Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

Biology

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Summary

O contínuo crescimento incisivo do rato é um modelo para o estudo de renovação dos tecidos dentários a partir de células-tronco do epitélio dental (DESCs). Um sistema robusto para consistente e confiável a obtenção destas células a partir do incisivo e expandi-las in vitro é relatado aqui.

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Chavez, M. G., Hu, J., Seidel, K., Li, C., Jheon, A., Naveau, A., Horst, O., Klein, O. D. Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor. J. Vis. Exp. (87), e51266, doi:10.3791/51266 (2014).

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Abstract

Compreender os mecanismos celulares e moleculares subjacentes à regeneração do dente e renovação tornou-se um tema de grande interesse 1-4, eo incisivo rato fornece um modelo para estes processos. Este órgão notável cresce continuamente ao longo da vida do animal e gera todos os tipos de células necessárias de grupos ativos de células-tronco adultas alojados no vestibular (em direção ao lábio) e lingual (em direção à língua) regiões (CL) alça cervical. Apenas as células estaminais dentárias da CL labial dar origem a ameloblastos que geram o esmalte, o revestimento externo dos dentes, na superfície labial. Esta formação do esmalte assimétrica permite abrasão na ponta incisivo e progenitores e células-tronco no incisivo proximal garantir que os tecidos dentários são constantemente reabastecidos. A capacidade de isolar e cultivar essas células progenitoras ou tronco in vitro permite a sua expansão e abre as portas para inúmeras experiências não alcançáveis ​​in vivo, tais como htestes de rendimento igh de fatores de regulação de células-tronco em potencial. Aqui, descrevemos e demonstrar um método confiável e consistente para células de cultura do CL labial do incisivo mouse.

Introduction

Uma das características únicas dos vertebrados é a evolução dos dentes. O dente tornou-se um sistema modelo importante para muitas áreas de pesquisa, como as vias moleculares e especializações morfológicas relevantes a este órgão foram investigados a partir de várias perspectivas, inclusive no desenvolvimento e evolutivos biólogos 5. Mais recentemente, no campo da medicina regenerativa começou a obter informações valiosas usando o dente como um modelo. Em particular, a descoberta de células estaminais epiteliais dental tem sido um importante avanço 6-13.

Todos os roedores possuem dentes incisivos de crescimento contínuo, cujo crescimento é alimentado por células-tronco, tornando estes dentes um sistema modelo acessível para estudar regulação de células estaminais adultas. Experimentos de marcação na década de 1970 10,11, seguido por linhagem genética experimentos de rastreamento 8,9,12,14, demonstraram que DESCs residem na região proximal do incisivo. A hasteprogénie celular no compartimento epitelial em movimento lateral vestibular para fora do nicho putativo, conhecido como o ciclo cervical labial (CL), e contribui para uma população de células chamadas células (TA)-amplificação de trânsito (Figura 1). Especificamente, DESCs residem no epitélio externo do esmalte (OEE) e retículo estrelado (SR) 8,9,14, eo epitélio interno do esmalte (IEE) dá origem às células TA que progridem através de um número limitado de ciclos de células e, em seguida, mover distalmente ao longo do comprimento do incisivo (Figura 1). Os ameloblastos diferenciação na incisivo rato continuar a mover-se distalmente ao longo do incisivo a uma taxa excepcional de cerca de 350 mM de um único dia 15,16. Como eles se movem, as células se diferenciam em ameloblastos maduros e estrato intermediário células (SI). Depois de depositar a espessura total da matriz do esmalte, muitos dos ameloblastos sofrem apoptose, e as restantes células diminuem de tamanho e regular a maturação do esmalte <sup> 17. A linhagem de outros tipos de células no CL vestibular, tal como o SR, é menos claro, e dados em relação às células estaminais do mesênquima e 18 da CL lingual só agora começam a surgir.

Utilizando o modelo de ratinho incisivo, um certo número de grupos têm trabalhado para elucidar as vias genéticas e os processos biológicos envolvidos na renovação das células estaminais naturais com base em células de órgãos. No entanto, o CL labial contém um número relativamente pequeno de células, que se estima ser de cerca de 5,000 por incisivo do rato, o que facilita o trabalho com células primárias desafiando. Por conseguinte, têm sido feitos esforços para a cultura e expandir as células in vitro 6,16,19,20, a fim de abrir as portas para novos abordagens experimentais que não são atingíveis in vivo. O estudo mais recente mostrou que estas células podem tanto a auto-renovação e diferenciação em células que expressam amelogenina quando cultivadas 13. Aqui, descrevemos e demonstrar um método para poe cultura confiável e consistente de células do rato labial CL.

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Protocol

1. Dissecar mais baixos hemi-mandíbulas de rato adulto

  1. Antes de realizar este protocolo, obter aprovação institucional necessário e não deixe de cumprir com todas as orientações de cuidados de animais. Eutanásia animal utilizando padrão IACUC procedimentos aprovados. Para este trabalho asfixia com CO2 foi usado seguido por deslocação cervical.
    1. OPCIONAL: cabeça separada do resto do corpo usando uma lâmina de barbear.
  2. Retire a pele do lábio inferior para o decote.
  3. Usando um bisturi, fazer uma incisão entre os dois incisivos inferiores, que são vagamente conectados. Mediante a aplicação de pressão, a mandíbula será dividida em duas metades.
  4. Wedge o bisturi entre o côndilo da mandíbula e da articulação mandibular temporal e cortar ao lado do músculo da mandíbula para separar a mandíbula.
  5. Remova todo músculo, tendão, ligamento e até que apenas o osso permanece.

2. Isolar o Incisivo

  1. Usando um bisturi n º 15, Cuidadosamente raspar o osso em um ângulo de 45 ° a partir da extremidade distal para a extremidade proximal da região membranoso. Utilize a ponta do bisturi para escolher qualquer distância osso remanescente, incluindo os fragmentos de osso no bordo. Lentamente começam a escolher afastado na placa cortical lingual da mandíbula, começando logo abaixo do 3 º molar.
  2. Continue até que o incisivo é limpo, trabalhando com cuidado para a área que contém o CL.
  3. Remover pacote do nervo alveolar inferior.
  4. Faça um corte limpo primeiro remover o osso e tecidos proximal ao CL.
  5. Faça um segundo corte distal com o bisturi, aproximadamente abaixo do 2 º molar. A região proximal incisivo é então dissecadas para fora através da inserção do bisturi entre o osso e a superfície média do incisivo proximal. Isto deve ser feito com cuidado, de modo a não rasgar o tecido. O movimento é incisão proximal-distal.
    PASSO ALTERNATIVA:
    Remover o máximo possível de osso ao longo da zona superior da incisor. Uma vez que a área é limpa, remova cuidadosamente incisivo inteiro usando um tamanho de 5 fórceps para lidar com a parte de esmalte mais próximo a região CL.
  6. Colocar o tecido dissecado (ou CL isolado como na Figura 3E, ou incisivo inteira como no Passo alternativa 2.5) em 2% de colagenase em 1X PBS durante 3-4 horas a 4 ° C em uma placa de baixa aderência. Para 1-10 incisivos, utilizar 100 ul por poço de uma placa de 12 poços. Para maior do que 10 incisivos, utilizar 500 ul por poço de uma placa de 6 poços aderência baixa.

3. Microdissect the Loop Cervical Labial

  1. Remover região CL da colagenase e coloque em mídia DMEM/F12 frio.
  2. Puxe na extremidade inferior do CL usando tamanho 5 fórceps ou uma seringa de insulina (1 cc, 28 L C); mesênquima vai desmoronar enquanto o epitélio permanece intacta. O CL eo epitélio adjacente que se estende lateralmente como uma estrutura de "asa-like" serão visíveis.
  3. Removera gema apical do epitélio adjacente, fazendo uma incisão em forma de V de cada lado, e coloque imediatamente em DMEM/F12 frio no gelo.
  4. Repita o procedimento para todos os CLs, recolher em 1,5 ml tubo de microcentrífuga.
  5. Gire para baixo tubo de microcentrífuga com exemplares, ao remover a mídia, substitua por 100 solução desprendimento de células mL.
  6. Incubar os tecidos em solução de desprendimento de células durante 30 min a 37 ° C.
  7. Dissociar os tecidos para produzir uma suspensão única célula cuidado pipetando para cima e para baixo usando um 1000 mL de baixa aderência ponteira. As células também podem ser colocadas através de um coador de células esterilizado para conseguir a dissociação.
  8. Contar as células com um hemocitómetro, na placa de cultura de tecidos de plástico ou outro material desejado.

4. Cultura primária de DESCs

  1. Células da placa em uma placa de 6 poços a 1-6 x 10 4 células / ml em meios DESC, a qual consiste em DMEM/F12 suplementado com proteína recombinante de rato de EGF numa concentração de 20 ng / ml, a proteína recombinante de FGF, a uma concentração de 25 ng / ml, suplemento B27 1X e solução de 1% de antibióticos (penicilina, 100 U / ml, estreptomicina 50 ug / ml).
  2. Cultivar células plaqueadas numa placa de 6 poços, a 37 ° C em 5% de CO 2 em 1 ml de meio de desconto. Não perturbe culturas iniciais, durante 5 dias após o plaqueamento para permitir a adesão celular e formação de colônias.
  3. Pela primeira mudança mídia, substitua metade do volume (500 mL) de velha mídia com metade do volume (500 mL) de novas mídias. Confira as colônias sob o microscópio quando mudar de mídia.
  4. Após a primeira mudança de mídia, continuam a mudar mídia (1-2 ml) a cada 2 dias. Confira as colônias sob o microscópio quando mudar de mídia.

5. DESCs Passage

  1. Mídia Aspirar e lavar as células 3x com pré-aquecido PBS.
  2. Adicionar pré-aquecida de 0,25% de Tripsina-EDTA em solução salina e incubar a 37 ° C durante 10-15 minutos para os DESCs para separar.
  3. Adicionar mídia DESC para neutralizar a tripsina, Pipeta suavemente ao longo do tecido placa de cultura para recolher as células, e coloque em um tubo de 15 ml.
  4. Gire as células a 800 xg por 2 min.

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Representative Results

O mouse hemi-mandíbula é composto por um contínuo crescimento incisivo e três molares enraizadas (Figura 1A). Todos os dentes consistem de dentina e esmalte, as duas componentes mineralizados da coroa do dente (Figuras 1A e 1A '). As casas incisivos dois nichos de células estaminais chamado o CL CL labial e lingual, e esmalte é formada exclusivamente no lado labial (Figura 1A). DESCs são responsáveis ​​pela formação do esmalte dos dentes incisivos e estão alojados no CL labial, especificamente o OEE e SR (Figura 1A'') 8,9. O CL labial também contém o IEE, as células AT, eo SI (Figura 1A''). A nossa técnica é focado sobre a dissecção e isolamento de DESCs do CL labial (Figura 1A''). KRT14-Actina GFP marca todas as células derivadas do epitélio do hemi-mandíbula (Figura 1B), e a CL labial pode ser visto claramente through da mandíbula (Figura 1B ', seta branca). Deve notar-se que todos os tipos de células podem ser identificadas sob uma ampliação maior (comparar as Figuras 1A '' e B'').

O procedimento para o isolamento de DESCs do CL labial é resumido na Figura 2. Resumidamente, o hemi-mandíbula é primeiramente retirado do animal, osso mandibular, é removida para expor o CL labial, e, em seguida, o CL labial é tratado com colagenase para separar o epitélio do mesênquima envolvente. A CL é microdissecado, tratou-se com tampão de dissociação celular, e colocadas em placas de cultura de tecidos. Separação do CL labial do osso do maxilar subjacente (Figura 3) e adição do volume apropriado de suportes são essenciais para o isolamento e o crescimento das colónias, respectivamente. As pequenas colónias epiteliais apertadas formados usando esta técnica são visíveis por 7 dias (Figura 4A),e estes crescem em colónias grandes dentro de 2-3 semanas (Figura 4B).

Figura 1
Figura 1. Ilustrações do incisivo de ratinho adulto. (A) O rato adulto hemi-mandíbula mostrando os componentes mineralizados, esmalte e dentina, e os dois tipos de dentes, os molares e os incisivos. A região proximal incisivo onde os DESCs estão alojados é destaque em A '. (A') corte sagital do incisivo proximal mostrando os dois nichos de células-tronco, o loop cervical labial e lingual (lacL e LiCl), ameloblastos que geram esmalte, e odontoblastos que formam a dentina. O lacL, que gera exclusivamente células progenitoras ameloblastos e, finalmente, formar esmalte incisivo é destaque em A''. (A'') O lacL mostrando o epitélio do esmalte exterior (OEE), retículo estrelado (SR), o epitélio interno do esmalte (IEE), a região de trânsito-amplificador (TA), eo estrato intermediário (SI). O SR é representado em cor de rosa azul e escuro para refletir as subpopulações com diferentes densidades. (B) Visualização da alça cervical usando um mouse repórter fluorescente, KRT14-EGFP/Actb. O osso é relativamente autofluorescente, e remoção do osso expõe a alça cervical (B ') e o resto do epitélio, o que pode então ser facilmente retirado. (B'') Todas as estruturas de o laço do colo do útero, incluindo o OEE, IEE, TA e SI podem ser facilmente visualizados com o gene repórter. Barras de escala B ', B "= 2 mm, B" = 50 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2. Visão geral da dissecção e isolamento da CL do incisivo rato representação. Esquemática do procedimento. A CL é localizado na extremidade proximal do incisivo inferior. O primeiro passo é remover osso maxilar circundante para expor o incisivo com CL intacta. Em seguida, o órgão de dente é isolado e colocado em 2% de colagenase para o epitélio separado do mesênquima. Após 4 horas de incubação, a CL é excisada manualmente, dissociadas em células isoladas, e cultivadas em cima de placas de cultura de tecidos padrão.

Figura 3
Remoção Figura 3. Óssea da mandíbula do rato para expor a região CL subjacente. Checkpoints visual para a remoção de osso do processo de dissecação são mostrados. (A) Mostra a um hemi-mandíbulaepois Passo 1.5, uma vez que o músculo, tendão e ligamento são removidos a partir do osso. (B) indica a área para iniciar a remoção do osso, a partir de apenas abaixo do 3 º molar, movendo proximalmente em relação à região que contém o CL. Em seguida, todos proximal do osso para o CL é removido (C), conforme indicado no passo 2.4. O próximo da incisão para remover o resto do osso tal como indicado no passo 2.5 é mostrado em (D). Finalmente, o CL é removida do osso remanescente, como indicado no Passo 2.6 (E), vista ampliada (inset).

Figura 4
Figura 4. Resultados representativos de formação de colónias in vitro bem sucedida. Microscopia de contraste de fase de A. DESCs, após o plaqueamento em cultura durante 7 dias. Formação de colônias apertado indica isolatio epitelial bem sucedidan sem contaminação mesenquimais. Escala barra = 400 ^ m. B. Após 10 dias de incubação, as colónias são maiores em tamanho e as células têm uma morfologia típica de paralelepípedos epitelial. Barra de escala = 100 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

As células epiteliais foram primeiro cultivadas com sucesso ao longo de 40 anos, 21-24, e, mais recentemente, o isolamento bem sucedido de células estaminais epiteliais 25-27 avançou nosso conhecimento da biologia epitelial. Relata-se um protocolo para isolar o DESCs do incisivo do rato adulto, uma população relativamente pouco estudado de células-tronco que tem o potencial para produzir insights importantes sobre a biologia dental e formação do esmalte. Este protocolo foi inicialmente baseada em relatórios anteriores do isolamento de células-tronco epiteliais do folículo piloso 28. Enquanto muitos protocolos usam camadas de alimentação e soro para manter as células-tronco epiteliais, o nosso método é um sistema livre de soro alimentador livre. No entanto, a meios de crescimento não requer a utilização de um cocktail de EGF, o FGF2 e suplemento B27. EGF tem sido muito utilizado para manter as células indiferenciadas 29. Um coquetel de EGF e FGF2 junto com B27 foi usado anteriormente para cabelo cultura de células-tronco do folículo 27, e B27 é amplamente utilizado para manter as células estaminais neurais em cultura 30,31. Também mediram previamente as características de viabilidade e taxa de crescimento de DESCs em cima de cultura de tecidos de plástico e em uma variedade de substratos da MEC, e não foram detectadas diferenças nas taxas de proliferação 19. As células poderão ser mantidas por até 10 passagens em série 19.

Usamos os incisivos inferiores para este procedimento, devido à facilidade de remoção, em comparação com os incisivos superiores. Os passos mais importantes dentro de nosso protocolo durante o isolamento são a remoção completa da área de CL do osso mandibular, antes de colocar em colagenase e um microdissection limpa do CL. Porque o incisivo proximal é muito delicada, é importante não danificá-lo durante a dissecção, o que poderia resultar na perda do CL labial. A remoção incompleta levará a remanescentes do labialCL e um menor rendimento de DESCs. Além disso, é importante para evitar a contaminação por não-CCélulas epiteliais L. Assim, depois de o epitélio foi separado do mesênquima, uma incisão em forma de V limpa deve ser feito para remover o CL labial do epitélio vizinha. Finalmente, é essencial para a chapa destas células, a uma concentração de mais de 1 x 10 4 culas por ml e deixar metade do meio condicionado para a primeira mudança de meio.

A principal vantagem deste protocolo de pesquisa odontológica é que ele permite a produção e manipulação de DESCs in vitro eficiente. Embora o incisivo rato é estabelecido como um modelo vivo em 7-9,12,32-34, o desenvolvimento de um sistema in vitro avanços no campo da pesquisa dental, abrindo as portas para experiências que são difíceis de executar in vivo. As vantagens deste sistema incluem a capacidade de manipular facilmente as células em diversas condições de cultura, mira fácil de vias de sinalização único, ou mesmo múltiplas, e a inibição ou activação da tamoléculas rgeted utilizando siRNA ou factores de crescimento. Aplicações a jusante deste sistema in vitro incluem a utilização das técnicas acima indicadas, bem como outras técnicas de ponta para realizar estudos funcionais e / ou mecânicas, particularmente ao nível da célula individual.

No geral, as informações recolhidas a partir DESC cultivo in vitro pode ajudar a desvendar os meandros da renovação dente baseado em células-tronco.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse de divulgar.

Acknowledgments

Os autores agradecem Xiu-Ping Wang ajuda inicial com culturas desconto. Os autores são financiados em parte por bolsas de estudo e bolsas de Institutos Nacionais de Saúde (K99-DE022059 a AHJ, K12-GM081266 para MGC, K08-DE022377-02 a OH, e R01-DE021420 para ODK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps, size 5 Fine Science Tools 11251-30 FST by Dumont, Dumoxel
Forceps straight, fine, 3.5 Roboz RS5070
Razorblades Electron Microscopy Services #71960
Scalpel Handle No. 3 VWR
Feather Blade No. 15 Electron Microscopy Services #72044-15 Surgical Stainless Steel
Collagenase Type-1 filtered Worthington Biochemical Corporation #4214
Insulin syringe BD #329424
Accumax EMD Millipore #SCR006
DMEM/F12 Gibco 11320-033
EGF R&D 2028-EG-200
FGF2 R&D 233-FB-025
B27 Supplement Gibco 10889-038

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