Dimostrazione di un multi-resistente ai farmaci

Immunology and Infection

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Summary

Un microarray amplificazione combina asimmetrica amplificazione PCR e ibridazione microarray in una sola camera, che semplifica significativamente workflow microarray per l'utente finale. La semplificazione del flusso di lavoro microarray è un primo passo necessario per la creazione di sistemi diagnostici basati su microarray, che possono essere utilizzati di routine in ambienti inferiore di risorse.

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Linger, Y., Kukhtin, A., Golova, J., Perov, A., Qu, P., Knickerbocker, C., Cooney, C. G., Chandler, D. P. Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray. J. Vis. Exp. (86), e51256, doi:10.3791/51256 (2014).

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Abstract

La semplificazione del flusso di lavoro microarray è un primo passo necessario per la creazione di sistemi diagnostici basati su microarray-MDR-TB che possono essere utilizzati di routine in ambienti inferiore di risorse. Un microarray di amplificazione combina asimmetrica PCR, selezione del formato di destinazione, l'etichettatura di destinazione e microarray ibridazione all'interno di un'unica soluzione e in una sola camera microfluidica. Un metodo di elaborazione batch è dimostrato con un 9-plex master mix asimmetrico e bassa densità elemento gel microarray per la genotipizzazione multi-droga Mycobacterium tuberculosis resistenti (MDR-TB). Il protocollo qui descritto può essere completato in 6 ore e fornire corretta genotipizzazione con almeno 1.000 equivalenti cellulari di DNA genomico. Incorporando on-chip fasi di lavaggio è fattibile, che si tradurrà in un metodo amplicone interamente chiuso e sistema. Il grado di multiplazione con un microarray amplificazione è in definitiva limitata dal numero di coppie di primer che possono essere combinati in un unico master mix e ancora ottenere una sensibilità desiderata e metriche di performance specificità, piuttosto che il numero di sonde che sono immobilizzati sulla matrice. Allo stesso modo, il tempo di analisi totale può essere accorciato o allungato in funzione dell'uso specifico previsto, domanda di ricerca, e limiti desiderati di rilevamento. Tuttavia, l'approccio generale semplifica notevolmente workflow microarray per l'utente finale, riducendo il numero di fasi di elaborazione manualmente intensivo e richiede tempo, e fornisce un percorso biochimico e microfluidica semplificata per tradurre diagnostici basati su microarray nella pratica clinica di routine.

Introduction

Rilevamento caso precoce e un trattamento rapido sono considerate le strategie di controllo più efficaci per ridurre Mycobacterium tuberculosis (MTB) trasmissione 1, e ora c'è un ampio consenso nella comunità TB che un punto di assistenza (POC) o in prossimità POC test per diagnosticare contemporaneamente TB ed è necessaria resistenza ai farmaci (DR). Tecnologie come GeneXpert di Cefeidi e di altri test di amplificazione degli acidi nucleici riducono il tempo di diagnosi per molti pazienti affetti da tubercolosi, e di fornire una rapida read-out che indica la resistenza alla rifampicina o mutazioni selezionate che conferiscono resistenza agli altri prima o farmaci di seconda linea 2. Sebbene i test di amplificazione in tempo reale e di acido nucleico isotermica sono progettati per identificare le mutazioni di resistenza ai farmaci che portano a MDR-TB, lo spettro di mutazioni che scoprono è spesso insufficiente per progettare un regime individualizzato farmaco corrispondente al profilo farmacoresistenza del paziente, e vincoli tecnici connessidi ottica cross-talk o la complessità di amplificazione e di reporting chimiche 3-7 maggio limitare il numero di loci o mutazioni che vengono rilevati. Così, tecnologie di rilevazione con una maggiore capacità di multiplexing sono necessari per colmare le lacune note nella diagnostica POC MDR-TB.

Microarray e le Hain saggi sonda linea OMS-omologati possono affrontare il "gene multipla, mutazioni multiple" sfida di diagnosticare MDR-TB 8-29. Purtroppo, questi, piattaforme di rilevamento multiplex a base di ibridazione-usano più fasi, complicato, e protocolli open-ampliconi che richiedono una formazione significativa e competenza in tecniche molecolari. Il microarray di amplificazione 30 è stato progettato per affrontare alcuni di questi microarray flusso di lavoro e le preoccupazioni operative. I principi fluidici di semplificazione sono per amplificare, ibridare, e individuare gli obiettivi di acido nucleico all'interno di una singola camera di microfluidica. L'utente introduce i mas acidi e amplificazione dell'acido nucleicoter miscela in una camera fluidico con una pipetta e attiva il protocollo di cicli termici. Per il metodo di elaborazione batch mostrato qui, microarrays sono successivamente lavati in soluzione bulk, essiccati, e ripreso. Questo studio dimostra la funzionalità di un microarray di amplificazione mediante test di MDR-TB microarray per rpoB (30 mutazioni), katG (2 mutazioni), inhA (4 mutazioni), rpsL (2 mutazioni), embB (1 mutazione), IS1245, IS6110 , e un amplificazione interna e controllo ibridazione. Almeno una coppia di sonde microarray (di tipo selvatico (WT) e single-nucleotide mutanti (MU)) è incluso per ogni mutazione di interesse. Acidi nucleici purificati da multi-farmaco resistente M. tubercolosi sono dal ceppo TDR Tubercolosi Bank 31. Microarrays elemento Gel sono realizzati su substrati di vetro per copolimerizzazione essenzialmente come descritto altrove 32, tranne che usiamo 4% monomero e 0,05 mm ciascuna sonda nel polymerizmiscela zione. Array sono circondati da una guarnizione 50 ml prima dell'uso. Dopo cicli termici, di ibridazione e di lavaggio gradini, microarrays amplificazione vengono esposte su un analizzatore portatile Akonni. , Intensità di segnale integrati Sfondo correzione sono ottenuti dal greggio. Immagini tif utilizzando un algoritmo cerchio fisso. Rumore per ciascun elemento gel è calcolato come tre volte la deviazione standard degli sfondi posto locale. Obiettivi del gene sono in genere considerati rilevabile per il rapporto segnale-rumore (SNR) valori ≥ 3. Per determinare la presenza o l'assenza di una specifica mutazione in ogni gene o codone, un rapporto discriminante è calcolato dai valori SNR (WT-MU) / (WT + MU). Rapporti discriminanti <0 sono indicativi di un farmaco-resistenza mutazione al locus, mentre i rapporti> 0 sono indicativi della sequenza wild-type.

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Protocol

Per i laboratori che seguono le precauzioni universali della PCR, è operativamente più efficace per includere diversi microarrays di amplificazione e guarnizioni per substrato e lavare tutti i microarrays amplificazione simultaneamente in un contenitore di massa, come descritto qui. Formati di consumo sono disponibili per l'esecuzione di post-amplificazione passi microarray di lavaggio in modo del tutto sigillato, prova amplicone chiuso, come riportato altrove 30,33.

1. Setup

  1. Estrarre e purificare acidi nucleici dal campione in appropriate condizioni di biosicurezza con un metodo di scelta. Il requisito è che gli acidi nucleici essere di purezza sufficiente per asimmetrica, multiplex PCR.
  2. Preparare lavoro pulendo le superfici e le attrezzature con soluzioni decontaminanti.
  3. Mettere reagenti di amplificazione in ghiaccio o piastra fredda.
  4. Etichettare una sterile provetta da microcentrifuga 1,5 ml per il master mix di amplificazione, e etichettare una sterile 0,2 ml microcentrifuga tuessere per ciascun campione.
  5. Dopo reagenti vengono scongelate, brevemente vortice e raccolgono contenuto al fondo della provetta con un impulso-spin in una mini-centrifuga. Non vortice Taq polimerasi. Flick delicatamente il tubo per mescolare e seguire con un impulso-spin in mini-centrifuga.
  6. Preparare una master mix di amplificazione utilizzando i volumi ogni campione di reazione mostrati in Tabella 1. Per tenere conto di eventuali imprecisioni pipettaggio, preparare almeno un altro volume di reazione rispetto al numero totale di campioni in lavorazione. Si noti che il master mix contenente ulteriori Taq polimerasi, al di là di quanto previsto con il tampone PCR muliplex. Aggiungere solo il controllo di amplificazione / inibizione per il mix master dopo tutti gli altri reagenti sono combinati, ei tubi stock reagenti restituiti allo stoccaggio.
Reagente Per-Sample Volume (ml) <strong> Finale []
Mulitplex PCR Buffer con HotStar Taq Plus. 25 1x
Albumina di siero bovino (BSA) 0.55 0,6 mg / ml
Formammide 3.8 7,6%
Taq polimerasi aggiuntive 0.8 unità / ml (4 unità totale)
MDR-TB miscela di primer 15.75 -
RNase-free H 2 O 2.1 -
Amplificazione / Inibizione controllo 1 5,0 fg / pl
Totale 49

Tabella 1. MDR-TB amplificazione microarray maestro di composizione della miscela.

  1. Vortex il master mix e raccogliere contenuti al fondo della provetta con un impulso-spin in una mini-centrifuga.
  2. Combina 49 ml di master mix e 1 ml di M. tubercolosi DNA per ciascuna delle provette per campioni dal punto 1.4, sopra. Per un esterno, nessun controllo template (NTC), usare 1 ml di acqua per biologia molecolare al posto del M. tubercolosi campione di DNA. Vortex e impulso-spin tubo (s) una volta terminato.

2. Caricare Amplificazione Microarray

  1. Aggiungere 48 ml di ogni master mix / campione sul centro dei rispettivi microarrays, facendo attenzione a non toccare il microarray stessa.
  2. Posizionare un vetrino sulla parte superiore della guarnizione di microarray e di tenuta, facendo attenzione a non intrappolare bolle d'aria nella camera di microarray. Le bolle d'aria possono influenzare negativamente l'efficienza di amplificazionee possono creare artefatti o rumore nell'immagine microarray successivo in.

3. Ciclismo termica

  1. Una volta che tutti i microarrays vengono caricati con campione, posto substrati sul termociclatore blocco piatto. Assicurarsi che l'opzione coperchio riscaldato è "Off". Attrezzature ottenute da Akonni Biosystems sarà già prequalified per l'uso. In caso contrario, è molto importante verificare che il termociclatore blocco piatto (s) fornire (s) uniforme, riscaldamento coerente in tutti i substrati di microarray.
  2. Aprire il software termociclatore, selezionare il programma appropriato, immettere "50 microlitri" per il volume di reazione e avviare la corsa. Il protocollo cicli termici qui descritto è costituito da:
    Cicli termici Steps
    1 88 ° C 5 min
    2 88 ° C 30 sec
    3 55 ° C 1 min
    4 65 ° C 30 sec
    5 Ripetere i passaggi (2-4) per 50 cicli
    6 65 ° C 3 min
    7 55 ° C 3 ore
  3. Il numero totale di cicli termici e 55 ° C dopo l'amplificazione tempo di mantenimento sono variabili indipendenti che l'utente può modificare, se necessario o opportuno per l'esperimento specifico. Poiché il master mix MDR-TB crea asimmetrici amplificati (prevalentemente a singolo filamento), di solito è utile includere più cicli termici che altrimenti potrebbero essere utilizzati per un esponenziale protocollo di amplificazione PCR convenzionale.
  4. Quando il programma ciclismo e ibridazione termico è completa, terminare il programma, rimuovere i microarrays amplificazione, chiudere il software, e spegnere il termociclatore (s).

4. Wash and Dry

  1. Per il lavaggio fino a 24 supporti contemporaneamente, preparare almeno 250 ml 1x PESS - 0,1% Triton X-100 tampone di lavaggio, e due contenitori con almeno 250 ml di acqua deionizzata o grado Milli-Q ciascuno. Il tampone di lavaggio può essere preparato in anticipo.
  2. Rimuovere con cautela la polizza di copertura e la guarnizione di ogni amplificazione camera di microarray usando pinze flat-end. Questo passo è il punto in cui c'è il maggior rischio di danneggiare fisicamente array di elementi gel. Utilizzare adeguati controlli di contaminazione PCR per prevenire la diffusione degli acidi nucleici amplificati all'interno dell'ambiente di lavoro.
  3. Mettere substrati microarray in un supporto istologia diapositive e inserire tutte le diapositive nel cestino di lavaggio contenente il tampone di lavaggio. Coprire il contenitore con un coperchio.
  4. Lavare microarray per 10 minuti a temperatura ambiente con agitazione.
  5. Immergere i microarrays tre volte in ciascuna delle due lavaggi successivi di deionizzata oAcqua di grado Milli-Q, e aria secca.

5. Imaging

Il asimmetrica miscela di innesco MDR-TB genera ampliconi Cy3-etichettati. Microarrays elementi Gel può essere ripreso con qualsiasi imager microarray livello in grado di immagini Cy3. La seguente procedura di imaging è specifica per il mix MDR-TB maestro, campo dx2100 imager portatile e software di analisi automatizzata fornito da Akonni.

  1. Assicurarsi che il cavo ethernet dalla termocamera è collegata al computer.
  2. Accendere la termocamera. L'interruttore di alimentazione si trova sul pannello posteriore dello strumento. LED blu sulla parte anteriore della termocamera si accendono quando imager è acceso.
  3. Accendere il computer.
  4. Sul desktop del computer, fare doppio clic sull'icona del software per lanciare il software automatizzato di analisi delle immagini.
  5. Attendere che il software per stabilire una connessione con la fotocamera imager. Una volta stabilita la connessione, il pulsante Analizza diventa disponibile, e ilmessaggio "Connection Successful" apparirà nell'angolo in basso a sinistra dello schermo.
  6. Inserire il microarray di amplificazione essiccato con il microarray rivolto verso l'utente, e verso la lente obiettivo. Se il microarray è correttamente orientato rispetto alla lente e telecamera, il software di analisi automatizzata mancherà di inserire una griglia l'immagine di fluorescenza su.
  7. Chiudere lo sportello di accesso. Una anteprima immagine sarà disponibile sullo schermo del computer.
  8. Selezionare lo script analisi MDR-TB dal menu a tendina e inserire il tempo di esposizione desiderato (in millisecondi). Un tipico punto di partenza per elementi gel microarrays amplificazione è 100-500 msec.
  9. Pixel saturi verranno visualizzati l'immagine di anteprima in rosso. Regolare il tempo di esposizione per ridurre al minimo il numero di pixel saturi all'interno dei singoli punti.
  10. Fare clic su Analizza per acquisire e analizzare l'immagine di fluorescenza. Il software metterà automaticamente unMDR-TB griglia specifica-test sull'immagine, estrarre intensità integrata e valori di fondo, e riferire i risultati resistenza ai farmaci e genotipizzazione. L'analisi automatizzata in genere richiedere alcuni secondi. Per le immagini stimolanti che contengono graffi, polvere, artefatti a fluorescenza o danni fisici alle caratteristiche microarray, il software può richiedere fino a 1 minuto per completare l'analisi.
  11. Una volta completata l'analisi, fare clic su Salva, selezionare la cartella di destinazione, digitare un nome di file e fare clic su OK. Dati di microarray sottostanti vengono salvati come file xls. E possono essere esportati per analisi off-line, se lo si desidera.
  12. Una volta completata l'analisi, rimuovere il microarray di amplificazione dal imager, e fare clic su Nuovo per avviare l'analisi successiva.
  13. Al termine la raccolta dei dati, chiudere il software, spegnere il computer e spegnere l'imager.

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Representative Results

Analisi di immagine qualitativa può fornire indicazioni in fonti di rumore sperimentale o variabilità che sono difficili da individuare in tabelle di dati generati dal software automatizzato di analisi di immagine. Quindi, può essere utile verificare visivamente che: 1) tutti gli elementi gel sono integro e non danneggiato, 2) lo sfondo globale è esente da artefatti fluorescenti che possono influenzare il segnale individuo a valori di rumore (SNR), 3) non vi è alcuna prova di formazione di bolle o non uniforme di amplificazione / ibridazione attraverso l'array, e 4) che il software ha identificato con precisione tutti i punti dell'immagine microarray su. Esempio MDR-TB immagini amplificazione microarray sono mostrati in Figura 1, che illustra una matrice di alta qualità e artefatti che possono sorgere a causa di danni fisici o bolle durante i cicli termici. Standard software di analisi dell'immagine microarray è di solito in grado di collocare una griglia ed estrarre l'intensità integrale e dati in background anche da immagini di scarsa qualità come shproprio nella figura 1B, quindi spetta al ricercatore di stabilire criteri e parametri di controllo di qualità per accettare o rifiutare le immagini di microarray da ulteriori analisi. Ridondanza sonda può contribuire a migliorare questi problemi. Tuttavia, un, MDR-TB algoritmo di reporting amplificazione microarray diagnostico completamente automatizzato altrimenti dichiarare il test dalla Figura 1B come "non valido".

Valori SNR Amplificazione microarray per una serie di diluizioni di tipo selvatico H37Ra DNA genomico sono mostrati nella Tabella 2. A 6.25 pg ingresso DNA genomico per reazione o circa 1,25 x 10 3 cellule equivalenti, tutte le sonde di tipo selvatico sono prontamente rilevate. Valori di SNR per ciascuno dei amplificazione e di inibizione controlli interni variava da 98.48 (rpoB) a 967,24 (Akonni fornito di controllo interno positivo), indicando che tutti gli obiettivi gene della reazione di amplificazione multiplex asimmetrica sono amplificati e rilevabile. Nocontrolli template sono risultati negativi (SNR <3) per tutte le sonde del microarray di amplificazione. Rapporti di genotipizzazione a 6,25 pg di DNA di ingresso variava 0,18-1,00 per tutte le coppie sonda WT / MU, che dimostra il corretto comportamento di WT e MU sonde e appropriato genotipizzazione.

Dati di genotipizzazione rappresentativi per un gruppo di isolati di riferimento Organizzazione Mondiale della Sanità di genotipo noto sono riportati nella Tabella 3. Se un polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) è rappresentata sul microarray elemento gel, allora il test di amplificazione microarray esattamente rileva la corrispondente mutazione nel MDR -TB genoma. Alcune delle sonde microarray di amplificazione sono anche sensibili alle mutazioni vicino confinanti che non sono esplicitamente rappresentati sull'array come sonda unico. Ad esempio, isolare TDR-0129 contiene una mutazione nel gene S531E rpoB, ma non vi è una sonda specifica sul microarray di amplificazione per S531E. Tuttavia, altre cinque sonde SNP targeting codone 531 indicano che una mutazione è presente nel codone 531 - microarray di amplificazione quindi indica correttamente che questo isolato è resistente alla rifampicina. Sensibilità simile alla mutazione rpoB S513W è evidente per isolare TDR-0148. D'altro canto, alcune sonde SNP non sono sensibili a mutazioni vicini vicini, come illustrato da isolare TDR-0148 e la mutazione rpoB S512G, e isolare TDR-0011 e la mutazione katG S315R. Abbiamo il sospetto che questo tipo di comportamento sonda è una conseguenza della struttura secondaria e terziaria nella amplicone a filamento singolo e / o sonda 34, e non è qualcosa che può essere previsto a priori. Tuttavia, la sensibilità della sonda a mutazioni vicini vicino è analoga all'uso di segnali molecolari sloppy per rilevare mutazioni multiple di resistenza ai farmaci con un insieme minimo di PCR in tempo reale sonde 35,36, e può essere diagnostico vantaggiosi forniti il test non genera falsi positivi relativa alla sensibilità ai farmaci fenotipica.

Figura 1
Figura 1. (A) immagine microarray Esempio amplificazione per 100 pg tipo selvatico M. tuberculosis H37Ra DNA genomico e un tempo di esposizione di 100 msec. Cy3 beacon (per Gridding automatizzato e software segmentazione) sono sulla periferia dell'immagine. (B) Immagine di un microarray di amplificazione che mostra un manufatto alone fluorescente derivante dalla formazione di bolle durante i cicli termici, e danneggiato gli elementi gel / detriti. Automatizzata del software di analisi delle immagini è ancora in grado di inserire una griglia ed estrarre i dati da questa immagine. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

<tr>
Azienda Numero di catalogo
Akonni Biosystems Informarsi
Qiagen # 206143
Qiagen # 201207
Qiagen # 206143
Thermo Fisher Scientific, Inc. # BP227-500
Sigma-Aldrich # 3B6917
Akonni Biosystems Informarsi
Akonni Biosystems Informarsi
Thermo Fisher Scientific, Inc. # BP1328-4
Thermo Fisher Scientific, Inc. # BP151-500
Technologies correnti, Inc. # BRSPRAY128
Decon Labs, Inc. # 8416
Azienda Numero di catalogo
Akonni Biosystems 100-20011
100-10021
Arrayit HTW
Thermo Fisher Scientific, Inc. # 10-300
VWR # 3365040
VWR # 93000-196
Pneumatico Central # 95630

Tabella 2. Materiali richiesti e attrezzature.

69 "> 329.09 <td class = "xl69"> 109,90 p: none "> 816,64
Codone Sonda
ID
Valori WT Probe SNR 500 pg 100 pg 50 pg 25 pg 12.5 pg 6.25 pg
rpoB 507 1 900,22 644,46 523,17 431,08 364,49 287,47
3 1.016,37 699,38 600,16 525,07 446,51 361,64
511 5 867,67 611,97 529,90 451,73 403,76 307,68
512 8 810,69 544,04 488,85 436,89 391,62 257,46 d>
513 11 824,36 547,04 496.00 472,01 408,96 242,25
515 15 715,48 536,59 416,96 335,81 267,48 189,10
516 17 723,83 496,44 402,95 270,10 201,98
522 27 674,37 413.33 360,40 316,75 236,19 153,40
524 29 269,46 153,69 117,71 118,02 110,13 51.22
526 31 136,37 82.63 76.76 53.61 37.76
531 44 219,92 136,31 109,16 96.18 80.58 26.44
533 51 130.54 83.60 76.03 63.47 61.35 41.54
rpsL = "Xl71"> 43 54 10.41 12.75 53.30 767,18 5.39 362,42
88 56 655,54 542,79 527,43 690,34 403,86 456,05
katG 315 58 1.037,03 873,46 974,83 811,79 876,47
embB 306 66 940,81 781,13 788,75 837,65 787,05 696,69
inhA 8 82 1.069,43 934,38 862,58 936,88 809,85 682 .56
15 85 1.111,66 931,88 918,22 957,87 795,72 723,16
17 87 1.114,49 926,03 920,60 970,70 854,15 744,41

Tabella 3. Rapporto segnale rumore per sonde di tipo selvatico e una serie di diluizioni di M. valori di SNR tubercolosi H37Ra DNA genomico.> 3 sono considerate rilevabili.

S copi "fo: keep-together.within-page =" always "> Tabella 4
Tabella 4. Dati di genotipizzazione rappresentativi di MDR-TB isolati di genotipo noto a 25 pg per l'amplificazione di reazione microarray. Asterischi indicano le mutazioni che non sono rappresentate da una sonda unica sul gel elemento microarray. WT = tipo selvatico sequenza di acido nucleico. Valori negativi (grassetto e ombreggiate) sono indicativi di una mutazione, e quindi fenotipica farmaco-resistenza. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il grado di multiplazione con un microarray amplificazione è infine dettata dall'efficienza del multiplex PCR asimmetrica, non microarray. Nella nostra esperienza, 10-12 coppie di primer uniche possono essere facilmente multiplexing in un formato di amplificazione microarray. Criteri di progettazione di primer e sonde convenzionali applicano a nuovi saggi, salvo che uno deve anche considerare potenziali interazioni tra acidi nucleici soluzione monofase e sonde immobilizzate microarray, l'efficienza termica del termociclatore, e comportamento ibridazione della sonda in un buffer di PCR che anche contiene primer PCR e manufatti a basso peso molecolare di amplificazione. Approcci amplificazione altamente multiplati come complesso amplificazione del genoma non favoriscono un protocollo di amplificazione microarray a camera singola per una serie di ragioni tecniche, comprese le interferenze tra esameri casuali e sonde immobilizzate, e l'ibridazione inefficace delle lunghe ampliconi doppio filamento. Ciè anche una inter-relazione tra facilità d'uso, tempo di analisi totale, e limiti di rilevazione che i singoli utenti dovranno considerare quando si progetta analisi personalizzata o utilizzando il test MDR-TB descritto qui. Per esempio, riducendo il numero di cicli di amplificazione e persino eliminando l'ibridazione fase di post-amplificazione ridurrà significativamente la durata complessiva, ma a scapito della sensibilità del test. D'altra parte, ottenendo un limite di rilevamento riproducibile copia 10 gene può richiedere più cicli di amplificazione o tempo di ibridazione, estendendo così il tempo di analisi totale oltre il singolo turno di lavoro.

I geni, mutazioni, imager, software di analisi e reporting algoritmo qui descritto sono illustrativo del metodo di amplificazione microarray e di sistema, piuttosto che una relazione sulle prestazioni analitiche e di utilità clinica. Ad esempio, il campione di partenza può essere espettorato, sedimenti decontaminati, culture solidi o liquidi - il requisitoper il microarray di amplificazione è il vantaggio che gli acidi nucleici estratti sono amplificabile da asimmetrica, multiplex PCR. Alcuni ricercatori o clinici potrebbero trovare poco o nessun valore clinico nel rilevare rpsL o mutazioni embB che conferiscono resistenza a streptomicina ed etambutolo, rispettivamente, solo la resistenza a rifampicina e isoniazide definire MDR-TB. Così, questi primer PCR e sonde microarray possono essere sostituiti con primer e sonde che colpiscono geni e mutazioni che conferiscono resistenza agli altri di primo e secondo line antibiotici. È possibile scrivere un algoritmo di segnalazione per fornire all'utente informazioni dettagliate di mutazioni specifiche che vengono rilevati in un dato campione, piuttosto che una semplice "resistenza rilevato" o risultato "resistenza non rilevato". Per i ricercatori interessati a utilizzare questo test specifico per analizzare M. tubercolosi isola, è anche possibile fornire dati di genotipizzazione anche se l'elemento IS6110 non è detected nel campione.

Indipendentemente dalle possibili di analisi e di reporting permutazioni, il microarray di amplificazione e il protocollo qui descritto è progettato per semplificare in modo significativo il flusso di lavoro microarray combinando più fasi di biologia molecolare in una singola reazione biochimica e la camera microfluidica. I dati rappresentativi dimostrano l'efficacia del metodo amplificando nove MDR-TB regioni genomiche e rilevando tali ampliconi asimmetriche con una bassa densità elemento gel microarray. Il protocollo qui descritto utilizza una procedura di lavaggio massa che richiede all'utente di rimuovere fisicamente la guarnizione e vetrino dal microarray di amplificazione prima del lavaggio, ed è quindi più adatto a ricerche uso applicazioni solo anziché diagnostica clinica. Come descritto altrove, tuttavia, è certamente possibile incorporare una fase di lavaggio on-chip utilizzando fluidica flusso laterale 33 e quindi mantenere un consumabile amplicone interamente chiuso, inclUding uno che può essere facilmente incorporato in un campione in risposta Partenza sistema diagnostico appropriato per applicazioni point-of-care.

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Disclosures

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) in concessione RC3 AI089106.

Acidi nucleici MDR-TB sono stati forniti dal / Mondo del Programma delle Nazioni Unite Programma di sviluppo Fund / Nazioni Unite Banca / Organizzazione Mondiale della Sanità Speciale per la Ricerca e la Formazione in malattie tropicali (TDR), Ginevra, Svizzera.

Ringraziamo il Dr. Tom Shinnick dei Centri statunitensi per il Controllo e la Prevenzione delle malattie per indicazioni sui geni e mutazioni specifiche da includere nel test del prototipo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips Akonni Biosystems Inquire
Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus Qiagen #206143
Taq polymerase Qiagen #201207
RNAse-free water Qiagen #206143 
Formamide Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP227-500
20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich #3B6917
5X concentrated MDR-TB primer mix Akonni Biosystems Inquire
500 fg uL-1 amplification and inhibition control Akonni Biosystems Inquire
20X SSPE Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP1328-4
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP151-500
Disinfecting Spray  Current Technologies, Inc. #BRSPRAY128
70% Isopropyl Alcohol Decon Labs, Inc. #8416
Microarray imager, with automated image and data analysis software Akonni Biosystems 100-20011
Thermal cycler with flat block insert Akonni Biosystems 100-10021
High-throughput wash station and slide holder ArrayIt HTW
Dissecting forceps Thermo Fisher Scientific, Inc. #10-300
Mini Vortexer VWR #3365040
Mini-centrifuge VWR #93000-196
Airbrush Compressor Kit Central Pneumatic #95630

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lemaire, J. -F., Casenghi, M. New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first. J. Int. AIDS Soc. 13, 40 (2010).
  2. World Health Organization. Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2012).
  3. Notomi, T., Okayama, H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucl. Acids Res. 28, e63 (2000).
  4. Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).
  5. Pritchard, C. G., Stefano, J. E. Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase. Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).
  6. Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350, 91-92 (1991).
  7. Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).
  8. Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance. Chin. Med. J. 3292-3297 (2012).
  9. Troesch, A., Nguyen, H., et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).
  10. Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).
  11. Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies. BMC Genomics. 9, 94 (2008).
  12. Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray. J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).
  13. Park, H., Jang, H., et al. Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array. J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).
  14. Yao, C., Zhu, T., et al. Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray. Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).
  15. Sun, A. H., Fan, X. L., et al. Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray. Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).
  16. Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).
  17. Fu, L., Shinnick, T. M. Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips. Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).
  18. Fu, L. M., Shinnick, T. M. Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips. J. Infect. 54, 277-284 (2007).
  19. Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).
  20. Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).
  21. Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance. J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).
  22. Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).
  23. Yue, J., Shi, W., et al. Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).
  24. Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).
  25. Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis. J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).
  26. Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance. J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).
  27. Padilla, E., Gonzalez, V., et al. Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains. J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).
  28. Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay. J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).
  29. Sekiguchi, J. -I., Nakamura, T., et al. Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains. J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).
  30. Chandler, D. P., Bryant, L., et al. Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics. Microarrays. 1, 107-124 (2012).
  31. Vincent, V., Rigouts, L., et al. The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).
  32. Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays. Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).
  33. Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents. Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).
  34. Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays. Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).
  35. El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).
  36. Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).

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