凝血因子VIII的脂质纳米管螺旋组织

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Bioengineering

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Summary

我们提出了低温电子显微镜,脂质纳米技术和结构分析的组合应用,以解决两个高度同源的FVIII形式与膜结合的结构:人和猪。在我们研制的实验室,以螺旋状组织两个功能重组FVIII形式对带负电荷的脂质纳米管(LNT)的方法进行说明。

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Miller, J., Dalm, D., Koyfman, A. Y., Grushin, K., Stoilova-McPhie, S. Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes. J. Vis. Exp. (88), e51254, doi:10.3791/51254 (2014).

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Abstract

低温电子显微镜(冷冻电镜)1是一款功能强大的方法在水合状态和膜环境2,调查的蛋白质和复合物的功能结构。

凝血因子VIII(FVIII) 图3是一个多结构域的血浆糖蛋白。缺陷或FVIII的缺乏是导致血友病A型 - 一个严重的出血性疾病。经蛋白水解活化,FVIII结合到丝氨酸蛋白酶因子IXa上的带负电荷的血小板膜,这是正常的凝血4是至关重要的。尽管举足轻重的作用FVIII凝血发挥,其膜结合态的结构信息是不完整的5。重组FVIII浓缩物是抗血友病A型的最有效的药物和市售的FVIII可以表示为人类或猪,既形成功能性复合物与人的因子IXa 6,7。

“>在本研究中,我们提出低温电子显微镜(冷冻电镜)的组合,脂质纳米技术和结构分析应用到解决两个高度同源的FVIII形式与膜结合的结构:人和猪在我们实验室开发的方法以螺旋状组织两个功能重组FVIII形式对带负电荷的脂质纳米管(LNT)中说明。代表结果表明,我们的方法是足够灵敏定义序列中的两个高度同源(86%序列同一性之间的差异在螺旋机构)蛋白。为螺旋机构,冷冻电镜和电子断层扫描(ET)的数据采集的详细方案中给出的二维(2D)和三维(3D)结构分析应用于获得人和猪的三维重建FVIII-LNT进行了讨论。所提出的人类和猪FVIII-LNT结构表明了该方法的潜力度的计算E中的功能性,膜结合的凝血因子VIII在高分辨率的组织。

Introduction

凝血因子VIII(FVIII)是由六个域2,332个氨基酸的糖蛋白大:A1-A2-B-A3-C1-C2 3。经凝血酶激活的FVIII作为内与膜结合的tenase复合物的辅因子以因子IXa。激活的FVIII(FVIIIa)来的FIXa中的膜-视方式结合增强FIXa的蛋白水解效率超过10 5倍,这是有效的凝血4是至关重要的。尽管重要作用的FVIII在凝固和tenase复合物的形成中起着,功能膜结合的FVIII结构尚未得到解决。

为了解决这个问题,单脂双层碳纳米管(LNT)富含磷脂酰丝氨酸(PS),能够结合的FVIII以高亲和性8,9和类似的活化的血小板表面已经开发了10。 FVIII的连续螺旋机构势必LNT已经被证明是effecti对于已经通过结构冷冻EM 5测定FVIII膜结合状态。官能化LNT是一个理想的系统通过冷冻电镜11,12,以研究蛋白质-蛋白质和螺旋组织膜相关蛋白的蛋白质-膜相互作用。冷冻电镜具有如下优点:与传统的结构的方法,如X-射线晶体学和核磁共振,作为试件被保存在最靠近生理环境(缓冲液,膜,pH值),无添加剂和同位素。在FVIII的情况下,使用此技术研究与膜结合的结构更是生理上相关的,因为在LNT类似密切的大小,形状和组成的活化的血小板,其中Tenase配合装配体内的伪足。

缺陷和FVIII的原因A型血友病,严重的出血性疾病影响1 5000男性的人口4,6的缺乏。在大多数电子ffective治疗血友病A是重组人FVIII(hFVIII的)终身管理。的重组FVIII血友病A治疗的显著并发症是抑制性抗体的发展到人的形式影响血友病A患者13约30%。在这种情况下,猪FVIII(pFVIII)浓缩物的情况下,如猪FVIII显示低交叉反应性抗人FVIII和形式的功能性复合体与人的FIXa 7的抑制性抗体。建立两个猪和人FVIII形式的膜结合组织是重要的,了解的FVIII辅助因子的功能和血止血的影响的结构基础。

在这项研究中,我们描述了脂质纳米技术,冷冻电镜和结构分析,旨在解决两个高度同源的FVIII形式的膜结合组织的结合。所提出的Cryo-EM数据和三维结构螺旋举办porci在带负电荷的LNT NE和人FVIII表明,所提出的纳米技术作为基础,FVIII的结构测定与膜结合的凝血因子和在生理环境中的膜复合物的潜力。

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Protocol

1,样品制备

  1. 缓冲液交换的人FVIII-BDD 14和猪FVIII-BDD 15对HBS-钙缓冲液(20mM HEPES,150 mM氯化钠,5mM的氯化钙 ,pH值= 7.4)并浓缩至1.2毫克/毫升。保持蛋白溶液于-80℃。
  2. 通过为1:4 w / w的比例在氯仿混合半乳糖(GC)和磷脂酰丝氨酸(PS)准备脂质纳米管(LNT)。蒸除氯仿在氩气下并溶解在HBS缓冲液中的脂质为1毫克/毫升。保持LNT的解决方案,在4°C。

2,低温电子FVIII-LNT的显微镜

  1. 冷冻电镜样品制备
    1. 辉光放电300个网眼的Quantifoil R2 / 2的铜网(碳朝上)中的O 2和H 2气体的混合物,持续10秒,在50 W。
    2. 混在HBS-钙缓冲液中的FVIII和LNT溶液以1:1 w / w的比率,并孵育15分钟,在室温下进行。
    3. 申请下降了2.5微升的FVIII-LNT样品的亲水性电子显微镜电网中的Vitrobot Mark IV的加湿室(100%湿度)。
    4. blot和闪光灯冻结格(一个污点3.5秒,吸干力1)在液体C 2 H 6,冷却用液态氮来获得无定形冰。
    5. 存储网格下液态氮(LN2)储物盒。
  2. 冷冻电镜数据收集
    注:JEM2100-六硼化镧(2010年)配备一个TEMCON操作系统包括连接到所述电子显微镜,有窗读取真空系统,照明系统,HT,透镜电流等上的屏幕和两个计算机的面板:左边和右边,放置在柱的两侧。梁位移X,Y旋钮(SHIFT键Y,SIFT Y)和多功能(DEF / STIG)旋钮是在两个面板。在左边的面板照明(BRIGTHNESS)旋钮。在右侧面板有:放大倍率(MAG / CAM的长度)和焦点(FOCUS)旋钮和三个IMAGIN克(MAG1,MAG2,LOWMAG)和衍射(DIFF)模式的按钮。我们获得了我们的MAG1数据在α-2的最小剂量照射条件(MDS)所需的冷冻电镜数据采集到F6按键,右侧面板的最上面一排设置的F1。在这个协议中的通用设置用于:F1 - 升高/降低屏幕,F2 - 搜索模式,F3 - 对焦模式​​,F4 - 照片模式,F5 - MDS OFF / ON和F6 - 异型坯,用于从辐射屏蔽标本通过偏转光束损坏。
    1. 将冷冻支架插入冷冻站,并填写持有人及冷冻站与液氮的杜瓦。当温度达到-192℃,在支架末端开放的快门,取代先前冻结的冷冻电镜电网到指定地点,并与环夹固定。
    2. 将冷冻支架插入电子显微镜。重新加注冷冻支架和防contaminator室用液氮的杜瓦。等待持有人30-60分钟稳定。按F6键上打开灯丝上。当灯丝处于饱和状态,按F6键关闭和打开快门的持有人查看网格。
    3. 按低倍率/α-1(设定在200X MAG)和定位区域与薄冰上的网格。
    4. 切换到MAG 1/alpha 2设置最小剂量(MDS)的模式,并获得超低温电磁数据在低剂量电子,而不破坏样品。
      1. 按F2键来设定搜索模式。以40,000×设定的放大倍率。放大梁BRIGTNESS旋钮,最小的电子剂量〜0.04É - / A 2·s以下。按DIFF切换到衍射模式。将相机长度为120厘米,MAG / CAM的长度计旋钮。在LOWMAG预先选定的区域中具有碳薄膜的孔的脂质纳米管内定位在网格区域。
      2. 按F4键设置照片模式在40,000倍放大,并设置照明,亮度旋钮剂量为16-25É - / A 2·s以下。按标准对焦按钮将焦点设置条件调整Z轴高度用Z UP / DOWN按钮(右控制面板)的标本。 -1.5和-2.5微米之间设置的散焦。
      3. 通过对应于在照片模式下进行成像的区域搜索模式数码相机显示屏上绘制的实时显示窗口的正方形排列搜索和照片模式。
      4. 按F3键设置对焦模式为100,000倍放大。重点照明覆盖CCD芯片(〜4 - 5厘米半径)和离轴不照射在照片模式将被成像的区域。调整散焦〜-1.5和-2.5微米的调焦旋钮和正确使用DEF / STIG旋钮图像的散光。
    5. 选择FVIII-LNT由数码相机显示屏上获取实时图像的实时显示窗口进行成像的搜索模式。居中的FVIII-LNT中绘制的实时显示窗口上的正方形。
    6. 通过切换到照片模式,并点击ACQUIR记录的CCD相机的数字图像在52,000 X有效放大倍率和0.5秒的曝光数码显微相机显示屏上的E键。图像采集条件设置,如光束空白(百叶窗)开,只有当图像在照片模式被获取。
    7. 按Ctrl-F以获得快速傅立叶变换(FFT)检查获取的图像质量和散焦。

3,三维重建

注:用于2D和3D分析图像分析软件:EMAN2和IHRSR都是免费的。 EMAN2可以从http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install下载。 egelman@virginia.edu:该IHRSR软件可以从Egelman教授获得。最后IHRSR改进是在德州上运行高级计算中心集群:http://www.tacc.utexas.edu/在得克萨斯大学奥斯汀分校。在图1所示的三维重建算法包括两个主要步骤:首先选择一个同质组螺旋片(颗粒)与2D参考免费alignme在电子舱单2实施新台币(RFA)的算法,第二个实现基于在IHRSR注册成立的螺旋参数和反投影算法进行三维重建。第一步利用选择均匀的颗粒集三维重建与单粒子SPA(算法)为其EMAN2已专门开发和分布式开发的项目:http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2。这一步已经适应了冷冻电镜数据。第二个步骤是与IHRSR算法,它是专为与所述重组因子VIII的形式得到螺旋组件的类型设计的实现。该算法已经被广泛证明,通过科学文献12。

  1. 进行2D图像分析与EMAN2科学图像处理套件:http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16选择均匀颗粒(螺旋段)套螺旋重建。
    1. 选择冷冻电镜显微照片与straigHT和组织良好的螺旋管与数码相机的软件和可视化工具。
    2. 反转,标准化和筛选X射线像素的e2workflow.py图形用户界面,单粒子重建(SPR)选项:http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager
    3. e2helixboxer.py GUI导入倒,归一化和X射线像素滤波后的图像。有90%的重叠使用选择的FVIII-LNT斜管和段在256×256像素(2.9 A /像素):http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer
    4. 从原来的显微照片评价散焦和运用对比传递函数(CTF)的校正(仅相位校正),从与在e2workflow.py注册成立的e2ctf.py选项相同的显微照片螺旋片:http://blake.bcm。 edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf。
    5. 生成初始粒子(螺旋段)设置在e2workflow.py图形用户界面 - SPR选项:http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow。
    6. 计算2D类平均与e2refine2d.py算法应用参考免费K-均值分类选择同质的数据集具有相同的直径LNT和螺旋有序度( 图2),下面的脚本:'e2refine2d.py - ITER = 8 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - 路径= r2d_001 - 输入= INPUT.hdf - NCLS = 51 - simcmp =点 - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp =点 - classraligncmp =相 - classiter = 2 - classkeep = 0.8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager =均值 - normproj-classkeepsig',相应地改变NCLS值。
      1. 分类的初始数据在150类“NCLS = 151'超过8次迭代'classkeep = 0.8'设置,这意味着少于80%的相似性的类平均粒子被排除在给定的类别。 http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d
      2. 从班级的平均颗粒合并在e2display.py创建中间数据集显螺旋衍射。
      3. 分类中间数据的50类“NCLS = 51'设置为区分班级的顺序相同的直径和程度。
      4. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector:从班级的秩序e2display.py创造三维重建的最终数据集相同的直径和融合度的颗粒。
  2. 与迭代螺旋实时空间重构(IHRSR)算法进行螺旋重建,如Egelman 17,18所述。
    1. 估计上升,Δ狕从组合傅立叶FVIII-LNT螺旋(一)转变的最终数据集的颗粒。
    2. 通过运行并行IHRSR改进的恒定Δ狕定义方位角ΔΦ(°),从5增加ΔΦ76;在5°增量60°。
    3. 运行100个连续IHRSR周期每个最后的数据设置一个无特色缸作为初始体积和3.2.1中定义的初始螺旋参数Δ狕和ΔΦ。和3.2.2。
    4. 检查最终的体积为从最终的数据集的二维分类类平均值和从最终IHRSR重建的突起之间的螺旋参数和对应的收敛性。
    5. 强加对称性的最终三维重建,对应于在最终的非对称三维体积中观察到的不对称单元分配:4倍的人FVIII-LNT和5倍的猪FVIII-LNT。再跑100优化循环,以产生最终的对称三维重建。
    6. “e2proc2d.py <infile> <outfil:首先把相应的数据在奇数和偶数设置计算两个卷傅立叶壳牌相关曲线e>的 - 分裂= 2'。然后在3.2.3中所述运行100 IHRSR连续改进。计算从奇数和偶数的数据集创建的三维体积的FSC:'e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc'。
  3. 可视化和分类的FVIII-LNT卷在加州大学旧金山分校的嵌合体。
    1. 从步骤3.2.5打开最终卷。在加州大学旧金山分校的奇美拉,并在工具>体数据> VOLUME VIEWER选项的轮廓级别设置为0.005。
    2. 在工具>体数据>分类地图,在段映射选项卡中选择卷,然后单击段段音量。
    3. 对应于一个单元电池组片段通过选择用Ctrl + Shift并单击组。
    4. 通过单元格颜色的部分和与行动>色彩选项螺旋线来强调结构特点。

4。电子断层扫描

  1. 负染的FVIII-LNT样品制备
      <李>准备FVIII-LNT样本作为冷冻电镜实验。
    1. 辉光放电碳包覆的300网目铜网上(碳朝上)中的O 2和H 2气体,持续10秒,在50的混合物中W的用于冷冻电镜实验。
    2. 申请一滴2.5微升的FVIII-LNT悬浮液与6纳米的胶体金粒子到电网,吸干多余的液体,并通过施加2分钟,5微升的1%乙酸双氧铀溶液负染色。吸干多余的液体和空气干燥的网格。
  2. 电子断层扫描数据采集
    1. 转移网格成单一倾斜支架。
    2. 传输在电子显微镜支架。
    3. 与SerialEM软件19在2°增量的角度范围为-60°〜+60°,可拍摄具有CCD相机在52,000 X有效放大倍率自动采集系列倾斜,-6到-10微米的散焦和150电子剂量 - 170元素ctrons /每断层2·s以下。
  3. FVIII-LNT的电子断层扫描重建
    注:在重构4.2收购pFVIII-LNT和的hFVIII-LNT倾斜系列。与IMOD软件继教程ETomo选项:http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html
    1. 使用一个终端窗口,打开3DMOD的断层。 http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html。
    2. bin中的断层图像由4与IMOD BINVOL命令以减小X线断层图的大小。
    3. 选择适当的角度旋转沿Y轴的脂质纳米管在使用IMOD ROTATEVOL命令的离散化层析X射线照片。
    4. 旋转全断层与IMOD ROTATEVOL命令。
    5. 裁剪沿Y轴与IMOD CLIP resize命令面向选定的脂质纳米管。
    6. 打开裁剪子断层扫描与3DMOD。
    7. 点击该断层图像沿想象的因子VIII分子的排列切片在Z轴方向和沿Y轴在子断层图像体。

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Representative Results

重组人类和猪FVIII被成功地组织上的螺旋形带负电荷的单一双层LNT,类似的活化的血小板表面人类和猪FVIII-LNT的螺旋机构通过所收集的数字显微图是一致的( 图2)。控制LNT和人类和猪FVIII-LNT螺旋管被选择和分割的e2helixboxer.py GUI和与e2workflow.py GUI,单一粒子的选择( 表1)中创建的初始数据集。

膜结合人和猪FVIII-LNT的螺旋顺序从傅立叶进行评价的类平均值与e2display.py GUI(EMAN2)( 图3)的变换。在最佳的控制LNT 2D类平均脂质双分子层是明确界定。内和外小叶和膜的疏水性芯的较低的密度是清晰可见的( 图3B和3C)之间的螺旋机构的变型。更显着的扭曲的人FVIII-LNT螺旋管表示相邻的膜结合的FVIII分子之间的蛋白质-蛋白质相互作用是一致的不同的两个形式的FVIII( 图3B3C)。从类平均值显示出良好的螺旋机构(螺旋衍射图样)的颗粒被合并在e2display.py GUI,以形成中间颗粒组( 表1)。从中间粒子集将颗粒再次分为50类具有相同的约束。从类平均具有相同直径的颗粒在最终的数据被合并组( 表1)。

对于人类和猪FVIII-LNT初始三维重建进行了从最终人和猪FVIII-LNT数据集1,000代表性的颗粒。百连续IHRSR迭代已运行的每个三维重建与无特色缸(160内,500埃外径),作为初始音量。从组合的傅立叶计算轴向上升(ΔZ)变换的螺旋片(颗粒设置)的等于41埃对于人FVIII-LNT和36埃猪FVIII-LNT( 图4A4B)。初始方位角(ΔΦ)从迭代搜索定义估计为40.0°的人FVIII LNT和35.0°的猪FVIII-LNT。最终卷检查类平均值和预测从最终重建的之间的螺旋参数和对应的收敛减税,也跟随在5中描述的标准。所选择的三维重建和相应的螺旋参数强加作为初始容量和初始螺旋参数为100周期其会聚到4启动螺旋机构的人FVIII-LNT与Δ狕= 41.1埃,ΔΦ第二IHRSR细化= 42.0°和一个五开始螺旋机构,为猪FVIII-LNT与Δ狕= 35.5Å,ΔΦ= 34.8°。最后100 IHRSR迭代征收4倍和5倍螺旋对称的人类和猪FVIII-LNT重建分别进行了初始卷和从最后不对称IHRSR改进( 图4C4D)相应的螺旋参数。最终卷展8人FVIII和周围的螺旋轴( 图5A)举办10猪FVIII膜结合分子。每个人FVIII分子被翻译41.2埃,与前一个旋转42.0°,每个猪FVIII分子被翻译35.9埃,旋转35.2度与前一个对应于最终三维重建( 图5B)的螺旋参数。

重建的电子X线断层确认在相同实验条件下获得的人类和猪FVIII-LNT之间的螺旋机构的差异。从重建的断层图像和三维体积从螺旋重建的方向垂直于螺旋轴观察的俯视图的比较,进一步证实了精制的IHRSR螺旋参数( 图6)的三维重建的正确性。非对称的二维晶胞尺寸的人FVIII LNT三维重建是:a = 17.8纳米,B = 8.2,γ= 84°,为猪FVIII-LNT三维重建:一个=18.4,B = 7.2,γ= 70°( 见图6)。组织膜结合的二维晶体人FVIII的晶胞尺寸为a = 8.1,B = 7.0,γ= 67°,其对应于所涵盖的朝向膜表面20观看1 FVIII分子的表面上。比较组织在2D和螺旋晶体之间的FVIII晶胞的尺寸表明,人类和猪的FVIII分子形成二聚体,当螺旋有组织地对LNT的表面。

图1
图1。结构分析流程图。步骤遵循基于在EMAN2 16日实施免费参考比对算法的二维分类分析,盘旋在蓝色。步骤遵循的三维分析进行了迭代螺旋实空间重构算法(IHRSR)被红色圆圈标记。迭代IHRSR周期被表示为用虚线箭头表示。

图2
图2。脂质纳米管(LNT)的有和无约束的FVIII。A.控制LNT。B.人力FVIII-LNT。C.猪FVIII-LNT 的Cryo-EM数码显微照片。(4,096 x 4,096像素,2.9 A / PIX) 。在其中FVIII-LNT悬浮在无定形冰碳膜孔的边缘标有白星。蛋白质和脂质密度为黑色。 512×512的放大视图(插图)裁剪区域(白色虚线正方形)示出了在人类和猪FVIII的螺旋机构的不同,分别。比例尺为100nm。ig2highres.jpg“目标=”_blank“>请点击这里查看该图的放大版本。

图3
图3。代表2D类的平均值(上排)和相应的傅立叶变换(下排)从中间颗粒组表1)分为50类。A.控制LNT B.人力FVIII-LNT C.猪FVIII-LNT。类号,并列入每类粒子数表示。在人与猪之间的FVIII螺旋秩序的差别清楚地看到图像,并通过傅里叶得到的衍射图案转化这些图像的确认。 请点击这里查看更大的版本这个数字。

图4
图4。人和猪FVIII-LNT。A.联合傅立叶变换的三维螺旋重建改造从1000螺旋区段。在第一和第二层线都集中在1/82 -1和1/41 A -1人FVIII-LNT,并在1/72 -1和1/36 A -1为猪FVIII-LNT(白箭头)。B.表面人类的粉红色表示(Δ狕= 41.1Å,ΔΦ= 42.0°)和猪蓝(Δ狕= 35.9Å,ΔΦ= 35.2°)的FVIII-LNT 3D螺旋重建。两卷都在0.005水平等高线(最小密度为0,最大密度0.02,计算在加州大学旧金山分校门铃RA,成交量浏览器选项21)。在FVIII-LNT管的长度为256像素,2.9 A /像素。C.傅立叶壳牌相关(FSC)地块为人类和猪FVIII-LNT显示20.5的分辨率在FSC = 0.5。

图5
图5。人和猪FVIII-LNT螺旋重建, 图4B所示的人和猪FVIII-LNT。分段表面表示的螺旋机构 。该卷将实行4折对称的人FVIII LNT和五重对称的猪FVIII-LNT后分割。不对称单元的颜色编码黄-红的人FVIII-LNT和蓝绿色为随着对人类的正方形表示的螺旋轴,并作为猪FVIII-LNT。 次数五边形的猪FVIII-LNT。的人FVIII-LNT结构显示围绕外LNT膜组织8分子和猪FVIII结构显示围绕外LNT膜组织10的分子,垂直于螺旋轴表示与数字。B.次数。该人FVIII LNT是4开始螺旋结构和猪FVIII-LNT有5开始螺旋结构。个体1起动螺旋是表示用数字和颜色编码。我们强调从各结构用(*)和绿线螺旋线中的一个。比例尺为20纳米。

图6
图6。螺旋断层扫描和三维重建的人FVIII LNT(A)和猪FVIII-LNT(C)螺旋三维重建的比较显示perpendicular到螺旋轴。每个单元电池和个别螺旋是颜色编码的, 如图5。乙 D。是三维断层扫描重建,垂直于螺旋轴观察的密度表示。二维晶格反射的FVIII分子的螺旋排列显示与绿线。

样品 CLNT 的hFVIII-LNT pFVIII-LNT
最初的显微照片 61 474 542
初始粒子集 29113 60395 64665
失焦(纳米) -4,051±502 -3,643±737 -3,443±1,086
中级粒子套 25,907 27,305 22,773
最终的粒子集 25,907 10,455 10,430

表1中。以下对图3的流程图中给出的算法二维分析的统计信息。

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Discussion

在此工作的方法呈现高度同源性的蛋白质的2膜结合的组织之间进行区分:人和猪FVIII自组装于在人体中所遇到的条件下的脂质纳米管。

在描述的过程中,人类和猪FVIII成功举办螺旋状脂质纳米管,这是最关键的一步。下一个关键步骤是通过快速冷冻在接近液态氮的温度保持在样品中非晶薄的冰。保留在无定形冰和液氮温度下的样品保持水合的螺旋管和蛋白 - 脂质大分子装配体的生理活性。最后关键的一步是获得足够数量和质量的Cryo-EM数据的高分辨率三维结构在接近液氮温度。在接近液氮温度采集数据进一步防止样品脱水的高Vacuum从电子束显微镜和辐射损伤。

计算FVIII的膜结合结构的第一个关键步骤是通过施加二维参考免费分类和组合的颗粒从班级的顺序相同的直径和度以获得均匀的颗粒(螺旋片)集。第二个关键的步骤是施加合适的初始体积和螺旋参数(上升和方位角)的螺旋重建。第三和最后的关键步骤是通过比较由螺旋和电子断层扫描(不强加对称性)相同的试样的重建得到的三维地图来验证螺旋结构。

所提出的方法是独特的,其要解决的膜相关的蛋白质在接近生理条件的功能性结构的能力。在我们的实验室开发的LNT可成功地用作功能性膜结合的凝血因子的螺旋机构的平台和实现比FVIII组织中膜结合的二维晶体和单粒子更好的分辨率。我们的目标是通过提高的最终颗粒集的均匀性和质量,进一步提高我们的螺旋重建的分辨率。收集更多的冷冻电镜显微照片在FVIII-LNT螺旋丝更好的Cryo-EM条件(场发射枪,能量过滤器,DE摄像头探测器),因此,包括较大的初始粒子集的二维重建将实现这一目标。提高FVIII-LNT螺旋装配和三维重建算法将使我们获得亚纳米级和近原子分辨率,这将明确地定义这个关键的膜结合的组织凝血蛋白。

组织螺旋同源性FVIII的形式给我们也opportuniTY表征如何在序列差异可以关联到在结构和功能上的差异。解决人类和猪FVIII膜结合的结构,通过本文所述的方法可以帮助识别序列,修改时将提高重组FVIII功能。这方面的知识将用于药物开发的两种血栓与止血领域显著的临床意义。

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Disclosures

作者宣称,他们有没有竞争经济利益,他们可以直接就任何发表在本手稿的程序进行联络。

Acknowledgements

10SDG3500034和UTMB-NCB启动资金,SSM:这项工作是由美国心脏协会国家科学家开发资助。作者承认冷冻电镜和科学计算设施的西利结构生物学中心在UTMB( www.scsb.utmb.edu ),以及博士。史蒂夫Ludtke和Ed Egelman的帮助,二维和三维螺旋重建算法。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JEM2100 with LaB6 JEOL Ltd. JEM-2100 operated at 200 kV
with TEMCON software JEOL Ltd.
Gatan626 Cryo-holder Gatan, Inc. 626.DH cooled to -175 °C
with temperature controler unit Gatan, Inc.
Gatan 4K x 4K CCD camera Gatan, Inc. US4000 4,096 x 4,096 pixel at 15 μm/pixel physical resolution
Solarus Model 950 plasma cleaner Gatan, Inc.
Vitrobot Mark IV FEI
Carbon coated 300-mesh 3 mm copper grid Ted Pella 01821 plasma cleaned for 10 sec on high power
Quantifoil R2/2 300 mesh Electron Microscopy Sciences Q225-CR2 Carbon coated 300-mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes 
Uranyl acetate dihydrate Ted Pella 19481 1% solution, filtered
Galactosyl ceramide Avanti Polar Lipids Inc. 860546
Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine Avanti Polar Lipids Inc. 840035
EM software Digital Micrograph Gatan, Inc. http://www.gatan.com/DM/
EM software EMAN free download http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ 
EM software Spider free download http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
EM software IHRSR free download Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/
EM software (IMOD) free download http://bio3d.colorado.edu/imod/ 
EM software (SerialEM) free download ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/
UCSF-Chimera free download http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html

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References

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