Isolering og dyrkning af Dental Epiteliale stamceller fra voksne mus Fortand

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Den stadigt voksende mus fortand indeholder en model for at studere fornyelse af dental væv fra dental epitelial stamceller (DESCs). Et robust system til konsekvent og pålideligt at få disse celler fra fortand og udvide dem in vitro er rapporteret her.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chavez, M. G., Hu, J., Seidel, K., Li, C., Jheon, A., Naveau, A., Horst, O., Klein, O. D. Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor. J. Vis. Exp. (87), e51266, doi:10.3791/51266 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Forståelse af de cellulære og molekylære mekanismer, der ligger til grund for tand regenerering og fornyelse er blevet et emne af stor interesse 1-4, og musen fortand en model for disse processer. Denne bemærkelsesværdige orgel vokser løbende i hele dyrets liv og genererer alle nødvendige celletyper fra aktive puljer af voksne stamceller huse i labial (mod kant) og flersprogede (mod tungen) livmoderhalskræft løkke (CL) regioner. Kun de dentale stamceller fra labial CL giver anledning til ameloblaster som genererer emalje, det ydre dække af tænder på labial overflade. Denne asymmetriske emalje dannelse giver slid på fortand spids, og stamfædre og stamceller i den proksimale fortand sikre, at de dental væv konstant genopfyldes. Evnen til at isolere og dyrke disse progenitor eller stamceller in vitro giver deres ekspansion og åbner dørene til en lang række forsøg, der ikke kan opnås in vivo, såsom hIGH throughput test af potentielle stamceller regulatoriske faktorer. Her beskriver vi, og udviser en pålidelig og konsekvent metode til at dyrke celler fra labial CL musen fortand.

Introduction

Et af de unikke egenskaber hos hvirveldyr er udviklingen af ​​tænder. Tanden er blevet en vigtig model for mange forskningsområder, som de molekylære veje og morfologiske specialer er relevante for dette organ er blevet undersøgt fra flere perspektiver, herunder ved udviklingsmæssige og evolutionære biologer 5. Mere for nylig, har inden for regenerativ medicin begyndt at få værdifuld indsigt ved hjælp af tanden som model. Navnlig har opdagelsen af dentale epitel stamceller været et vigtigt fremskridt 6-13.

Alle gnavere besidder konstant voksende fortænder, hvis vækst er drevet af stamceller, hvilket gør disse tænder et tilgængeligt modelsystem til at studere voksne stamceller regulering. Mærkningsordninger eksperimenter i 1970'erne 10,11, efterfulgt af genetisk afstamning tracing eksperimenter 8,9,12,14, har påvist, at DESCs opholde sig i den proksimale region i fortand. Stilkencelle afkom i epithelial rum på labial side flytte ud af den formodede niche, kendt som labial livmoderhalskræft sløjfe (CL), og bidrage til en population af celler, der kaldes transit-uddybning (TA)-celler (figur 1). Konkret DESCs opholde sig i den ydre emalje epitel (OEE) og stellate reticulum (SR) 8,9,14, og den indvendige emalje epitel (IEE) giver anledning til TA celler, fremskridt gennem et begrænset antal cellecykler og derefter flytte distalt langs længden af fortand (figur 1). De differentierende ameloblasts i musen fortand fortsætter med at bevæge sig distalt langs fortand på en bemærkelsesværdig hastighed på ca 350 um i en enkelt dag 15,16. Som de bevæger sig, cellerne differentiere til modne ameloblasts og stratum intermedium (SI) celler. Efter deponeringen af ​​fulde tykkelse emaljematrix, mange af de ameloblasts undergå apoptose, og de resterende celler skrumpe i størrelse og regulere emalje modning <sup> 17.. Slægt af andre celletyper i læbe CL, som SR, er mindre klar, og data vedrørende stamceller i mesenkymet 18 og i flersprogede CL er kun lige begyndt at dukke op.

Brug musen til fortand model, har en række grupper arbejdet med at belyse de genetiske veje og cellebiologiske processer involveret i naturlig stamcelle-baserede orgel fornyelse. Men den labial CL indeholder et relativt lille antal celler, der anslås at være omkring 5.000 pr mus fortand, hvilket gør arbejdet med primære celler udfordrende. Derfor har man gjort en indsats for kultur og udbygge disse celler in vitro 6,16,19,20 for at åbne nye døre til eksperimentelle metoder, som ikke er opnåelige in vivo. Den seneste undersøgelse har vist, at disse celler kan både selv-forny og differentiere i amelogenin udtrykker celler, når de dyrkes 13. Her beskriver vi, og udviser en fremgangsmåde til the pålidelig og konsistent kultur af celler fra mus labial CL.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Dissekere Lavere Hemi-Kindbakkerne fra Adult Mouse

  1. Forud for udførelse af denne protokol, indhente nødvendige institutionelle godkendelse og være sikker på at overholde alle retningslinjer dyrepleje. Aflive dyr ved anvendelse af standard IACUC godkendte procedurer. For dette arbejde CO 2 kvælning blev anvendt efterfulgt af cervikal dislokation.
    1. EKSTRA: Separat hoved fra resten af ​​kroppen ved hjælp af et barberblad.
  2. Fjern skind fra underlæben til halsudskæringen.
  3. Ved hjælp af en skalpel, lave et snit mellem de to nederste fortænder, der er løst forbundet. Ved påføring af tryk, vil underkæben opdeles i to halvdele.
  4. Kile skalpellen mellem condylus af kæben og den tidsmæssige mandibular fælles og skæres sammen kæbemusklen at løsne kæben.
  5. Fjern alle muskler, sener og ledbånd, indtil der kun knoglen tilbage.

2.. Isoler fortandsstangen

  1. Ved hjælp af en # 15 skalpelForsigtigt barbere knoglen ved en 45 ° vinkel fra den distale ende til den proximale ende af membranøs region. Brug spidsen af ​​skalpellen til at gå væk enhver resterende knogle, herunder knoglerester i kanten. Langsomt begynder at plukke væk på linguale kortikale plade af underkæben, der starter lige under 3. molar.
  2. Fortsæt, indtil Fortand er ren, arbejder omhyggeligt mod feltet indeholder CL.
  3. Fjern ringere alveolær nerve bundt.
  4. Lav et rent snit til først at fjerne knoglen og væv proksimalt til CL.
  5. Lav et andet snit distalt med skalpel, groft under 2. kindtand. Den proximale fortandsregion derefter dissekeret ud ved at indsætte skalpel mellem knoglen og den mediale flade af den proximale fortand. Dette må gøres omhyggeligt for ikke at rive væv. Snittet bevægelse er proximal-distal.
    ALTERNATIV STEP:
    Fjern så meget knogle som muligt langs området over incisor. Når området er ryddet, skal du forsigtigt fjerne hele fortand ved hjælp af en størrelse 5 pincet til at håndtere emalje delen tættest på CL-regionen.
  6. Anbring dissekeret væv (enten isoleret CL i figur 3E, eller hele fortand som alternativt trin 2.5) i 2% collagenase i 1X PBS i 3-4 timer ved 4 ° C i en lav vedhæftning plade. For 1-10 fortænder, bruge 100 ul pr brønd i en 12-brønds plade. For mere end 10 fortænder bruge 500 pi per brønd i en 6-brønds lav vedhæftning plade.

3.. Microdissect den Labial Cervikal Loop

  1. Fjern CL område fra collagenase og sted i koldt DMEM/F12 medier.
  2. Træk forsigtigt ved den nedre ende af CL ved hjælp af enten størrelse 5 pincet eller en insulinsprøjte (1 cc, 28 G ½); mesenchyme vil falde fra hinanden, medens epithelet forbliver intakt. CL og den tilstødende epithel, som strækker sig sideværts som en "vinge-lignende" struktur vil være synlig.
  3. Fjernden apikale knop fra tilstødende epitel ved at lave en V-formet indsnit på hver side, og placer omgående i koldt DMEM/F12 på is.
  4. Gentag for alle CLS samle i 1,5 ml mikrofugerør.
  5. Spin ned mikrofugerøret med prøver, fjerne medier, erstatte med 100 ul celle detachement løsning.
  6. Inkuberes væv i celle løsrivelse opløsning i 30 minutter ved 37 ° C.
  7. Adskille væv til at producere en enkelt celle suspension ved forsigtigt at pipettere op og ned ved hjælp af en 1.000 ul lav friktion pipettespids. Celler kan også placeres gennem et sterilt cellefilter at opnå dissociation.
  8. Tæl celler med hæmocytometer, plade på vævskulturplast eller andet ønsket materiale.

4.. Primær kultur DESCs

  1. Plate celler i en 6-brønds plade ved 1-6 x 10 4 celler / ml i DESC medier, som består af DMEM/F12 suppleret med muse-EGF rekombinant protein ved en koncentration på 20 ng / ml FGF rekombinant protein ved en koncentration på 25 ng / ml 1X B27 supplement og 1% antibiotisk opløsning (penicillin, 100 U / ml streptomycin, 50 ug / ml).
  2. Dyrk celler udpladet på en plade med 6 brønde ved 37 ° C i 5% CO2 i 1 ml DESC medier. Forstyr ikke indledende kulturer til 5 dage efter plating at tillade celle vedhæftning og kolonidannelse.
  3. For det første medie forandring, erstatte halvdelen af ​​den mængde (500 ul) af gamle medier med halv volumen (500 ul) af nye medier. Check kolonier under mikroskop ved skift medier.
  4. Efter det første skift af medium, fortsætte med at ændre medier (1-2 ml) hver 2 dage. Check kolonier under mikroskop ved skift medier.

5. Passage DESCs

  1. Aspirer medier og vaske cellerne 3x med forvarmet PBS.
  2. Tilføj forvarmet 0,25% trypsin-EDTA i saltvandsopløsning og inkuberes ved 37 ° C i 10-15 minutter for DESCs at løsne.
  3. Tilføj DESC medier at neutralisere trypsin, pipettér forsigtigt langs vævsdyrkningsplade at indsamle de celler og sted i en 15 ml konisk rør.
  4. Spin ned cellerne ved 800 xg i 2 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Musen hemi-underkæbe består af et stadigt voksende fortand og tre forankrede kindtænder (figur 1a). Alle tænderne består af dentin og emalje, de to mineraliserede bestanddele af tandkronen (figur 1A og 1A "). Fortandsstangen huse to stamceller nicher kaldet labial CL og flersprogede CL, og emalje udelukkende dannet på labial side (figur 1A). DESCs er ansvarlige for fortand emalje dannelse og er opstaldet i læbe CL, specifikt OEE og SR (figur 1A'') 8,9. Den labial CL indeholder også IEE, TA celler og SI (figur 1A''). Vor teknik er fokuseret på dissektion og isolering af DESCs af labial CL (figur 1A''). Krt14-Actin GFP markerer alle epitelceller-afledte celler i hemi-underkæbe (Figur 1B) og labial CL kan tydeligt ses throUH underkæbe (figur 1B, hvid pil). Det skal bemærkes, at alle celletyper kan identificeres under højere forstørrelse (sammenlign figurerne 1A 'og B'').

Fremgangsmåden til isolering af DESCs fra labial CL er opsummeret i fig. 2. Kort fortalt hemi-underkæben fjernes først fra dyret er mandibulært knogletab fjernet for at blotlægge labial CL og derefter labial CL behandles med kollagenase til adskille epitel fra den omgivende mesenkym. CL er mikrodissekeres, behandlet med celledissociering buffer og udpladet i vævskulturplader. Adskillelse af labial CL fra den underliggende kæbeknoglen (figur 3) og tilsætning af korrekt mængde af medier er afgørende for isolation og væksten af kolonierne, hhv. Små, stramme epitelial dannede kolonier ved hjælp af denne teknik er synlige ved 7 dage (figur 4A),og disse vokse i store kolonier inden for 2-3 uger (figur 4B).

Figur 1
Figur 1.. Illustrationer af den voksne mus fortand. (A) Den voksne mus hemi-underkæbe viser mineraliserede komponenter, emalje og dentin, og de ​​to typer af tænder, kindtænder og fortænder. Den proksimale fortand region, hvor DESCs er opstaldet er fremhævet i A «. (A ') sagittal visning af den proksimale fortand viser de 2 stamcelle nicher, den læbe og flersprogede livmoderhalskræft løkke (LaCl og LiCl) ameloblasts der genererer emalje, og de odontoblasts der danner dentin. Den LaCl, der udelukkende genererer ameloblast stamceller og i sidste ende danner fortand emalje er fremhævet i A''. (A'') Den LaCl viser den ydre emalje epitel (OEE), stellate reticulum (SR), indre emalje epitel (IEE), transit-forstærker (TA) region, og stratum intermedium (SI). SR er repræsenteret i blå og pink for at afspejle de undergrupper med forskellige tætheder. (B) Visualisering af livmoderhalskræft loop ved hjælp af et fluorescerende reporter mus, KRT14-EGFP/Actb. Bone er relativt autofluorescerende og fjernelse af knoglen udsætter livmoderhalskræft loop (B '), og resten af epitel, som derefter kan nemt skåret. (B'') Alle strukturer livmoderhalskræft løkke herunder OEE, IEE, TA og SI let kan visualiseres med reportergenet. Skalapanelerne B ', B "= 2 mm, B" = 50 mM. Klik her for at se en større version af dette tal.

es/ftp_upload/51266/51266fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2. Oversigt over dissektion og isolering af CL musen fortand. Skematisk repræsentation af proceduren. CL er placeret ved den proximale ende af mandibulær fortand. Det første skridt er at fjerne omgivende kæbeknoglen at eksponere fortand med CL intakt. Dernæst tand organ isoleret og anbragt i 2% collagenase særskilt epitel fra mesenkym. Efter 4 timers inkubation CL manuelt udskåret, dissocieret til enkelte celler og dyrket oven standard vævskulturplader.

Figur 3
Fig. 3. Bone fjernelse af muse underkæbe at eksponere den underliggende CL-regionen. Visuelle checkpoints til fjernelse af knogle af dissektion proces er vist. (A) Viser hemi-underkæbe enfter Trin 1.5, når muskler, sener og ledbånd er fjernet fra knoglen. (B) viser det område for at begynde at fjerne ben, begyndende fra lige under den 3. molær bevæge sig proximalt over for regionen indeholdende CL. Dernæst er hele knoglen proksimalt for CL fjernes (C), som nævnt i trin 2.4. Den næste indsnit for at fjerne resten af knoglen som anført i trin 2.5 er vist i (D). Endelig CL fjernes fra den resterende knogle som angivet i trin 2.6 (E), forstørret visning (indsat).

Figur 4
Fig. 4. Repræsentative resultater af vellykket kolonidannelse in vitro. A. fasekontrastmikroskopi af DESCs, efter udpladning i kultur i 7 dage. Tight koloni dannelse indikerer succesfuld epitelial isolation uden mesenchymale forurening. Målestok = 400 um. B. Efter 10 dages inkubation kolonier er større i størrelse og celler har en typisk epitelial brosten morfologi. Skala bar = 100 mM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Epitelceller var først med held dyrket over 40 år siden 21-24, og for nylig har vellykket isolering af epitelceller stamceller 25-27 avancerede vores viden om epitelial biologi. Vi rapporterer en protokol til isolering af DESCs af den voksne mus fortand en relativt understudied population af stamceller, der har potentialet til at give et vigtigt indblik i dental biologi og emalje formation. Denne protokol var oprindeligt baseret på tidligere undersøgelser af epitelial stamceller isolation fra hårsækken 28. Mens mange protokoller anvender feeder lag og serum til at opretholde epitelceller stamceller, vores metode er en feeder-fri, serum gratis system. Men vores vækstmedier kræver anvendelse af en cocktail af EGF, FGF2 og B27 supplement. EGF har længe været brugt til at opretholde udifferentierede celler 29. En cocktail af EGF og FGF2 sammen med B27 tidligere blev anvendt til kultur hårsækken stamceller 27, og B27 er i vid udstrækning anvendes til at opretholde neurale stamceller i kultur 30,31. Vi har også tidligere målt levedygtighed og vækstrate karakteristika DESCs oven vævskulturplast og på en række forskellige ECM substrater, og ingen forskelle blev påvist i satserne for spredning 19. Celler kunne opretholdes i op til 10 serielle passager 19.

Vi bruger de nedre fortænder for denne procedure på grund af den lette fjernelse i forhold til de øverste fortænder. De vigtigste trin i vores protokol under isolation er fuldstændig fjernelse af CL-området fra mandibular ben før anbringelse i collagenase og en ren mikrodissektion af CL. Fordi den proksimale Fortand er meget sart, er det vigtigt ikke at beskadige den under dissektion, hvilket kan resultere i tab af læbe CL. Ufuldstændig fjernelse vil føre til resterne af labialCL og et lavere udbytte af DESCs. Desuden er det vigtigt at undgå kontaminering med ikke-CL epitelceller. Således, efter epithelet er blevet adskilt fra mesenkymet, en ren V-formet indsnit bør gøres for at fjerne labial CL fra tilstødende epitel. Endelig er det vigtigt at pladen disse celler i en koncentration på over 1 x 10 4 celler pr ml og lade halvdelen af de konditionerede medier for første medie forandring.

Den største fordel ved denne protokol til dental forskning er, at det giver mulighed for en effektiv produktion og manipulation af DESCs in vitro. Selvom musen fortand er etableret som en in vivo model 7-9,12,32-34, udvikling af et in vitro system forskud dental forskningsområde ved at åbne dørene til eksperimenter, der er vanskelige at udføre in vivo. Fordelene ved dette system omfatter evnen til let at manipulere celler i forskellige dyrkningsbetingelser, let målretning af enkelt eller endda flere signaleringsveje og inhibering eller aktivering af targeted molekyler ved hjælp af siRNA eller vækstfaktorer. Downstream anvendelser af denne in vitro-system omfatter brug af de ovenfor anførte teknikker samt andre banebrydende teknikker til at foretage funktionelle og / eller mekanistiske undersøgelser, især på enkelt celle niveau.

Samlet set kan oplysninger og erfaringer fra DESC in vitro kultur bidrage til at opklare de snørklede af stamceller baseret tand fornyelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter til at videregive.

Acknowledgments

Forfatterne takker Xiu-Ping Wang til indledende hjælp med DESC kulturer. Forfatterne er finansieret delvist af stipendier og tilskud fra National Institutes of Health (K99-DE022059 til AHJ, K12-GM081266 til MGC, K08-DE022377-02 til OH og R01-DE021420 til ODK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps, size 5 Fine Science Tools 11251-30 FST by Dumont, Dumoxel
Forceps straight, fine, 3.5 Roboz RS5070
Razorblades Electron Microscopy Services #71960
Scalpel Handle No. 3 VWR
Feather Blade No. 15 Electron Microscopy Services #72044-15 Surgical Stainless Steel
Collagenase Type-1 filtered Worthington Biochemical Corporation #4214
Insulin syringe BD #329424
Accumax EMD Millipore #SCR006
DMEM/F12 Gibco 11320-033
EGF R&D 2028-EG-200
FGF2 R&D 233-FB-025
B27 Supplement Gibco 10889-038

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharpe, P. T., Young, C. S. Test-tube teeth. Sci Am. 293, 34-41 (2005).
  2. D'Souza, R. N., Klein, O. D. Unraveling the molecular mechanisms that lead to supernumerary teeth in mice and men: Current concepts and novel approaches. Cells Tissues Organs. 186, 60-69 (2007).
  3. Jernvall, J., Thesleff, I. Tooth shape formation and tooth renewal: evolving with the same signals. Development. 139, 3487-3497 (2012).
  4. Yen, A. H., Yelick, P. C. Dental Tissue Regeneration A Mini-Review. Gerontology. 57, 85-94 (2011).
  5. Jheon, A. H., Seidel, K., Biehs, B., Klein, O. D. From molecules to mastication: the development and evolution of tooth development. WIREs Dev Biol. 2, 165-182 (2013).
  6. Wang, X. P., et al. An integrated gene regulatory network controls stem cell proliferation in teeth. PLoS Biol. 5, (2007).
  7. Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. J Cell Biol. 147, 105-120 (1999).
  8. Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Dev Cell. 23, 317-328 (2012).
  9. Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137, 3753-3761 (2010).
  10. Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. Anat Rec. 183, 523-561 (1975).
  11. Smith, C. E., Warshawsky, H. Quantitative analysis of cell turnover in the enamel organ of the rat incisor. Evidence for ameloblast death immediately after enamel matrix secretion. Anat Rec. 187, 63-98 (1977).
  12. Parsa, S., et al. Signaling by FGFR2b controls the regenerative capacity of adult mouse incisors. Development. 137, 3743-3752 (2010).
  13. Chang, J. Y., et al. Self-renewal and multilineage differentiation of mouse dental epithelial stem cells. Stem Cell Res. 11, 990-1002 (2013).
  14. Biehs, B., et al. Bmi1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nat Cell Biol. 15, 846-852 (2013).
  15. Hwang, W. S., Tonna, E. A. Autoradiographic Analysis of Labeling Indices and Migration Rates of Cellular Component of Mouse Incisors Using Tritiated Thymidine (H3tdr). J Dent Res. 44, 42-53 (1965).
  16. Li, C. Y., et al. E-cadherin regulates the behavior and fate of epithelial stem cells and their progeny in the mouse incisor. Dev Biol. 366, 357-366 (2012).
  17. Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Crit Rev Oral Biol Med. 9, 128-161 (1998).
  18. Lapthanasupkul, P., et al. Ring1a/b polycomb proteins regulate the mesenchymal stem cell niche in continuously growing incisors. Dev Biol. 367, 140-153 (2012).
  19. Chavez, M. G., et al. Characterization of dental epithelial stem cells from the mouse incisor with two-dimensional and three-dimensional platforms. Tissue Eng Part C Methods. 19, 15-24 (2013).
  20. Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
  21. Briggaman, R. A., Abele, D. C., Harris, S. R., Wheeler, C. E. Preparation and characterization of a viable suspension of postembryonic human epidermal cells. J Invest Dermatol. 48, 159-168 (1967).
  22. Fusenig, N. E. Isolation and cultivation of epidermal cells from embryonic mouse skin. Naturwissenschaften. 58, 421 (1971).
  23. Fusenig, N. E., Worst, P. K. Mouse epidermal cell cultures. I. Isolation and cultivation of epidermal cells from adult mouse skin. J Invest Dermatol. 63, 187-193 (1974).
  24. Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
  25. Barrandon, Y., Green, H. Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 2302-2306 (1987).
  26. Blanpain, C., et al. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118, 635-648 (2004).
  27. Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
  28. Nowak, J. A., Fuchs, E. Isolation and culture of epithelial stem cells. Methods Mol Biol. 482, 215-232 (2009).
  29. Rheinwald, J. G., Green, H. Epidermal growth factor and the multiplication of cultured human epidermal keratinocytes. Nature. 265, 421-424 (1977).
  30. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
  31. Lesuisse, C., Martin, L. J. Long-term culture of mouse cortical neurons as a model for neuronal development, aging, and death. J Neurobiol. 51, 9-23 (2002).
  32. Felszeghy, S., Suomalainen, M., Thesleff, I. Notch signalling is required for the survival of epithelial stem cells in the continuously growing mouse incisor. Differentiation. 80, 241-248 (2010).
  33. Fujimori, S., et al. Wnt/beta-catenin signaling in the dental mesenchyme regulates incisor development by regulating Bmp4. Dev Biol. 348, 97-106 (2010).
  34. Klein, O. D., et al. An FGF signaling loop sustains the generation of differentiated progeny from stem cells in mouse incisors. Development. 135, 377-385 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics