Quality Control
      1. Spreng den nye sekvensen mot en lokal sekvens database fra tidligere kjøring.
      2. Hvis den nye sekvensen er> 97% lik en hvilken som helst sekvens i databasen, bør alle stadier av protokollen gjennomgås, og starter med sekvensanalyse og gå tilbake til det RNA-ekstraksjon på å sikree at det var ingen blanding vinduer (sample svitsjing, mislabeling) eller forurensning.
      3. Hvis ingen problemer identifiseres, gjenta analysen av både den gamle og nye prøver fra RNA ekstraksjon scenen.
      4. Hvis sekvensene er fortsatt> 97% like, gjennomgå pasientens historie for å vurdere for noen epidemiologisk sammenheng mellom enkeltpersoner.
    4. Fylogenetisk analyse
      1. Juster alle sekvensene fra databasen ved hjelp ClustalW program i Geneious.
      2. Manuelt sjekke justering for feiljustert sekvenser, slettinger og innsettinger og redigere tilsvarende.
      3. Konstruere et fylogenetisk tre bruker PHYML, Geneious tre byggmester eller andre tre utbyggere i Geneious.
      4. Undersøke treet for prøver med korte forgrenings lengder.
      5. Gjennomgå prøvene med korte avdelings lengder for mulig forurensning.

    12. REGA DB informatikk

    1. Sequence opp
      1. Logg inn i RegaDB ved hjelp av et unikt brukernavn og passord.
      2. På rullegardinmenyen under Pasient-ID, velger du "begynner med".
      3. Legg pasienten ID og velg den enkelte hvis genotype er å bli lastet opp.
      4. På menyen til venstre, velg "viral isolat".
      5. Fra alternativene under viral isolat velg "Legg til".
      6. Skriv inn Sample dato, Prøve ID, Sequence ID og sekvens dato.
      7. Velg "Velg fil" og deretter navigere til fasta fil av sekvensen som skal lastes opp.
      8. Etter å ha valgt den fasta filen som skal lastes opp, klikk på opplasting.
      9. Når lastet opp sekvensen vises i nucleotide boksen under sekvens identifiserer og datoer, klikk på OK-knappen nederst til høyre i vinduet.
      10. Sjekk for PR og RT protein justering ved å klikke på knappen protein og velge enten PR eller RT.
      11. Sjekk for legemiddelresistens mutasjon ved å klikke på motstanden knappen. Dette girdu motstanden profiler fra tre algoritmer: ANRS, Stanford HIVDB og RegaDB.
    2. Rapportgenerering med REGA
      1. Logg inn i RegaDB bruker ditt unike brukernavn og passord.
      2. På rullegardinmenyen under Pasient-ID, velger du "begynner med".
      3. Legg pasienten ID og velg den enkelte hvis rapporten skal genereres.
      4. På menyen til høyre, velg viral isolat.
      5. Fra alternativene under viral isolat klikk på "visning".
      6. Dobbeltklikk på viral isolat som du ønsker å lage en rapport.
      7. På viral isolat vinduet klikker du på viral isolat rapport kategorien.
      8. Velg algoritmer for tolkningen av genotype fra rullegardinmenyen og velg deretter rapportmalen til å bruke.
      9. Når algoritmen og malen er valgt, klikk på knappen "generere".
      10. Last ned rtf-dokument genereres.
      11. Åpne rtf gjørecument som et Word-dokument.
      12. Endre størrelsen på behandlingshistorie diagrammet.
      13. Etter diagrammet, legge avsnittet "Clinical diagram og motstand tolkning".
      14. Ved hjelp av dataene i tabell motstand og den kliniske diagrammet, legge til en beskrivelse av pasientens motstandsprofil som starter med pasientens behandlingshistorie, og de stoffer som det virale isolater er resistent. Også legge til en beskrivelse av pasientens virusmengde og CD4 + celletall profiler fra diagrammet.
      15. Send rapporten til de infeksjonssykdommer (ID) spesialist for vurdering og anbefalinger om framtidig pasientbehandling. Denne prosessen er også en svært viktig kvalitetstrinn. Eventuelle feil i genotype eller inconsistences i behandlingshistorie, kan virologiske og immunologiske profiler bli identifisert og vurdert før en endelig rapport er sendt, med alle anbefalingene, for klinikeren administrerende pasienten.

Representative Results

Fremgangsmåten ble validert en modifikasjon av en tidligere rapportert fremgangsmåte 20. Den Viroseq genotyping metoden, som har blitt godkjent av FDA, ble brukt som referansemetoden i valideringen. Et panel av kvalitetstestprøver innhentet fra de franske nasjonale kontorene for forskning på AIDS og viral hepatitt (ANRS) ble brukt i den primære sammenligning mellom de to metodene. De to genotyping metodene var 100% konkordant i å identifisere alle klinisk viktige legemiddelresistensassosierte mutasjoner som tolket av HIVDB program for de prøvene som ble vellykket forsterket med begge metodene. Som vist i tabell 6, hvor nukleotidsekvensene til de tre parene var 99,5% identiske. De spådde aminosyresekvensene var 100% identiske. En prøve av fem ikke kunne være vellykket amplifisert ved Viroseq. I tillegg til den prøven ikke forsterket av Viroseq, sviktet husets fremgangsmåte for å forsterke en andre prøve som var vistå være en sirkulerende rekombinant virus (CRF02_AG) av Viroseq. De tre prøver som utdypes med begge metoder var subtype B (to prøver) og subtype A (én prøve).

Figur 5
Figur 5. Bruk av en HKY Neighbor Bli treet gjøres som en del av sekvensen kvalitetssikring. Det er fire par / klynger av sekvens med veldig korte genetiske avstander. Den genetiske avstanden mellom RES655 og RES655_1 (samme prøvene sekvensert på ulike dager) er 0.003. Det er en potensiell feil med RES637_1/RES638 paret som deres genetiske avstanden er for kort (0.075) for prøver fra ulike epidemiologisk opphevet tilknytningen individer. Det er en annen RES637 på treet med en avstand på 0,075 i forhold til RES638_1. Den CQ01/CQ02 klynge tyder på at de to utvalgenefra panelet er duplikater av den samme prøven. De klynge sammen med subtype B referansen sekvens bekrefter subtype tildeles av REGA inndeling i undergrupper verktøyet. CQ05 og CQ04 gruppert med undertypene A og G henholdsvis, mens REGA inndeling i undergrupper verktøy klassifisert dem som A og CRF02_AG hhv. Et annet nyttig verktøy for HIV inndeling i undergrupper og rekombinasjon er SCUEL, som er tilgjengelig på http://www.datamonkey.org. Klikk her for å se større bilde.

Et panel på fem prøver ble brukt for å bedømme nøyaktigheten av den in-house-metoden. Ti replikate genotyper ble samlet for hvert av de fem prøver. Bruke 16 kapil 3130xl genetisk analysator, ble 48 av de 50 genotyper generert fra 24 nedfarter, utarbeidet på samme dag. For alle fem prøvene, den anslåtte aminosyresekvensene var 100% konkordant blant gjentak. For nukleinsyresekvenser, there var> 99% parvise likheten.

I løpet av de to første årene av bruk av denne metoden, ble seksti prøver gjentatt tilfeldig fra RNA ekstraksjon til sekvensering. Det var ingen statistisk signifikante forskjeller mellom sekvensen kvalitet poengsum og antall blandede baser mellom replikatene. Både nukleotid-og aminosyre parvise sammenligninger for de seksti parene var mer enn 99% identisk. Dermed stoffet resistensmutasjonene for alle parene var 100% konkordant.

Kostnadsreduksjon

Reaksjonsvolumer for RT, PCR og sekvensering ble redusert med minst halvparten, i forhold til den opprinnelige metoden 20, 32, uten å gi avkall på kvaliteten av sekvensene generert. Dette muliggjort en reduksjon av kostnadene med 50% for RT-og PCR-trinn.

Den nye metoden ble opprinnelig utviklet for bruk med seks sekvense primer til sekvens alle 99 kodoner av protease-genet og de ​​første 300 kodoner av den reverse transkriptase gene 20, 32.. Lignende metoder også bruke seks til åtte primere 33, 34. Noen nylig publiserte metoder har brukt mindre enn seks primere, men noen ganger sekvensering av protease og RT gener seprately 35, 36. Vi har søkt å redusere antall sekvense primere 6-4, (figur 6)

Figur 6
Figur 6. Sammenligning av etterfølgende sekvenser fra seks vs fire sekvense primere for generering av den 1197 bp pol-sekvens som omfatter alle 99 HIV-1-protease-kodon og de ​​første 300 kodoner av revers transkriptase-genet.242/51242fig6highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.

Sekvenser fra et sett av 17 prøver som er generert fra seks primere ble sammenlignet med sekvenser som er generert etter uttrekk av to primere (MAW46 og rty). Subtypene var 14 subtype C, to subtype B, og en undertype A. Det var ingen signifikante forskjeller i sekvens kvalitetspoeng. Igjen var den gjennomsnittlige parvise identitet mellom de 17 parene av nukleinsyre ble 99% og 100% på aminosyrenivået. Dermed redusere sekvense primere 6-4 resulterte i en reduksjon i sekvense kostnadene med nesten en tredjedel.

Den eneste proprietær programvare verktøy som brukes i denne protokollen var Geneious for sekvens montering. De legemiddelresistens tolkningsverktøy, samt rapporten genererer verktøy er gratis, åpen tilgang til verktøy. Dette reduserer kostnadene ytterligere ved å eliminere kostnadene ved bruk av proprietær programvare. Videre collective forhandling tillot reagenser for denne protokollen til å bli pakket inn i et kit for enkel tilgang fra Life Technologies og er tilgjengelig som Saturn / Life Technologies genotyping metode 37. Videre kan Saturn medlemmer tilgang til reagenser til en rabattert pris.

Klinisk Setting

Den beskrevne protokollen er implementert i overvåking av resistens i et bygdesamfunn i KwaZulu-Natal. Totalt 604 genotyper ble generert fra kliniske prøver mellom desember 2010 og mai 2013 en forsterkning sats på 95% for prøver med virusmengde> 1000 RNA kopier / ml. Denne kliniske HIV legemiddelresistens Studien ble godkjent av Biomedisinsk forskningsetiske komité ved University of KwaZulu-Natal (ref. BF052/10) og helseforskningskomiteen i KwaZulu-Natal Department of Health (ref. HRKM 176/10). Enkelte pasientrapporter ble generert og sendt tilbake til klinikkenefor behandlingen av pasienten.

Sytti to (72) genotyper ble også dannet som en del av et overvåkningssystem for overført legemiddelresistens studien, nestet i en stor potensiell populasjonsbasert HIV overvåkning studien. Den primære prøvene var nålestikk fullblod samlet i EDTA mikrorør. Ved genotyping var det en forsterkning prosent på 79% 19. Etikk godkjenning for genotyping av prøver fra overvåkningen studien ble hentet fra University of KwaZulu-Natal Biomedisinsk forskningsetiske komité (ref. BE066107).

Primer navn Sequence Lengde Direction HXB2 Stilling
MAW-26 TTGGAAATGTGGAAA GGAAGGAC 23 Forward 2028-2050 Første runde PCR
RT-21 CTGTATTTCAGCTATC AAGTCCTTTGATGGG 31 Reverse 3539-3509 Første runde PCR
Pro-en TAGAGCCAACAGCCC CACCA 20 Forward 2147-2166 Andre runde PCR
RT-20 CTGCCAATTCTAATTC TGCTTC 22 Reverse 3462-3441 Andre runde PCR
RTC1F ACCTACACCTGTCAA CATAATTG 23 Forward 2486-2508 Sekvense
RTC2R TGTCAATGGCCATTG TTTAACCTTTGG 27 Reverse 2630-2604 Sekvense
RTC3F CACCAGGGATTAGAT ATCAATATAATGTGC 30 Forward 2956-2994 Sekvense
RTC4R CTAAATCAGATCCTAC ATACAAGTCATCC 29 Reverse 3129-3101 Sekvense
RT-y GTGTCTCATTGTTTAT ACTAGG 22 Reverse 2967-2946 Sekvense
MAW-46 TCCCTCAGATCACTC TTTGGCAACGAC 27 Forward 2251-2277 Sekvense

Tabell 1. Revers transkripsjon, PCR og sekvense tilpassede primere som brukes i produksjon av et 1197 bp pol-fragment som dekker alle de 99 HIV-1 Protease-kodon og de ​​første 300 kodoner av den omvendte trascriptase genet.

RT21 (5pmol/ml) 0,5 0,2
dNTP (10 mm) 0,5 0,4
Total 1

Tabell 2. dNTP / Primer blandes for revers transkripsjon reaksjon.

Reagens Volum (ml) / reaksjons Konsentrasjon / reaksjon
First Strand Buffer (10x) 1 1
MgCl2 (25 mM) 2 4
DTT (0,1 M) 1 0.008
RNaseOUT (40 U / ml) 0,5 16
Hevet III revers transkriptase (200U/ml) 0,5 8
Total 5

Tabell 3. Enzym blande for revers transkripsjon reaksjonen.

Reagens Volum (ml) / reaksjons Endelig konsentrasjon / Reaction
DEPC behandlet vann 18.4 - </ Td>
PCR Buffer (10x) 2,5 1
MgCl2 (50 mM) 1 2
dNTP mix (10 mm) 0,5 0,2
Froward primer (5 pmol / ml) 0,25 0,05
Omvendt primer (5 pmol / ml) 0,25 0,05
Platina Taq-polymerase (5 U / ml) 0,1 0,02
Delsum 23 -

Tabell 4. Master miksen for nestet PCR.

Reagens Volum (ml) / reaksjons Konsentrasjon / reaksjon
DEPC behandlet vann 6.1
Sekvense Buffer (5x) 2 1
Primer (3,2 pmol / ml) 0,5 0,16
Big Dye terminator Sekvense mix 0,4 -
Total 9

Tabell 5. Master mix for sekvenseringsreaksjoner.

Viroseq Inhouse % NA Likhet
Sample ID Subtype Kvalitetspoeng PR Mutasjoner RT mutasjoner Subtype Kvalitetspoeng PR mutasjoner RT Mutasjoner
CQ01 B 99.9 M46L, I54L, V82A, L90M D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q B 99,2 M46L, I54L, V82A, L90M D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q 100
CQ02 B 99.5 M46L, I54L, V82A, L90M D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q B 99.5 M46L, I54L, V82A, L90M D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q 100
CQ03 NA NA NA NA NA NA
CQ04 CRF02_AG 98.4 I54V, V82F, I84V M41L, L74I, L210W, T215Y, V108I, Y181C NA NA NA NA NA
CQ05 A 99,7 K103N A 93 K103N 100

Tabell 6. Comparative results fra en parallellanalyse mellom Viroseq genotyping metoden og in-house metode ved hjelp av et panel av prøver gitt av ANRS.

Discussion

Flere lavpris in-house metoder har blitt beskrevet i arbeidet med å prøve å få HIV legemiddelresistens genotyping rimeligere 33, 34, 36. Det er ingen tvil om behovet for å integrere legemiddelresistens testing i kontinuum av omsorg for enkeltpersoner på antiretroviral behandling i ressurs-begrensede innstillinger. Men de fleste av de rapporterte metoder fokuserer på anvendelse av legemiddelresistens genotyping i overvåking av resistens på et samfunnsnivå. Saturn / Livet Technologies genotyping metoden er en fullt integrert protokoll for overvåking og oppfølging av legemiddelresistens. Denne metoden ble utviklet for å være en rimelig protokoll implementere meste åpen kildekode og åpne ressurser tilgang bioinformatikk for tolkningen av legemiddelresistens og generering av rapporter for klinisk ledelse.

Det ble vist gjennom sammenligning med FDA godkjente Viroseq genotyping metode for å værenøyaktig i å identifisere legemiddelresistens mutasjoner fra et panel av ANRS kvalitetstestprøver, i 100% av laboratoriepanelprøver som ble vellykket forsterket. Nøyaktigheten ble også vurdert på kliniske prøver av subtype C virus, den mest dominerende subtype i det sørlige Afrika. Fremgangsmåten var nøyaktig som på undertype C-prøvene som det var på undertype A og B. Imidlertid, hvis fremgangsmåten skal anvendes i andre deler av verden hvor CRF02_AG er utbredt, er det behov for modifisering av de primere ettersom metoden unnlatt å forsterke en av panelprøver som ble vist å ha CRF02_AG. Alternativt kan en degenerert sett av primere som er følsomme for alle gruppe M virus 33, 36 kan anvendes i områder hvor subtype fordelingen er mer heterogen 38..

Følsomheten av revers transkripsjon og PCR kan økes ved å ekstrahere RNA fra høyere volumer av plasma, for eksempel 500 ml. Plasmaet kan sentrifugeuged på 21 000 xg i 90 min å konsentrere viruspartikler før du fortsetter med protokollen som beskrevet av QIAamp viral RNA ekstraksjon mini kit.

Som vist, har den nye metoden en ekstra fordel at den produserer omfattende rapporter for individuell pasientbehandling. Disse rapportene er en konsolidering av genotype, immunologiske og virologisk overvåkingsdata samt klinisk og behandlingshistorikk fra RegaDB. Dette er ledsaget av en detaljert laboratorie tolkning av motstandsprofil, etterfulgt av et like detaljert gjennomgang av pasientens kliniske historie samt behandling anbefalinger. Bruken av en spesialist med å gjennomgå rapportene og gi behandling anbefalinger for pasientene gir sårt tiltrengte mentorer for sykepleier utøvere samt uerfarne klinikere, som i økende grad gir ART i Sør-Afrika som en del av WHOs anbefalinger for oppgaven giring. Disse kliniskerapporter har vist seg å være effektive læremidler for klinikere med liten eller ingen erfaring i legemiddelresistens ledelse. Fra et pasientperspektiv, reduserer vår metode behovet for å reise til sentraliserte områder for å få tilgang til spesialist HIV-tjenester.

Dermed blir beskrevet protokoll som helhet gir en god plattform der HIV legemiddelresistens ledelse kan bli integrert, til en rimelig pris, i den behandling for HIV-infiserte individer sviktende ART. Dataene som genereres kan brukes for epidemiologiske formål å bedømme utviklingen og overføring av legemiddelresistens i samfunnet. Størrelsen på pol fragment generert er god nok for mer komplekse fylogenetisk analyse som vil gi bedre forståelse av epidemien på populasjonsnivå.

Disclosures

Dette arbeidet ble støttet av Wellcome Trust (082384/Z/07/Z), EU (SANTE 2007 147-790), det amerikanske senteret for smittevern via CAPRISA (prosjekttittel: Health Systems Styrking og HIV behandlingssvikt (HIV- TFC)), og den sveitsiske sørafrikanske Joint Research Programme (SSJRP) forskningsstipend tittelen "Swiss Prot / Sør-Afrika: Protein Bioinformatikk Resource Development for viktige helserelatert Patogener". RL er støttet av Wellcome Trust (stipend nummer 090999 / Z / 09 / Z). finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke alle kolleger som har gjort dette arbeidet mulig, spesielt Maya Balamane, Elizabeth Johnston hvit, Sharon Sjoblom, Greg Ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, James Garvey, Gavin Cobb, Senzo Maphanga, Terusha Chetty , Kevi Naidoo, Andrew Skingsley, Katharine Stott, og Lungani Ndwandwe. Forfatterne vil også takke alle de ansatte i avdeling for helse og Afrika Senter personell som jobber Hlabisa HIV behandling og pleie Programme.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Superscript III 1st strand Synthesis kit Life Technologies 18080051 Reverse Transcription
SATURN/LiFE Technologies Custom Primers Life Technologies 4473517 PCR
Platinum Taq Life Technologies 10966026 PCR
PureLink QUICK PCR Purification Kit Life Technologies K310002 PCR
Viroseq ABBOTT 4J94-20 Reverse Transcription and PCR
Agarose Tablets (Dnase/Rnase free) BIOLINE BIO-41027 PCR
TBE Buffer MERCK 1.06177.2500 PCR
O'Range Ruler 200 bp DNA Ladder Fermentas FE SM0633 PCR
Novel Juice GeneDireX LD001-1000 PCR
MiniBis Bioimaging System DNR Bioimaging Systems Ltd Gel Documentation
Power Pac 300  BIORAD Gel Electrophoresis
Big Dye Terminator Kit version 3.1 Life Technologies 4337456 Sequencing
Arrays Life Technolgies 4319899 Sequencing
PoP Life Technologies 4363785 Sequencing
10x EDTA Buffer Life Technologies 402824 Sequencing
Formamide Life Technologies 4311320 Sequencing
5x Sequencing Buffer Life Tecgnologies 4336697 Sequencing
3130 xl Genetic Analyzer Life Technologies Sequencing
GeneAmp PCR System 9700 Life Technologies RT/PCR/Sequencing
Centrifuge 5804 EPPENDORF Sample Processing
Centrifuge 5415R EPPENDORF RNA Extraction
Centrifuge 5415R EPPENDORF RT and PCR
Centrifuge 5415D EPPENDORF PCR Product Clean up
Centrifuge 5810 EPPENDORF Sequencing Clean up
Picofuge BIORAD C1301-230V RT and PCR
Vortex Genius 3 IKA RNA extraction and reagent preparation
Vortex mixer IKA Sequencing Cleanup
NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer ThermoScientific DNA quantification 
3 M Sodium Acetate MERCK 567422 Sequencing Clean up
Absolute Ethanol MERCK SAAR2233540LP Sequencing Cleanup
1.5 ml SARSTEDT Tubes BIODEX 72.692.005 RNA Extraction
2 ml SARSTEDT  Tubes BIODEX 72.693.005 RNA Extraction
2 ml Collection tubes SCIENTIFIC GROUP MCT-200-NC/S RNA Extraction
Optical MicroAmp 96-well reaction plates Life Technologies N8010560 Sequencing
200 µl 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps STAR Lab - supplied by CELTIC A1402-3700 RT and PCR
200 µl PCR individual tubes Scientific Group CR/3745 RT and PCR
Geneious  Biomatters Sequence analysis
Internet Access Preferrably high speed
Web resources
hivdb.stanford.edu Stanford University Drug reistance analysis
http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB SATuRN database
http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html SATuRN Sequence quality tool

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shao, Y., Williamson, C. The HIV-1 epidemic: low- to middle-income countries. Cold Spring Harbor Persp. Med. 2, (2012).
  2. Mutevedzi, P. C., et al. Scale-up of a decentralized HIV treatment programme in rural KwaZulu-Natal, South Africa: does rapid expansion affect patient outcomes. Bull. World Health Organ. 88, 593-600 (2010).
  3. Houlihan, C. F., et al. Cohort profile: Hlabisa HIV treatment and care programme. Int. J. Epidemiol. 40, 318-326 (2011).
  4. Tanser, F., Barnighausen, T., Grapsa, E., Zaidi, J., Newell, M. L. High coverage of ART associated with decline in risk of HIV acquisition in rural KwaZulu-Natal. South Africa. Science. 339, 966-971 (2013).
  5. Bor, J., Herbst, A. J., Newell, M. L., Barnighausen, T. Increases in adult life expectancy in rural South Africa: valuing the scale-up of HIV treatment. Science. 339, 961-965 (2013).
  6. Montaner, J. S., et al. The case for expanding access to highly active antiretroviral therapy to curb the growth of the HIV epidemic. Lancet. 368, 531-536 (2006).
  7. Granich, R. M., Gilks, C. F., Dye, C., De Cock, K. M., Williams, B. G. Universal voluntary HIV testing with immediate antiretroviral therapy as a strategy for elimination of HIV transmission: a mathematical model. Lancet. 373, 48-57 (2009).
  8. Johnson, L. F., et al. Life expectancies of South african adults starting antiretroviral treatment: collaborative analysis of cohort studies. PLoS Med. 10, (2013).
  9. Blower, S., Ma, L., Farmer, P., Koenig, S. Predicting the impact of antiretrovirals in resource-poor settings: preventing HIV infections whilst controlling drug resistance. Curr. Drug Targets. 3, 345-353 (2003).
  10. Geretti, A. M. Epidemiology of antiretroviral drug resistance in drug-naive persons. Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 22-32 (2007).
  11. Larder, B. A., Darby, G., Richman, D. D. HIV with reduced sensitivity to zidovudine (AZT) isolated during prolonged therapy. Science. 243, 1731-1734 (1989).
  12. Erice, A., et al. Brief report: primary infection with zidovudine-resistant human immunodeficiency virus type 1. N. Engl. J. Med. 328, 1163-1165 (1993).
  13. Williams, I., et al. British HIV Association guidelines for the treatment of HIV-1-positive adults with antiretroviral therapy. HIV Med. 13 Suppl 2, 1-85 (2012).
  14. DHHS, US Panel on Antiretroviral Guidelines for Adults and Adolescents. Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. (2012).
  15. Vandamme, A. M., et al. European recommendations for the clinical use of HIV drug resistance testing: 2011 update. AIDS Rev. 13, 77-108 (2011).
  16. DHHS, US Panel on Antiretroviral Therapy and Medical Management of HIV-Infected Children. Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Pediatric HIV Infection. (2012).
  17. Department of Health. Clinical guidelines for the management of HIV & AIDS in adults and adolescents. Department of Health. (2010).
  18. Conradie, F., et al. The 2012 southern African ARV drug resistance testing guidelines. S. Afr. J.HIV Med. 13, 162-167 (2012).
  19. Manasa, J., et al. Primary Drug Resistance in South Africa: Data from 10 Years of Surveys. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 28, 558-565 (2012).
  20. Tshabalala, M., et al. Surveillance of transmitted antiretroviral drug resistance among HIV-1 infected women attending antenatal clinics in Chitungwiza, Zimbabwe. PLoS ONE. 6, (2011).
  21. Bartolo, I., et al. Antiretroviral drug resistance surveillance among treatment-naive human immunodeficiency virus type 1-infected individuals in Angola: evidence for low level of transmitted drug resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 53, 3156-3158 (2009).
  22. Bartolo, I., et al. HIV-1 genetic diversity and transmitted drug resistance in health care settings in Maputo, Mozambique. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 51, 323-331 (2009).
  23. Hamers, R. L., et al. HIV-1 drug resistance in antiretroviral-naive individuals in sub-Saharan Africa after rollout of antiretroviral therapy: a multicentre observational study. Lancet Infect. Dis. 11, 750-759 (2011).
  24. Hamers, R. L., et al. HIV-1 Drug Resistance Mutations Are Present in Six Percent of Persons Initiating Antiretroviral Therapy in Lusaka, Zambia. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. (2010).
  25. Nwobegahay, J., Selabe, G., Ndjeka, N. O., Manhaeve, C., Bessong, P. O. Low prevalence of transmitted genetic drug resistance in a cohort of HIV infected naive patients entering antiretroviral treatment programs at two sites in northern South Africa. J. Med. Virol. 84, 1839-1843 (2012).
  26. Iweriebor, B. C., et al. Molecular epidemiology of HIV in two highly endemic areas of northeastern South Africa. Arch. Virol. 157, 455-465 (2012).
  27. Parboosing, R., Naidoo, A., Gordon, M., Taylor, M., Vella, V. Resistance to antiretroviral drugs in newly diagnosed, young treatment-naive HIV-positive pregnant women in the province of KwaZulu-Natal South Africa. J. Med. Virol. 83, 1508-1513 (2011).
  28. Nwobegahay, J. M., et al. Prevalence of antiretroviral drug resistance mutations and HIV-I subtypes among newly-diagnosed drug-naive persons visiting a voluntary testing and counselling centre in northeastern South Africa. J. Health Popul. Nutr. 29, 303-309 (2011).
  29. Nwobegahay, J., et al. Prevalence of drug-resistant mutations in newly diagnosed drug-naive HIV-1-infected individuals in a treatment site in the waterberg district, limpopo province). S. Afr. Med. J. 101, (2011), 335-337 (2011).
  30. Rosen, S., Long, L., Sanne, I., Stevens, W. S., Fox, M. P. The net cost of incorporating resistance testing into HIV/AIDS treatment in South Africa: a Markov model with primary data. J. Int. AIDS Soc. 14, 24 (2011).
  31. Dalai, S. C., et al. Evolution and molecular epidemiology of subtype C HIV-1 in Zimbabwe. AIDS. 23, 2523-2532 (2009).
  32. Chen, J. H., et al. In-house human immunodeficiency virus-1 genotype resistance testing to determine highly active antiretroviral therapy resistance mutations in Hong Kong. Hong Kong Med. 18, 20-24 (2012).
  33. Lee, C. K., et al. An in-house HIV genotyping assay for the detection of drug resistance mutations in Southeast Asian patients infected with HIV-1. J. Med. Virol. 84, 394-401 (2012).
  34. Aitken, S. C., et al. A Pragmatic Approach to HIV-1 Drug Resistance Determination in Resource-Limited Settings by Use of a Novel Genotyping Assay Targeting the Reverse Transcriptase-Encoding Region Only. J. Clin. Microbiol. 51, 1757-1761 (2013).
  35. Zhou, Z., et al. Optimization of a low cost and broadly sensitive genotyping assay for HIV-1 drug resistance surveillance and monitoring in resource-limited settings. PLoS One. 6, (2011).
  36. , Life Technologies. Life Technologies and SATuRN Collaborate to Increase Access to HIV Testing in Africa. Available from: https://ir.lifetechnologies.com/releasedetail.cfm?releaseid=694585 (2012).
  37. Lihana, R. W., Ssemwanga, D., Abimiku, A., Ndembi, N. Update on HIV-1 diversity in Africa: a decade in review. AIDS Rev. 14, 83-100 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics